CN112812178B - PCV3 Cap蛋白抗原表位肽、抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
PCV3 Cap蛋白抗原表位肽、抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及PCV3Cap蛋白抗原表位肽、抗PCV3Cap蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供了抗PCV3Cap蛋白单克隆抗体，并进一步提供了单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列，在此基础上，可以通过基因工程方式来制备抗体；同时，能够采用基因工程和蛋白质工程的方法，进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，为进一步提升抗体的特异性和亲和力奠定基础。该抗体具有较高特异性，与PCV1、PCV2及其他猪源病毒如CSFV、PRRSV、PRV等均无交叉反应，在抗原/抗体检测试剂盒、抗原/抗体免疫层析试纸、IFA、IPMA以及Western Blotting等免疫学检测中具有广泛的研究应用价值和商业使用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫技术领域，具体涉及PCV3 Cap蛋白抗原表位肽、抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)，是一种无包膜，共价闭合环状单链DNA病毒，被国际病毒分类学委员会(ICTV)归类为圆环病毒科、圆环病毒属。至今，已有四种基因型的猪圆环病毒被报道，即PCV1，PCV2，PCV3和PCV4。1974年，PCV1被作为猪肾(PK15)细胞系的污染物首次发现，而后的研究普遍认为PCV1对猪群中是非致病性的。PCV2，于1997年被发现，其与许多重大临床综合征相关，这些综合征被统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。PCVAD是一种重要的影响经济的猪疾病。考虑到PCV2造成的巨大经济损失，新报告的PCV3和PCV4可能是养猪业的新挑战。
PCV3与急性猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，生殖衰竭以及心脏和多***炎症等疾病相关。自2016年以来，PCV3已在包括美国在内的许多国家被广泛发现。值得注意的是，在其他哺乳动物中也检测到了PCV3，例如野猪，小鼠，牛，狗等等。此外，还在蜱虫中检测到PCV3，这些动物可能作为PCV3感染和循环的贮存库，这进一步加大了PCV3的传播速度和跨宿主传播的潜在可能性。***发育分析表明PCV3与蝙蝠圆环病毒密切相关，暗示PCV3是一种蝙蝠来源的病毒。PCV3的进化动力学表明，与PCV2相比，PCV3的繁殖数(Re)值和进化速率均相对较高，其变异速度接近于RNA病毒。这些研究表明，PCV3可能具有跨物种传播(CST)的能力和连续爆发的可能性。值得关注的是，最近一项研究报道观察到PCV3向狒狒的传播，这暗示着PCV3不仅可能给养猪业带来沉重负担，也可能进化成可以向人类传播的病毒，并严重威胁人类健康。因此，了解和控制该病毒对全球公共卫生至关重要。
Cap蛋白是PCV的唯一结构蛋白。PCV2 Cap蛋白具有良好的免疫原性，并且被广泛作为PCV2疫苗的候选，像PCV2一样，PCV3 Cap蛋白被认为是主要的诊断靶点和疫苗候选。尽管抗血清可从感染PCV3的猪中获得，但由于非特异性有很高的背景，它们不适用于免疫学检测中。迄今为止，分子诊断方法(例如PCR或实时PCR)被普遍用于检测PCV3。然而，由于缺乏PCV3特异性单克隆抗体，用于检测PCV3的免疫学诊断方法还较少。开发抗PCV3Cap单克隆抗体对免疫学检测方法的建立和PCV3生物学特性的研究必不可少。
目前亟需制备出一种与PCV1、PCV2和其他猪源病毒均无交叉反应且可以同时用于多种免疫检测手段的PCV3单克隆抗体，进而确定其重链可变区序列和轻链可变区序列以改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体，以期进一步提升抗体的特异性和亲和力。
发明内容
本发明的目的在于提供抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性识别PCV3 Cap蛋白的抗原表位肽KHSRYFT。
本发明的第二个目的在于提供PCV3 Cap蛋白抗原表位肽。
本发明的第三个目的在于提供抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的CDR3；所述单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR3。
具体的，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
具体的，所述单克隆抗体重链恒定区为lgG1型，轻链恒定区为Kappa型。
具体的，所述单克隆抗体的效价为1：2.56×105。
具体的，上述抗PCV Cap蛋白单克隆抗体能够特异性识别PCV Cap蛋白，而不与其他猪源病毒反应。
本领域技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，可通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守型变异体或其片段，而仍能保持与PCV3 Cap蛋白特异性结合。
一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体。
