CN112813031A - 一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法及其应用，构建方法包括：慢病毒的包装以及纯化，包括HEK 293T细胞准备，转染包装质粒，转染培养后收取细胞培养上清，浓缩病毒液；将得到的浓缩病毒感染细胞，包括药物浓度筛选，慢病毒感染细胞，药物筛选，挑取单克隆进行鉴定。采用稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法，获得小鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系和小鼠胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系，可稳定表达SpCas9蛋白，可作为快速验证工具，用于对设计的SgRNA进行快速的功能验证来检测SgRNA设计是否成功，同时也可以作为功能基因的筛选体系进行后续的大规模功能基因筛选。

Description

一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法及应用，属于细胞生物技术领域。
背景技术
现有的SgRNA验证以及功能基因筛选技术体系中，大都采用单质粒***表达SpCas9蛋白，一般单质粒***为真核表达***，导致在某些原代细胞或者某些低转染效率的细胞系中无法进行有效的SgRNA功能验证以及功能基因筛选。如何能有效表达SpCas9蛋白是亟需要解决的技术问题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法，并提供小鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系和小鼠胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法，其包括如下步骤：
S1、HEK 293T细胞准备：选择来源明确且生长状态良好的HEK 293T细胞，将复苏的细胞用支原体抑制剂处理两代，保证细胞状态；
S2、转染包装质粒：按照阳离子介导的细胞转染方法进行转染，病毒包装质粒的比例为LentiCas9：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1的质量比例转染HEK 293T细胞，转染6～8h之后更换培养基，根据需要构建的细胞系选择合适的培养基换液；
S3、病毒收取：转染36～48h之后可以收取细胞培养上清，用0.45μm滤器过滤去掉细胞碎片，并用Millipore柱子浓缩病毒液，得到纯化后的浓缩慢病毒液；
S4、将需要构建的细胞系的细胞以低密度接种在六孔板种，待贴壁生长之后，设置筛选标记药物Blasticidin浓度梯度加入到六孔板种，加入24h后观察细胞生存状况，选择细胞接近90％死亡时的浓度；
S5、慢病毒感染细胞：复苏需要构建细胞系的细胞，待生长状态良好时，接种细胞在培养皿中，细胞贴壁之后，更换为含有终浓度为8μg/mL聚凝胺(polybrene)的培养基，并加入浓缩病毒液，感染之后换为新鲜正常的培养基；
S6、药物筛选：感染培养一段时间后加入含有步骤S4中选定筛选药物浓度培养基进行筛选，至不会有死细胞出现；
S7、挑取单克隆：经过药物筛选的细胞消化后细胞计数，培养一周后出现肉眼可见的细胞克隆，随后挑取单克隆至96孔板中，扩大培养，后收取细胞样品进行鉴定。
如上所述的构建方法，优选地，在步骤S1中，所述支原体抑制剂处理为Biomyc-3。
如上所述的构建方法，优选地，在步骤S2中，所述阳离子介导的细胞转染方法采用如下步骤：
①转染前接种适宜密度的细胞；
②细胞密度达到70％～90％时进行转染，转染前1h将更换培养基；
③吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入5μg待转染质粒；
④再次吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入2μL VigoFect转染试剂，混匀后室温静置5min；
⑤将第④步稀释的VigoFect逐滴加入到第③步中的质粒中，室温放置15min；
⑥将静置后的混合液均匀滴加到细胞培养基中并混匀；
⑦转染6～8h后更换培养液。
如上所述的构建方法，优选地，在步骤S4中，所述低密度接种为细胞接种贴壁后密度达到30％～40％进行接种；所述Blasticidin浓度梯度为设置的浓度梯度为0、2、4、6、8、10μg/mL；
在步骤S5中，所述感染的时间为6～8h之后换为新鲜正常的培养基；
在步骤S6中，所述感染培养段时间是指培养32～48h，在筛选过程中细胞密度过高时要进行传代处理，保证筛选过程中细胞密度不超过80％；
在步骤S7中，在10cm培养皿中接种3000～5000个细胞。
如上所述的构建方法，优选地，在步骤S8中，所述鉴定为western blotting检测表达的SpCas9蛋白或采用检测SpCas9序列的引物采用PCR检测细胞基因组。
如上所述的构建方法，优选地，所述检测SpCas9序列的引物包括正向引物ATGGACAAGAAGTACAGCATCGG和反向引物GTCGCCTCCCAGCTGAGAC。
