CN112813033A

CN112813033A - 一种胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112813033A
Application number: CN202110189352.6A
Authority: CN
Inventors: 赵振林
Original assignee: Shenzhen Ripson Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Ripson Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-20
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明涉及干细胞基因治疗领域，具体涉及一种胰岛素和白介素‑10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法与应用。所述双基因修饰的间充质干细胞为过表达胰岛素和白介素‑10的间充质干细胞，其制备方法包括：（1）构建嵌合胰岛素和白介素‑10双基因的重组质粒表达载体；（2）用所构建的重组质粒转染骨髓间充质干细胞；（3）克隆筛选得到过表达胰岛素和白介素‑10的MSC细胞株。本发明所公开的胰岛素和白介素‑10双基因修饰重编程间充质干细胞具有分泌胰岛素和免疫调节双重功能，移植到实验性糖尿病小鼠体内可恢复胰岛素正常水平并保持血糖稳定。本发明用于胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗。

Description

一种胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及干细胞基因治疗领域，特别涉及一种胰岛素和白介素-10双基因修饰的重编程间充质干细胞及其在糖尿病基因治疗领域的应用

技术背景

糖尿病是一类严重的代谢疾病，严重危害人类健康,尽管皮下注射胰岛素、口服降糖药等可以缓解糖尿病患者的高血糖，但是这些治疗措施只是暂时性的，并不能从根本上彻底治疗糖尿病以及阻止其他并发症的发生。随着人们对糖尿病本质的深层次揭示和现代分子生物学基因工程技术手段的发展，应用基因治疗手段将胰岛素基因直接导入体细胞，替代β细胞功能分泌胰岛素，避免细胞的自身免疫损伤，成为根本上治愈由胰岛素分泌缺乏引起的糖尿病未来发展方向。

胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗策略：胰岛素依赖型糖尿病的主要病理生理特点是胰岛β细胞功能减退和缺失导致体内胰岛素缺乏。其基因治疗策略有两个方面：第一是增补体内分泌胰岛素的细胞，从而增加胰岛素的分泌量；第二是改善或避免破坏β细胞的免疫应答，保护残留等β细胞免受自身免疫反应的损伤。基于上述两个目的，基因治疗的对应策略包括(1)基因增补：指将正常的功能胰岛素基因以一定的基因转移方式导入患者体内，表达出患者体内缺失的胰岛素，重新赋予其正常的血糖调节生理功能；（2）免疫耐受的缺失导致胰岛β细胞受损是胰岛素依赖型糖尿病的病因, 指诱导免疫耐受的免疫调节因子以一定的基因转移方式导入患者体内特定靶细胞，抑制自身免疫对β细胞的损伤，起到保护胰岛细胞的作用。白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）作为重要的抑制性细胞因子，主要由Th2 细胞分泌，能抑制由Th1 分泌的 IL-1β、IL-6、IFN-γ及 TNF-α等细胞因子的合成，减弱这些细胞因子导致的胰岛素分泌抑制、β细胞凋亡和外周胰岛素抵抗，在 T胰岛素依赖型糖尿病的的发生过程中扮演重要作用。

干细胞基因治疗：细胞替代治疗和基因治疗很关键的问题是选择一种能满足要求以及来源容易的种子细胞。间充质干细胞 ( mesenchymalstemcells, MSCs) 是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，具有自我复制能力和多向分化能力，可修复做种组织器官损伤，是干细胞基因治疗的优选种子细胞。作为基因工程种子细胞具有如下优越性: ① MSCs来源广泛, 易于分离培养, 有增殖趋势, 且生命周期长,体内外均能保持多向分化的潜能, 遗传背景相当稳定 ;②离体细胞较易受外源遗传物质转染, 并能长期稳定表达该遗传物质 ;③ MSCs经过转染和一定时间的体外培养后再输回体内仍能成活, 并能迁移到病变部位 ;④MSCs的MHC抗原发育不完全，抗原性弱，移植后不会发生免疫排斥反应。间充质干细胞易于外源基因的转染和表达, 且MSC所携带的外源基因表达具有明显的组织特异性。MSC作为一种新型的基因治疗的载体细胞有着广泛临床应用前景。间充质干细胞成为基因治疗的重要种子细胞之一。

本发明以基因治疗胰岛素依赖型糖尿病为目的，设计构建一种胰岛素(Insulin,INS)和白介素-10(IL-10)双基因修饰的编程间充质干细胞，使这种基因重组间充质干细胞表达胰岛素和免疫调节因子IL-10，从而起到分泌胰岛素和发挥免疫调节的双重作用。