具体的，编码抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体重链可变区的基因核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示；编码抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明涉及的抗体核酸分子可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。本领域技术人员显然知晓，在本发明提供的上述核酸分子经一个或多个核苷酸添加、删除、替换、修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和/或轻链可变区核苷酸序列的变异序列，其所编码的氨基酸序列组成的单链抗体或嵌合单克隆抗体或改型单克隆抗体或其他形式的单克隆抗体或抗体片段，仍保留与PCV3 Cap蛋白特异性结合的能力。
一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述核酸分子。
进一步的，所述重组表达载体选自原核或真核表达载体；更进一步的，所述重组表达载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述重组表达载体，或基因组中整合有上述核酸分子。
进一步的，所述表达***为细菌、酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或无细胞表达***。
制备抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：在适当条件下培养上述宿主细胞。
上述抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体在制备猪圆环病毒免疫检测试剂或试剂盒的应用。
具体的，猪圆环病毒免疫检测试剂或试剂盒包括抗原/抗体检测试剂盒、抗原/抗体免疫层析试纸、ELISA、IPMA、IFA、IHC、WB中的任意一种。
本发明取得的有益效果：
本发明提供的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体具有较高特异性，与PCV1、PCV2均无交叉反应，与其他猪源病毒如CSFV、PRRSV、PRV等均无交叉反应，在抗原/抗体检测试剂盒、抗原/抗体免疫层析试纸、IFA、IPMA以及Western Blotting等免疫学检测中具有广泛的研究应用价值和商业使用价值。本发明单克隆抗体识别的线性B细胞表位肽与临床感染的阳性猪血清反应性良好，说明该表位肽可以模拟PCV3天然的表位，刺激机体产生有效的免疫应答。本发明提供了PCV3 Cap蛋白单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列，在此基础上，可以通过基因工程方式来制备抗体；同时，能够采用基因工程和蛋白质工程的方法，进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，为进一步提升抗体的特异性和亲和力奠定基础。
附图说明
图1为pGEX6P-1-Cap重组载体构建后PCR鉴定结果图；
图中，M为DNA分子质量标准；1为Cap蛋白编码区ORF2基因；2为阴性对照。
图2为PCV3 Cap蛋白表达及纯化SDS-PAGE鉴定结果图；
图中，M为蛋白分子质量标准；1为pGEX6P-1-Cap重组表达全菌；2为阴性对照；3为纯化的Cap蛋白。
图3为纯化后Cap蛋白的western-blotting鉴定图；
图中，M为蛋白预染marker；1为纯化的Cap蛋白；抗体选用的是抗GST标签抗体。
图4为ELISA对免疫小鼠血清效价测定统计图；
图5为ELISA对单抗效价测定图；
图中，Cap指的是Cap蛋白作为包被原的检测结果；GST指的是GST标签蛋白作为包被原的检测结果。
图6为单抗的Western-blotting鉴定；
图中，1为PCV3 Cap蛋白；2为GST标签蛋白；3为PCV1 Cap蛋白；4为PCV2 Cap蛋白。
图7为IFA鉴定单抗的特异性；
图中，A为pcDNA3.1-Cap瞬转293T细胞表达的PCV3 Cap蛋白；B为CSFV、C为PRRSV；D为PRV；
图8为IFA检测方法的建立；
图中，A为pcDNA3.1-Cap瞬转293T细胞表达的PCV3 Cap蛋白；B为pcDNA3.1空载对照。
图9为IPMA检测方法的建立。
图中，A为pcDNA3.1-Cap瞬转293T细胞表达的PCV3 Cap蛋白；B为pcDNA3.1空载对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1免疫原的选择和制备
1.免疫原的选择
发明人长期、大量研究、实践、试验发现：首先，在PCV3基因组所编码的蛋白中，由ORF2编码的衣壳蛋白即Cap蛋白是一种高免疫原性蛋白；其次，在机体中由Cap蛋白激发的免疫反应性远远高于其他蛋白，从而容易获得高亲和力的单抗；再次，Cap蛋白是PCV3唯一的结构蛋白，是PCV3免疫学检测方法研究和疫苗开发的首选靶标。
2.免疫原的制备
(1)构建表达Cap蛋白的pGEX6P-1-Cap重组载体，用PCR和测序来鉴定重组载体是否构建成功(鉴定结果如图1所示)；
(2)将成功构建的重组表达载体pGEX6P-1-Cap经化学转化转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，并挑取阳性克隆；
(3)将阳性菌株接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，当菌液达到OD值为0.6-0.8时，加入IPTG，使终浓度为1mM，16℃低温诱导表达10小时；
(4)收集样品进行超声破碎并用GST亲和层析试剂盒进行纯化；
(5)将纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot检测。结果如图2-3所示。
实施例2阳性杂交瘤细胞株的筛选及鉴定
1.动物免疫