如上所述的构建方法，优选地，所述PCR扩增条件为94℃预变性10min；94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸1kb/min，25～30个循环；72℃延伸10min进行检测。
如上所述的构建方法，优选地，需要构建的细胞系为小鼠成肌细胞C2C12细胞或小鼠胚胎干细胞E14细胞。
一种小鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系，优选的，采用如上构建方法对需要构建的细胞系为小鼠成肌细胞C2C12细胞进行构建获得。
一种小鼠胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系，优选的，采用如上构建方法对需要构建的细胞系为小鼠胚胎干细胞E14细胞进行构建获得。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法，获得的细胞系，可稳定表达SpCas9蛋白；对于低转染效率的原代细胞以及部分细胞系提供了验证SgRNA功能以及有效进行功能基因筛选的方法；检测后证明构建的SpCas9蛋白细胞系不会影响E14细胞原有的细胞干性。
本发明提供的一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法，在低转染效率的细胞系C2C12以及E14中构建了稳转表达SpCas9蛋白的细胞系。制备获得的稳转的细胞系相对于瞬时转染的细胞来说，SpCas9蛋白的表达水平在细胞之间没有差异，对于后续的功能基因筛选以及单细胞测序中不会因为细胞间的蛋白表达差异产生假阳性结果。
本发明构建的鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系和小鼠胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系可稳转表达SpCas9蛋白，可作为快速验证工具，用于对设计的SgRNA进行快速的功能验证来检测SgRNA设计是否成功，同时也可以作为功能基因的筛选体系进行后续的大规模功能基因筛选。
附图说明
图1为C2C12-Cas9细胞系的单克隆的western blotting检测结果；
图2为对构建的C2C12-Cas9细胞系用SpCas9的序列引物检测结果；
图3为构建的E14-SpCas9细胞系SpCas9蛋白表达情况；
图4为构建的E14-SpCas9细胞系SpCas9蛋白表达情况；
图5为构建的E14-SpCas9细胞系SpCas9、Nanog、Oct4、Sox2蛋白表达情况；
图6为构建的E14-SpCas9细胞系细胞干性检测结果。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例是小鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建，主要采用慢病毒感染的方式来构建细胞系，使用的慢病毒表达质粒为LentiCas9-Blast，Addgene官网编号为#52962。
首先进行慢病毒的包装以及纯化：
(1)HEK 293T细胞准备：因为慢病毒包装过程对细胞依赖性很强，所以需要选择来源明确且生长状态良好的HEK 293T细胞，将复苏的细胞用支原体抑制剂Biomyc-3(购自Biological Industries公司)；使用方法为在细胞培养过程中按照1：100的比例加入到培养基中。处理两代，保证细胞状态。
(2)转染包装质粒：按照阳离子介导的细胞转染方法进行转染，具体为①转染前接种适宜密度的HEK 293T细胞；
②细胞密度达到70％～90％时进行转染，转染前1h将更换培养基；
③吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入5μg待转染质粒；其中，待转染质粒为按质量比例LentiCas9：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1混合的质粒；
④再次吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入2μL VigoFect转染试剂，混匀后室温静置5min；
⑤将第④步稀释的VigoFect逐滴加入到第③步中的质粒中，室温放置15min；
⑥将静置后的混合液均匀滴加到细胞培养基中并混匀；
⑦转染6～8h后含有10％血清的DMEM培养基。
其中，病毒包装质粒的比例为LentiCas9：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1的质量比例转染HEK 293T细胞，转染6～8h之后更换培养基，根据需要感染的细胞选择合适的培养基换液，需用C2C12细胞用的培养液为含有10％胎牛血清的DMEM培养基。(psPAX2：Addgene官网编号为12260；pMD2.G：Addgene官网编号为12259；LentiCas9-Blast，Addgene官网编号为#52962，LentiCas9质粒为慢病毒骨架，可表达SpCas9蛋白。)