发明内容

针对胰岛素依赖型糖尿病的治疗长期依赖注射胰岛素维持生命，无法从根本上治愈糖尿病的重大技术难题，本发明的目的在于提供一种可以表达胰岛素和白介素-10的双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法，为从根本上治疗糖尿病提供干细胞基因治疗新药物和方法。

其具体技术方案如下。

第一方面：本发明提供了一种胰岛素和白介素-10的双基因修饰重编程间充质干细胞，所述的胰岛素和白介素-10的双基因修饰重编程间充质干细胞为过表达胰岛素和白介素-10的间充质干细胞。

本发明中，上述间充质干细胞为骨髓来源间充质干细胞。

本发明中，目的表达产物为胰岛素和白介素-10，优选地，胰岛素和白介素-10双基因所构成的目的序列采用共表达方式设计，目的序列的结构为Insulin-PolyA-PGK-IL10，如SEQ ID NO：1所示序列。

第二方面：本发明提供了一种胰岛素和白介素-10的双基因修饰重编程间充质干细胞制备方法。优选地，由以下方法制得。

1）构建嵌合胰岛素和白介素-10双基因的重组质粒真核表达载体，重组质粒真核表达载体的结构为pcDNA3.1-CMV-insulin-PolyA-PGK-IL10-BGH。

2）用所构建的胰岛素和白介素-10双基因重组质粒载体转染骨髓间充质干细胞。

3）G418克隆筛选得到过表达胰岛素和白介素-10的MSC细胞株（Insulin/IL-10-rMSC）。

本发明中，嵌合胰岛素和白介素-10双基因的重组质粒载体转染骨髓间充质干细胞后，得到过表达胰岛素和白介素-10蛋白的骨髓间充质干细胞，即为胰岛素和白介素-10双基因修饰的重编程骨髓间充质干细胞。

优选地，嵌合胰岛素和白介素-10双基因的载体为真核表达质粒载体pcDNA3.1。

优选地，***目的片段的表达载体多克隆区的双酶切位点为XhoI和NotI。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的胰岛素和白介素-10 双基因修饰的重编程间充质干细胞高表达胰岛素和白介素-10，具有分泌胰岛素和免疫调节双重功能，将本发明所公开的Insulin/IL-10-rMSC移植到实验性糖尿病小鼠的右肾被膜下，试验糖尿病小鼠的血胰岛素水平恢复并维持正常血糖水平，本发明所提供的Insulin/IL-10-rMSC可作为药物制剂用于胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗。Insulin/IL-10-rMSC可用于制备治疗胰岛素依赖型糖尿病的药物或制剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以下附图是对实施例中所述内容的图解说明，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定：

图1.流程图

图2.重组质粒载体全图谱

图3.原代培养骨髓间充质干细胞

图4.RT-QPCR验证RNA抽提电泳图

图5.转然MSC后目的基因mRNA表达水平

图6.双基因修饰的MSC移植前后血糖变化

图7.双基因修饰的MSC移植前后胰岛素变化

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明的方法进行详细描述和说明，其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。

实施例一：嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒载体构建。

一 . 目的基因的合成与扩增。

1.目的基因设计：采用Insulin-PolyA-PGK-IL10形式，在Insulin和IL-10之间***启动子PGK和终止序列PolyA ，如SEQ ID NO：1所示序列。目的片段大小为1463bp，按照上述设计合成目的片段。

2.设计引物：以所合成的Insulin-PolyA-PGK-IL10目的片段为模板，设计引物，分别在上游引物的5’端***一个XhoI酶切位点 ,在下游引物的5’端***一个NotI酶切位点；

p1(XhoI)：AGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTCTCGAGGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCC

p2(NotI)：CGGGTTTAAACGGGCCCGGATCCAAGCGGCCGCTCAGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTAGGCTTC

将设计好的引物进行合成。

3．扩增目的基因片段。

3.1 将合成的引物稀释成终浓度为10 µmol/L的储藏液。

3.2 利用稀释的引物及Insulin-PolyA-PGK-IL10模板进行PCR扩增。体系如下：

目的基因 1-2 µg

引物1 2 μL

引物2 2 μL

PCR mix 25 μL

ddH2O 补足50 μL

将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入PCR仪内开始PCR扩增，PCR条件：预变性94度，变性98度，2min，变性98度，10s，退火62度，30s，延伸68度，3min，30个循环，最后延伸68度，5min。

3.3 PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因。步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100 mg=100 μL来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的QG buffer置于50 ℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。