(1)将免疫原Cap蛋白加入弗氏完全佐剂进行首次免疫；
(2)通过背部皮下多点注射的方法，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠6只，免疫剂量25μg/只；
(3)每隔3周用弗氏不完全佐剂与免疫抗原乳化后以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫；
(4)三次加强免疫后，于细胞融合前3～4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是50μg/只；
(5)多抗血清效价和敏感性测定：
最后一次加强免疫后一周，分别对6只小鼠进行剪尾采血，然后通过间接ELISA法分别对6只小鼠多抗血清的效价测定。结果显示1号鼠的免疫效果最好，效价是1：12800，选择1号鼠作为脾供体进行细胞融合(图4)。
ELISA测效价：
(1)用包被液稀释纯化的原核表达的猪圆环病毒3型Cap蛋白至1μg/mL，每孔加入50μl包被液，37℃孵育2h，弃包被液，用PBST洗涤3次；
(2)用300μl封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于4℃过夜封闭；
(3)每孔加入用稀释缓冲液(PBST)以2倍倍比稀释的待检血清各50μl(初始稀释倍数为1：400)，于37℃孵育1h后，弃上清液，用PBST洗涤6次；
(4)向每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各50μl，37℃保温0.5h后弃上清，用PBST洗涤液洗涤6次；
(5)向凹孔中加入50μl DAB显色液，室温避光作用20min后加2M H2SO4 50μl终止液终止反应，并用酶标仪测定OD450值。
2.细胞融合及单克隆抗体制备
(1)采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选；
(2)分装在铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，置37℃、5％CO2培养箱内培养，于融合后第五天每孔补加HAT培养基50μl，12天后，通过间接ELISA法对杂交瘤细胞进行初筛，并通过IFA对筛选到的阳性克隆进行验证；
(3)通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3～4次亚克隆筛选，最终获得了1株能稳定分泌抗Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3.稳定性鉴定
将所建立的单克隆杂交瘤细胞株连续培养3个月并反复液氮冻存复苏，从而鉴定杂交瘤细胞的稳定性。结果显示单克隆杂交瘤细胞株稳定性良好。
实施例3单抗腹水的制备、纯化及鉴定
1.体内诱生腹水法制备单抗
选择经产的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化。
2.抗体的纯化
饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，操作方法如下：
1).取5ml单抗腹水,加入5ml PBS缓冲液，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.5ml,使成为终浓度为20％的硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混匀后，静置30min。
2).8000r/min，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3).在上清液中加入12.5ml饱和硫酸铵溶液，充分混匀，静置30min。
4).8000r/min，离心20min，弃去上清。
5).于沉淀中加入10ml PBS缓冲液,使之溶解，再加入5ml饱和硫酸铵溶液,使之成为33％硫酸铵溶液，充分混匀后，静置30min。
6).8000r/min，离心20min，弃去上清，以除去白蛋白。
7).重复步骤5，2～3次。
8).用5ml PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋，4℃下用PBS缓冲液透析。
9).8000r/min，离心20min，弃沉淀，上清即为纯化抗体，测抗体浓度，分装后，-20℃保存。
3.纯化后单抗腹水的鉴定
(1)间接ELISA测定单抗效价，间接ELISA测定方法参照实施例2，同时设置GST标签作为对照包被原，结果如图5所示，纯化后单抗上清效价均达到1：2.56×105；，GST标签基本上不发生反应。
(2)亚型鉴定：用亚型鉴定试剂盒(Sigma，Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit)对单抗的亚型进行鉴定，鉴定结果显示1G4单克隆抗体重链型为：lgG1，轻链型为：Kappa型。
(3)单抗的Western-blotting及IFA鉴定
分别将原核表达纯化获得是PCV1 Cap蛋白、PCV2 Cap、PCV3Cap蛋白及GST标签蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至NC膜，用筛选到的单抗进行Western-blotting鉴定，结果发现，单抗具有较高特异性，与PCV1、PCV2和GST标签蛋白均无交叉反应(图6)；用筛选到的单抗分别与PCV3 Cap(pcDNA3.1-Cap瞬转293T细胞)以及PK15细胞培养的CSFV、PRRSV、PRV进行IFA检测，结果发现，筛选到的单抗与其他猪源病毒如CSFV、PRRSV、PRV等均无交叉反应(图7)。
实施例4单抗的应用
(1)间接免疫荧光试验(IFA)检测PCV3病毒或PCV3 Cap蛋白操作过程：