(3)病毒收取：转染36～48h之后可以收取细胞培养上清，用0.45μm滤器过滤去掉细胞碎片，并用Millipore柱子浓缩病毒液，分装之后-80℃长期保存。(0.45μm滤器为PallCorporation公司产品，货号为4612；浓缩柱子为Millipore公司产品，货号为ACS510024)
将得到的浓缩病毒感染细胞：
(1)药物浓度筛选：将C2C12细胞以低密度接种在六孔板种，待贴壁生长之后，设置筛选标记药物Blasticidin按浓度梯度为0、2、4、6、8、10μg/mL浓度梯度加入到六孔板种，加入24h后观察细胞生存状况，选择细胞接近90％死亡时的浓度为4μg/mL Blasticidin。(Blasticidin为Thermo公司产品，货号为461120)
(2)慢病毒感染细胞：复苏需要构建细胞系C2C12细胞，待生长状态良好时，接种细胞接种贴壁后密度达到30％～40％的细胞在6cm培养皿中，细胞贴壁之后，更换为含有终浓度为8μg/mL polybrene的培养基，并加入20μL左右的浓缩病毒液，感染6～8h之后换为新鲜正常的培养基。
(3)药物筛选：感染36h后加入含有选定筛选药物浓度即Blasticidin4μg/mL培养基进行筛选，至不会有死细胞出现。在筛选过程中细胞密度过高时要进行传代处理，保证筛选过程中细胞密度不超过80％。整个细胞系构建过程中实验废弃物都需要高压处理。
(4)挑取单克隆：经过药物筛选的细胞消化后细胞计数，根据细胞生长速度及细胞大小，在10cm培养皿中接种3000～5000个细胞，培养一周后出现肉眼可见的细胞克隆，随后挑取单克隆至96孔板中，扩大培养，后收取细胞样品进行western blotting鉴定。(所用的SpCas9蛋白抗体为Abcam公司产品，货号为ab191468，所用细胞培养皿都是Corning公司产品)
对SpCas9表达质粒进行慢病毒包装后感染C2C12细胞，Blasticidin筛选后挑取单克隆进行验证共有13个克隆可以稳定表达SpCas9蛋白，结果见图1所示，图中GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在western blotting实验中作为实验内参，随后选择细胞系3和细胞系5，分别记为C2C12-Cas9-3和C2C12-Cas9-5。提取C2C12-Cas9-3和C2C12-Cas9-5的基因组，设计SpCas9的序列引物：正向引物的序列为ATGGACAAGAAGTACAGCATCGG，反向引物的序列为GTCGCCTCCCAGCTGAGAC进行PCR，基因组PCR反应体系为：2×HiFi mix 25μL；基因组DNA50ng；上下游引物2μL；ddH2O补齐至50μL。扩增的反应程序：94℃预变性10min；94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸1kb/min，25～30个循环；72℃延伸10min。结果见图2所示，这两个细胞系在与阳性对照LentiCas9-Blast相同的位置出现了条带，说明这个细胞系的基因组上稳定整合了SpCas9蛋白的DNA序列。
实施例2
本实施例是胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建，主要采用慢病毒感染的方式来构建细胞系，使用的慢病毒表达质粒为LentiCas9-Blast，Addgene官网编号为#52962。
首先进行慢病毒的包装以及纯化：
(1)HEK 293T细胞准备：因为慢病毒包装过程对细胞依赖性很强，所以需要选择来源明确且生长状态良好的HEK 293T细胞，将复苏的细胞用支原体抑制剂Biomyc-3，Biological Industries公司产品；使用方法为在细胞培养过程中按照1：100的比例加入到培养基中。处理两代，保证细胞状态。
(2)转染包装质粒：按照阳离子介导的细胞转染方法进行转染，病毒包装质粒的比例为LentiCas9：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1的质量比例转染HEK 293T细胞，转染6～8h之后更换为含有15％胎牛血清的DMEM培养基。(psPAX2：Addgene官网编号为12260；pMD2.G：Addgene官网编号为12259，LentiCas9-Blast，Addgene官网编号为#52962)。
(3)病毒收取：转染36～48h之后可以收取细胞培养上清，用0.45μm滤器过滤去掉细胞碎片，并用Millipore柱子浓缩病毒液，分装之后-80℃长期保存。(0.45μm滤器为PallCorporation公司产品，货号为4612；浓缩柱子为Millipore公司产品，货号为ACS510024)
将得到的浓缩病毒感染细胞：
(1)药物浓度筛选：将E14细胞以低密度接种在六孔板种，待贴壁生长之后，设置筛选标记药物Blasticidin按浓度梯度为0、2、4、6、8、10μg/mL加入到六孔板种，加入24h后观察细胞生存状况，选择细胞接近90％死亡时的浓度为2μg/mLBlasticidin。(Blasticidin为Thermo公司产品，货号为461120)
(2)慢病毒感染细胞：复苏需要构建细胞系E14细胞，待生长状态良好时，接种适合密度的细胞在6cm培养皿中，细胞贴壁之后，更换为含有终浓度为8μg/mL polybrene的培养基，并加入20μL左右的浓缩病毒液，感染6～8h之后换为新鲜正常的培养基。