3.4 等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。

3.5 将上述液体全部转移到滤柱内，13000 rpm离心30 s。（可重复一次）然后弃掉管内液体，向柱内加入750 μL的PE buffer。离心1 min.。弃掉管内液体，再次空离2 min。换一个新的1.5 mL的EP管，向柱子内加入20 μL的ddH2O，离心1 min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的目的基因片段，并测定浓度。

4 目的基因片段双酶切。

4.1 将回收后的目的基因片段进行双酶切，酶切体系如下：

PCR回收产物 0.7 µg

green Buffer 5 μL

内切酶1 2.5 μL

内切酶2 2 .5 μL

ddH2O 补足50 μL

于37 ℃酶切约5 h或者过夜。

4.2 回收目的片段

将酶切产物进行琼脂糖电泳并回收目的片段。步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg=100μL来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的QG buffer置50℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。（可重复一次）然后弃掉管内液体，向柱内加入750μL的PE buffer。离心1 min 。弃掉管内液体，再次空离2min。换一个新的1 .5mL的EP管，向柱子内加入20 μl的 ddH2O，离心1 min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的酶切产物片段，并测定浓度。

二. 质粒载体的双酶切

操作步骤。

1 将含载体pcDNA3.1质粒的菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5mL提取质粒。具体方法参考QIAGEN质粒小抽说明书。

2 取1 µg新鲜质粒，用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切体系如下：

载体 1 µg

green Buffer 3 μL

XhoI 1.5 μL

NotI 1.5 μL

ddH₂O 补足30 μL

于37 ℃酶切约3 h。

3 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（空载体酶切结果见附图4），电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100 mg=100 μL来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的QGbuffer置于50℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。

4 等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。

5 将上述液体全部转移到滤柱内，13000 rpm离心30 s。（可重复一次）然后弃掉管内液体，向柱内加入750 μL的PE buffer。离心1 min.。弃掉管内液体，再次空离2 min。换一个新的1.5 mL的EP管，向柱子内加入20 μL的ddH2O，离心1 min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。

三．质粒载体与目的片段连接。

1 测定回收载体和目的片段的浓度，并按载体：目的片段=1:7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比。

2 过表达载体与目的片段的连接，连接体系如下：

回收载体 160 ng

目的片段 80 ng

5×CE Entry Buffer 4 μL

Exnase entry 2 μL

ddH2O 补足20 μL

于37℃连接30 min后，立即置于5 ℃冰水浴冷却。

四转化感受态细胞、筛选。

1 将感受态细胞置于冰上（4 oC）待其自然解冻后，取10 μL连接产物加入感受态细胞中于冰上（4 oC）放置30 min。

2 之后于42 oC水浴中热击90 s。然后迅速置于冰上（4 oC）放置2-3 min。

3 加入500 μL不含抗生素的SOC培养基于37 oC，225 rpm振荡培养45 min。

4 3000 rpm离心2 min，弃掉900 μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性（氨苄或卡那等）的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀（涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体），倒置于37 oC恒温培养箱内过夜培养。

5 挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。

6菌液PCR初步鉴定

PCR体系如下：PCR扩增。体系如下：

新鲜菌液 2-3 μL

引物1 2 μL

引物2 2 μL

PCR mix 25 μL

ddH2O 补足50 μL

将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入PCR仪内开始PCR扩增,

PCR条件：预变性94度，变性98度，2min，变性98度，10s，退火62度，30s，延伸68度，3min，30个循环，最后延伸68度，5min。

五质粒DNA提取和酶切鉴定。

1 破菌提取质粒。

2 重组质粒酶切，酶切体系如下：

目的基因 1 μg

green Buffer 5 μL

XhoI 2.5 μL

NotI 2 .5 μL

ddH2O 补足20 μL

于37 ℃酶切约5 h或者过夜。

3 将酶切后目的片段进行PCR扩增，步骤如上所述，只将模板替换成目的基因1-2μg。

4 基因测序。

将初步鉴定为阳性的样品，每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定（见附图2）。经过用重组质粒载体转化感受态细胞，涂板筛选，PCR扩增酶切鉴定后进行测序鉴定，收获高纯度的重组质粒载体，结构为:

pcDNA3.1-CMV-insulin-PolyA-PGK-IL-10-BGH。（见附图2）

实施例二：构建胰岛素、白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞。

一．骨髓MSC分离培养鉴定。

无菌条件下，用含20%FBS 的IMDM 从小鼠股骨和胫骨髓腔中冲洗出骨髓细胞，离心半径10 cm， 1200 r /min 离心5min，弃上清得细胞沉淀。加入20% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg /ml 链霉素的IMDM，接种于150mm 培养皿中，置37 ℃，5%CO2饱和湿度的二氧化碳孵箱内培养，2d后换液，弃掉未贴壁造血细胞，以后每隔3-4 天更换培养基，细胞达80%融合后胰酶消化，1∶3 传代扩增纯化。鉴定第3 代细胞，3-5 代细胞用于转染用（附图3）。