HEK293T细胞铺于96孔细胞板，待细胞汇合度长至70％左右时，用带有天然PCV3Cap蛋白表达盒的质粒pcDNA3.1-Cap的进行转染。于转染后24h，每孔加入50μl预冷的含有1％的双氧水的甲醇固定液，室温静置10～15min；弃去固定液，PBST洗3次；每孔加入300μL用PBST溶解的5％脱脂奶，4℃封闭过夜；弃去封闭液，加入单抗作为一抗，37℃，30min；弃去一抗，PBST洗3～5次，拍干；加入FITC-标记的羊抗鼠IgG，37℃，30min；弃去二抗，PBST洗3次，拍干；加入DAPI，室温作用10min；弃去DAPI，PBST洗3次后，于荧光显微镜下观察结果，结果如图8示，显绿色荧光说明待检样品中含有PCV3病毒或PCV3 Cap蛋白，不显色说明待检样品中不含PCV3病毒或PCV3 Cap蛋白。
(2)IPMA操作过程：
HEK293T细胞铺于96孔细胞板，待细胞汇合度长至70％左右时，用带有天然PCV3Cap蛋白表达盒的质粒pcDNA3.1-Cap的进行转染。于转染后24h，每孔加入50μl预冷的含有1％的双氧水的甲醇固定液，室温静置10～15min；弃去固定液，PBST洗3次；每孔加入300μL用PBST溶解的5％脱脂奶，4℃封闭过夜；弃去封闭液，加入单抗作为一抗，37℃，30min；弃去一抗，PBST洗3～5次，拍干；加入HRP-标记的羊抗鼠IgG，37℃，30min；弃去二抗，PBST洗3次，拍干；加入DAE显色液，室温作用10min；弃去显色液，PBST洗3次后，于荧光显微镜下观察结果。结果如图9所示，显红色说明待检样品中含有PCV3病毒或PCV3 Cap蛋白，不显色说明待检样品中不含PCV3病毒或PCV3 Cap蛋白。
上述试验结果表明，本发明提供的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体能够用于制备猪圆环病毒免疫检测试剂或试剂盒。
实施例5抗PCV3单克隆抗体可变区基因的扩增及其应用
1.可变区基因的扩增
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’
P2：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3’
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’
P4：5’-CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3’
通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体的可变区序列，送上海生工生物有限公司测序。测定单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11所示，由其推导的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ IDNO.8、SEQ IDNO.9所示。进一步分析得到单克隆抗体重链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；单克隆抗体的轻链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。
<110> 河南中泽生物工程有限公司
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<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 重链可变区CDR3
<400> 3
Asn Ala Glu Gly Met Ile Thr Thr Glu Lys Tyr Met Thr Thr His
1 5 10 15
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区CDR1
<400> 4
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区CDR2
<400> 5
Trp Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区CDR3
<400> 6
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Cys Thr
1 5
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 重链可变区
<400> 7
Phe Glu Val Gln Ala Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp
20 25 30
Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ile Glu Tyr Ala Pro Lys
50 55 60
Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Glu Gly Met Ile Thr Thr Glu Lys Tyr Met Thr Thr His
100 105 110
<210> 8
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区
<400> 8
Leu Leu Val Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
20 25 30
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
35 40 45
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
50 55 60
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly
85 90 95