(3)药物筛选：感染36h后加入含有选定药物浓度培养基(即含有2μg/mLBlasticidin)进行筛选，至不会有死细胞出现。在筛选过程中细胞密度过高时要进行传代处理，保证筛选过程中细胞密度不超过80％。整个细胞系构建过程中实验废弃物都需要高压处理。
(4)挑取单克隆：经过药物筛选的细胞消化后细胞计数，根据细胞生长速度及细胞大小，在10cm培养皿中接种3000～5000个细胞，培养一周后出现肉眼可见的细胞克隆，随后挑取单克隆至96孔板中，扩大培养，后收取细胞样品进行western blotting鉴定。(所用细胞培养皿都是Corning公司产品)
将LentiCas9-Blast质粒进行慢病毒包装，随后将病毒进行纯化浓缩之后检测病毒滴度，并感染野生型小鼠胚胎干细胞E14，杀稻瘟菌素筛选后挑取单克隆，对挑选的单克隆进行western blotting实验检测SpCas9蛋白表达水平，挑取标号为E14-Cas9 Clone1、3、4、5、6、9、16、18的结果如图3所示，发现都可以较好的表达SpCas9蛋白。同时采用实施例1中设计的检测SpCas9序列的引物进行PCR检测，结果显示，E14-Cas9Clone1、3、4、5、6、9、16、18的细胞系在与阳性对照LentiCas9-Blast相同的位置出现了条带，说明这些细胞系的基因组上稳定整合了SpCas9蛋白的DNA序列。
有文献报道SpCas9蛋白的过表达会对胚胎干细胞产生毒性，并且会影响胚胎干细胞的细胞干性，因此我们挑选细胞状态较好的5、6、16、18号克隆(记为E14-SpCas9-5、E14-SpCas9-6、E14-SpCas9-16和E14-SpCas9-18)检测干性因子Sox2、Oct4、Nanog表达情况，用western blotting实验使用抗体检测Sox2、Oct4、Nanog的表达情况，并进行碱性磷酸酶染色以及拟胚体形成实验，来检测胚胎干细胞的干性是否受到影响。碱性磷酸酶染色具体操作如下：(1)细胞接种：在六孔板中接种合适细胞数量的干细胞，保证在接种生长五天后有一个比较低的细胞密度进行染色，对于E14来说一般200～500个。
(2)细胞固定：生长五天后，弃掉培养基，每个孔加入1mL PBS清洗一次，加入1mL4％的多聚甲醛，室温固定1～2min，弃掉固定液。
(3)清洗：加入1mL TBST，静置5min之后弃掉。
(4)细胞染色：按照试剂盒说明，将FRV：Naphthol：water＝2：1：1的比例配制染色液并避光保存，在每个孔种加入1mL染色液，避光染色15min。(所用试剂盒为Millipore公司产品，货号为SCR004)
(5)染色后清洗：弃掉染色液，加入1mL TBST清洗一次，重复两次，加入PBS。
(6)染色结果为具有干性的细胞会被染成***，分化的细胞则不会被染色或者染色颜色很浅。
拟胚体形成实验具体操作为将细胞消化收集进行细胞计数，采用无LIF的E14细胞培养基将细胞稀释到2×107/mL，并将细胞加到低吸附的96孔板中，每个孔100μL，随后放进细胞培养箱中进行培养，并且隔天补充培养基，直到第七天观察EB球并且收集进行检测，以此来检测胚胎干细胞的干性是否受到影响。干细胞中的干性因子例如Sox2、Oct4、Nanog对干细胞细胞干性的维持起到至关重要的作用，检测干性因子的表达情况可以客观的判断干细胞是否发生分化以及干细胞干性是否发生变化。碱性磷酸酶染色是一种公认的可以有效鉴定干细胞干性的实验方法，未分化的干细胞能高表达碱性磷酸酶。碱性磷酸酶在碱性环境下会催化磷酸二酯键，让检测试剂中的底物水解发生颜色反应显色，而已经分化的细胞则不会显色或者颜色较弱。拟胚体实验则是模拟体内胚胎发育的过程，不具有干性的胚胎干细胞是很难培养形成拟胚体的。通过这三个实验可以有效的验证在E14细胞内稳定表达SpCas9蛋白是否会影响E14细胞的细胞干性。
检测构建的E14-SpCas9细胞系细胞干性是否发生变化，western blotting实验检测细胞干性因子Nanog、Oct4以及Sox2的表达情况，结果如图4所示，其中，对于标记为E14-Cas9 Clone5、E14-Cas9 Clone6、E14-Cas9 Clone16、E14-Cas9 Clone18的单克隆，E14-WT表示为野生型的E14细胞结果说明与野生型相比三个干性因子蛋白表达水平没有发生变化；碱性磷酸酶染色实验，结果如图5所示，四个细胞系都可以进行染色，且染色程度较深；拟胚体形成实验，结果如图6所示，说明四个细胞系都可以形成拟胚体，具有完整的干细胞分化功能。(其中，Nanog为BETHYL公司产品，货号为A300-397A；Oct4为Santa Cruz Biotech公司产品，货号为sc-5279；Sox2为Millipore公司产品，货号为AB5603；碱性磷酸酶染色为Millipore公司产品，货号为SCR004)