二. 重组质粒转染MSC细胞。

1. 转染前细胞准备：转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到 70-90％。

2. 转染：对于每个转染样品，按如下步骤准备Lipofectamine^®3000-DNA 混和液：

2.1 使用前，取10μL Lipofectamine^®3000 转染试剂轻轻摇匀，用125 μL不含血清的优化培养基（Opti-MEM）稀释，涡旋振荡2-3s充分混合试剂。

2.2 用不含血清的 Opti- MEM (125μL ) 稀释 DNA (4µg)，轻轻混和。

2.3 尽快将（a）稀释好的Lipofectamine^® 3000与上述（b）稀释好的DNA 轻轻混和，室温培养5 min，以形成Lipofectamine^® 3000-DNA混和物。

2.4 将细胞铺在10cm培养皿，无血清培养基中进行转染，转染复合物添加24h后更换为含10%FBS RPMI 1640培养基进行培养。将培养板置于 37 ℃的 CO2 培养箱中孵育48小时。

三. 稳转MSC克隆筛选。

转染细胞生长48 h后，进行传代，更换为选择性培养基(10%胎牛血清并含有600 μg/ml G418)继续培养。间隔2~3 d换液，待2周后大部分细胞已经死亡，继续采用维持剂量筛选 1 周后，残留零星分布的细胞团，已基本得到 G418 抗性MSC细胞的克隆。挑取单个MSC细胞的克隆继续进行筛选扩增，即为 G418 抗性的MSC细胞。筛选出的单克隆细胞扩大培养后取部分细胞检测细胞内胰岛素和IL-10表达水平。收集剩余细胞即为胰岛素与IL-10双基因修饰的重编程间充质干细胞（Insulin/IL10-rMSC）。

实施例3 胰岛素与白介素-10双基因修饰的重编程间充质干细胞的功效验证。

一.RT-qPCR检测胰岛素与白介素-10在靶细胞MSC中的表达水平。

1 实验材料。

1.1细胞：MSC 和Insulin/IL10-rMSC。

1.2试剂

。

1.3 仪器

。

2 检测方法。

2.1 Trizol 法抽提细胞中的总RNA

(1)吸尽细胞培养瓶中的培养基，按照每10平方厘米细胞加入1ml TRIZOL，用移液器上下吹打细胞，使细胞全部溶解，然后将细胞吸至1.5ml离心管

(2)将样品在室温下静置5-15分钟，使核酸蛋白复合物完全分离

(3)每管加入0.2ml氯仿盖上盖子，剧烈摇匀15s，然后室温静置3分钟

(4)4℃12000g离心15分钟，RNA溶解在上层的水层里边，体积大约为50%

(5)将无色层转移到1.5ml的离心管

(6)向其中加入0.5ml异丙醇，室温放置10min（miRNA抽提可延长至2小时）

(7)4℃12000g离心10分钟，移除上清，底部会有白色的RNA

(8)加入无RNA酶的水配制75%的酒精，放在漩涡仪上漩涡20s，然后7500g离心5min，

(9)移除上清，空气中静置5-10min，待底部RNA刚好变无色

(10)加入20ul无RNA酶的水，60℃水浴或者金属浴15min

(11)进行反转录或者放在-70℃保存.

RNA抽提质量跑胶电泳图见附图4。

2.2 cDNA 的合成

在0.2ml的Ep管内，按照TAKARA 反转录试剂盒说明书配制反应液，体系为：

5X primerscript buffer 2 ul primerscript RT Enzyme mix I 0.5 ul OligodT primer (50UM) * 0.5 ul Random 6 mers (100UM) * 0.5 ul total RNA 500ngRnase free H2O up to 10 ul