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 重链可变区
<400> 9
tttgaggtgc aggctcagca gtctggggca gagcttgtga ggtcaggggc ctcagtcaag 60
ttgtcctgca cagcttctgg cttcaacatt aaagactact atatacactg ggtgaagcag 120
aggcctgaac agggcctgga gtggattgga tggattgatc ctgagaatgg tgatattgaa 180
tatgccccga agttccaggg caaggccacc atgactgcag acacctcctc caacacagcc 240
tacctgcagc tcagcagcct gacatctgag gacactgccg tctattattg taatgcagag 300
ggaatgatta cgacggagaa gtatatgact actcat 336
<210> 10
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区
<400> 10
ctgctagtag ttggagagaa ggttactatg agctgcaagt ccagtcagag ccttttatat 60
agcagcaatc aaaagaacta cttggcctgg taccagcaga aaccagggca gtctcctaaa 120
ctgctgattt actgggcatc cactagggaa tctggggtcc ctgatcgctt cacaggcagt 180
ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtgtga aggctgaaga cctggcagtt 240
tattactgtc agcaatatca tagctatccg tgcacgttcg gaggggggac caagctggaa 300
ataaaacgg 309
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> PCV3 Cap蛋白抗原表位肽
<400> 11
Lys His Ser Arg Tyr Phe Thr
1 5
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 重链可变区引物P1
<400> 12
aggtsmarct gcagsagtcw gg 22
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 重链可变区引物P2
<400> 13
tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc cc 32
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区引物P3
<400> 14
gacattgagc tcacccagtc tcca 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区引物P4
<400> 15
ccgttttatt tccagcttgg tccc 24
Claims (10)
1.抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR3；所述单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO.8所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链恒定区为lgG1型，轻链恒定区为Kappa型。
4.根据权利要求1或2所述的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的效价为1：2.56×105。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，编码抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体重链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；编码抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求5或6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求7所述的重组表达载体，或基因组中整合有如权利要求5或6所述的核酸分子。
9.制备如权利要1或2所述的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在适当条件下培养如权利要求8所述的宿主细胞。
10.如权利要求1或2所述的抗PCV3 Cap蛋白单克隆抗体在制备猪圆环病毒免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
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| 猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫组化试验中的初步应用;赵冬等;《中国预防兽医学报》;20190215;第41卷(第2期);第174-178页 * |
| 猪圆环病毒3型回顾性调查与cap蛋白单克隆抗体的研制;赵冬;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》;20190115(第12期);全文 * |
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