对四个细胞系的干细胞干性因子表达情况进行检测(图4)，与野生型的E14细胞相比，四个细胞系Nanog、Oct4以及Sox2的蛋白表达水平没有发生变化，且显影曝光时间较短的情况下可以看到四个细胞系的SpCas9蛋白表达水平并不一致。对四个细胞系进行碱性磷酸酶染色(图5)，可以观察到四个细胞系都可以进行染色，且染色程度与野生型的E14细胞没有区别。拟胚体形成实验(图6)也可以观察到在四个细胞系中都有拟胚体的形成。因此可以认为，E14-SpCas9稳转表达细胞系的细胞干性与野生型的E14细胞没有区别，或者严谨的说在短时间内SpCas9蛋白不会影响胚胎干细胞的细胞干性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、HEK 293T细胞准备：选择来源明确且生长状态良好的细胞，将复苏的细胞用支原体抑制剂处理两代，保证细胞状态；
S2、转染包装质粒：按照阳离子介导的细胞转染方法进行转染，病毒包装质粒的比例为LentiCas9：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1的质量比例转染细胞，转染6～8h之后更换培养基，根据需要构建的细胞系选择合适的培养基换液；
S3、病毒收取：转染36～48h之后可以收取细胞培养上清，用0.45μm滤器过滤去掉细胞碎片，并用Millipore柱子浓缩病毒液，得到纯化后的浓缩慢病毒液；
S4、将需要构建的细胞系的细胞以低密度接种在六孔板种，待贴壁生长之后，设置筛选标记药物Blasticidin浓度梯度加入到六孔板种，加入24h后观察细胞生存状况，选择细胞接近90％死亡时的浓度；
S5、慢病毒感染细胞：复苏需要构建细胞系的细胞，待生长状态良好时，接种细胞在培养皿中，细胞贴壁之后，更换为含有终浓度为8μg/mL聚凝胺的培养基，并加入浓缩病毒液，感染之后换为新鲜正常的培养基；
S6、药物筛选：感染培养一段时间后加入含有步骤S4中选定筛选药物浓度培养基进行筛选，至不会有死细胞出现；
S7、挑取单克隆：经过药物筛选的细胞消化后细胞计数，培养一周后出现肉眼可见的细胞克隆，随后挑取单克隆至96孔板中，扩大培养，后收取细胞样品进行鉴定。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S1中，所述支原体抑制剂处理为采用Biomyc-3；
在步骤S2中，所述阳离子介导的细胞转染方法采用如下步骤：
①转染前接种适宜密度的细胞；
②细胞密度达到70％～90％时进行转染，转染前1h将更换培养基；
③吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入5μg待转染质粒；
④再次吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入2μL VigoFect转染试剂，混匀后室温静置5min；
⑤将第④步稀释的VigoFect逐滴加入到第③步中的质粒中，室温放置15min；
⑥将静置后的混合液均匀滴加到细胞培养基中并混匀；
⑦转染6～8h后更换培养液。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，所述低密度接种为细胞接种贴壁后密度达到30％～40％；所述Blasticidin浓度梯度为设置的浓度梯度为0、2、4、6、8、10μg/mL；
在步骤S5中，所述感染的时间为6～8h之后换为新鲜正常的培养基。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S6中，所述感染培养段时间是指培养32～48h，在筛选过程中细胞密度过高时要进行传代处理，保证筛选过程中细胞密度不超过80％；
在步骤S7中，在10cm培养皿中接种3000～5000个细胞。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S8中，所述鉴定为westernblotting检测表达的SpCas9蛋白或采用检测SpCas9序列的引物采用PCR检测细胞基因组。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述检测SpCas9序列的引物包括正向引物ATGGACAAGAAGTACAGCATCGG和反向引物GTCGCCTCCCAGCTGAGAC。
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增条件为94℃预变性10min；94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸1kb/min，25～30个循环；72℃延伸10min进行检测。
8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，需要构建的细胞系为小鼠成肌细胞C2C12细胞或小鼠胚胎干细胞E14细胞。
9.一种小鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系，其特征在于，采用如权利要求1所述的构建方法对需要构建的细胞系为小鼠成肌细胞C2C12细胞进行构建获得。
10.一种小鼠胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系，其特征在于，采用如权利要求1所述的构建方法对需要构建的细胞系为小鼠胚胎干细胞E14细胞进行构建获得。
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