反转录条件为：37℃ 15min

注：*标记引物为目的基因的反转录引物。

3 Real-qPCR

通过Real-qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量，根据qPCR

反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值(threshold cycle

number．域值循环数)，采用 2-△Ct的方法进行相对定量。使用QIAGEN公

司RT2 Profiler PCR Array Data Analysis ***进行数据分析，比较不同

细胞中基因的相对表达情况。

2^-△ct=2^{-（待测样品的目的基因的ct平均值--待测样本的内参基因的ct的平均值）。}

目的基因的检测用引物序列(5’-3’)：

。

内参基因的检测用引物序列(5’-3’)：

。

3.1PCR体系中各组分的体积如下：

。

3.2PCR反应条件：

3.3 结果显示见胰岛素与白介素-10双基因修饰的MSC高表达胰岛素和IL-10,与空载MSC比较差异显著，P<0.01.见附图5。

二.用胰岛素与白介素-10双基因修饰的MSC治疗小鼠实验性糖尿病验证。

小鼠实验性糖尿病模型制备

CBA小鼠, 26只, 雌雄不限,体质量25 g 左右,SPF 级。用0.1mmol/L 的无菌枸橼酸- 枸橼酸钠缓冲液(pH 4.5)配制质量浓度为20 g/L 的STZ 溶液, 一次性腹腔注射STZ溶液120 mg/kg, 24h 后随机检测血糖。若血糖≥16.7 mmol/L, 且尿糖+++以上稳定5d,则表示制模成功。

2 实验分组及治疗方法:

2.1 Insulin/IL10-rMSC组:（n=10）:经皮穿刺肾被膜下注射1mL细胞悬液（4X10⁷/kg），注射方法用24G套管针穿入肾被膜下，然后用1ml注射器将细胞悬液缓慢注入右肾包膜下。

2.2 MSC对照组（n=6）:肾包膜下注射培养基1mL，注射方法同上。

2.3 皮下注射胰岛素组（n=6），注射剂量为 20 IU/kg/24 h。

3 各项技术指标的观察

3.1 检测MSC移植前和移植后不同时点的血糖，并进行移植前后比较。。

3.2 用放射免疫法测各组处理前后的血清胰岛素浓度。

4 统计学处理

采取 SPSS10.0统计软件处理数据, 定量资料用均数标准差 (x±s) 表示, 用单因素方差分析进行统计, 分析实验因素的作用。

5 结果。

5.1 血糖检测：（见附图6）

	移植前(mmol/L)	移植后48小时(mmol/L)	移植后7天(mmol/L)	移植后30天(mmol/L)
					（组1）MSC-INS/IL10-RH组	19.54±3.16	11.28±2.01<sup>＊</sup>	9.44±2.36<sup>＊</sup>	8.71±2.42<sup>＊</sup>
（组2）MSC组	21.78±4.08	22.48±3.11<sup>*</sup>	22.54±4.01<sup>*</sup>	21.56±4.33<sup>*</sup>
					（组3）INS组	22.18±3.03	10.17±2.22<sup>＊</sup>	9.65±3.02<sup>＊</sup>	8.10±3.12<sup>＊</sup>

＊与移植前比较P<0.01；*与组1对应时点血糖比较P<0.01。

5.2 血清胰岛素浓度（见附图7）

	移植前(pmol/L)	移植后7d (pmol/L)
			（组1）MSC-INS/IL10-RH组	22.13±4.33	40.26±4.02<sup>＊</sup>
（组2）MSC组	20.22±4.79	21.16±4.02<sup>*</sup>
			（组3）INS组	20.51±4.43	44.76±2.49<sup>＊</sup>

＊与移植前比较P<0.01；*与组1对应时点血糖比较P<0.01。

Claims

1.一种胰岛素和白介素-10双基因修饰的重编程间充质干细胞，其特征在于，所述双基因修饰的间充质干细胞为过表达胰岛素和白介素-10的间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞，其制备方法特征在于，包括如下步骤：1）构建嵌合胰岛素和白介素-10双基因重组质粒载体，载体结构为pcDNA3.1-CMV-insulin-PolyA-PGK-IL10-BGH；2）用所构建的重组质粒载体转染骨髓间充质干细胞，得到胰岛素/白介素10双基因修饰重编程间充质干细胞；3）筛选G418抗性MSC细胞克隆，得到过表达胰岛素和白介素-10的MSC细胞株。

3.根据权利要求1或2所述的一种胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法，其特征在于，（1）构建重组表达载体的目的基因为胰岛素和白介素-10，双基因所构成的目的序列采用共表达方式设计，目的序列的结构为Insulin-PolyA-PGK-IL10;(2)表达质粒选择pcDNA3.1，载体双酶切位点为XhoI和NotI；用于转染的间充质干细胞优选用但不限于骨髓间充质干细胞。

4.根据权利要求1和2所述的一种胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法，其功效特征在于移植到实验性糖尿病小鼠体内可恢复胰岛素正常水平并保持血糖稳定在正常范围，本发明的双基因修饰MSC可作为药物制剂用于胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗。

5.申请保护基于权利要求1至2任意一项所述的胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法在制备糖尿病药物中的应用，同时申请保护基于本发明所制得的药物。