具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明中的一部分实施例,而不是全部的实施例。
本发明所涉及的化学试剂均为国产试剂。
实施例1 AP-2alpha蛋白的制备
将密码子优化后的AP-2alpha蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1 所示)克隆到真核表达载体(如)中,
以密码子优化的AP-2alpha蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1所示)为模板,分别用EcoRI和XhoI双酶切位点进行连接以构建 pFuse-AP-2alpha-6His表达质粒。将鉴定为阳性的重组质粒送到华大生物公司进行序列测定,用软件对测定的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析比对,检查阅读框架的正确性。
将鉴定正确的pFuse-AP-2alpha-6His表达质粒瞬时转染293T细胞,72小时后收获细胞培养上清,用镍柱(GE医疗)亲和纯化分泌表达的AP-2alpha-6His蛋白; BCA试剂盒(碧云天)测定浓度,并用SDS-PAGE测定纯度。经测定,其表达产量能达到200mg/L,且SDS-PAGE纯度(如图1所示)>95%。测定后的蛋白分装冻存于-80℃备用。其中,表达的AP-2alpha蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2抗AP-2alpha单克隆抗体的制备
用AP-2alpha蛋白,免疫8周龄的BALB/c小鼠,首次免疫时,AP-2alpha 蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化,腹腔接种小鼠,50μg蛋白/只;7天后AP-2alpha 蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化,第二次腹腔接种途径免疫小鼠,50μg蛋白/ 只;7天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫AP-2alpha蛋白,50μg/只;免疫后的第 3天,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,HAT选择性培养基培;10 天后以AP-2alpha蛋白为包被抗原,间接ELISA检测细胞上清,筛选阳性杂交瘤细胞,从中筛选到4D7株细胞株。
取8~10周龄Balb/c小鼠,腹腔注射降植烷,每只0.5mL,7~10日后每只小鼠注射杂交瘤细胞(4D7株)1×106~2×106个,7~10日后,抽取小鼠腹水,在2~8℃下,以1200r/min离心10分钟,收集上清液。使用ProteinG亲和层析柱纯化单克隆抗体,将抗体分别分装成0.5mL/管,-20℃保存备用。
接下来,我们委托南京金斯瑞公司对来单克隆抗体进行分型检测和所识别的抗原表位进行检测,结果显示,本发明所述的抗AP-2alpha蛋白的单克隆抗体的 IgG1亚型,其结合的抗原表位位于AP-2alpha蛋白的aa55-aa68位(氨基酸序列具体为LSHTPNADFQPPYF)。
实施例3抗AP-2alpha单克隆抗体与博来霉素的偶联
用SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)为连接剂,抗 AP-2alpha单克隆抗体与SPDP的克分子比为1:12,博来霉素与SPDP的克分子比为1:1,将巯基化的抗体与巯基化的博来霉素混合后加入DTT(二硫苏糖醇),通过SephadexG 25柱层析收集偶联物部分,用BCA方法检测蛋白含量,并保存于-80℃备用。利用紫外-可见分光光度法和质谱法检测偶联物,通过测定,偶联物中抗体与博来霉素的摩尔比为1:3~6。
实施例4抗AP-2alpha单克隆抗体与博来霉素联合用药在***中的应用
具体方法参见CN 111647067 A专利,详述如下:
从液氮罐中取出人***SiHa细胞,迅速经37℃水浴后加入RPMI-1640 培养液吹打混匀,1000r/min离心5min,弃上清液,加入适量含10%牛血清的 RPMI-1640培养液,吹打成细胞悬液,置于37℃、5%CO2培养箱内培养。观察细胞生长情况,待细胞长至80%时,用胰酶消化传代或备用。
BALB/c裸小鼠适应性生长1周后,取对数生长期的SiHa细胞,用胰酶消化后,用PBS分别配制成1×107/mL浓度的单细胞悬液,在无菌条件下皮下注射接种于裸小鼠背侧近右腋窝处,每只0.2mL。在皮下接种SiHa的第6天,挑取肿瘤直径≥5mm的鼠48只,按照完全随机化分组的方法将小鼠分为6组,分别为空白对照组(A组)、AP-2alpha单抗组(B组)、AP-2alpha单抗+索拉非尼(C组)、 AP-2alpha单抗+博来霉素偶联组(D组)、AP-2alpha单抗+博来霉素组(E组)、博来霉素(F组),用药均采用腹腔注射,用药24d后,处死小鼠,计算抑瘤率,具体用药量以及结果如下表所示。
与空白对照组相比,*P<0.05;**P<0.01;与B组相比,#P<0.05。
结果显示在药物腹腔注射开始至最后,小鼠体重开始缓慢持续增加,各组小鼠趋势基本一致。D组小鼠抑瘤率为93.63%,抑瘤率最高,且比不偶联(E组) 的效果要好。这说明本发明的单抗可以和化药博来霉素进行联合用药,具有较好的抑制效果,具有有效促进肿瘤细胞凋亡的效果,且偶联后使用效果更佳,为临床治疗提供了依据。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 陈卫国
<120> AP-2alpha抗体及其在制备***药物中的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagatgt tgtggaaact gacagacaac ataaagtacg aggattgtga ggaccgacac 60
gatggcacca gtaatggcac tgcgcgcctg ccccagctgg ggacagtggg ccagagtccg 120
tacacaagcg ccccaccgct cagccatacc ccaaacgcag acttccaacc accctacttc 180
ccaccccctt atcagcctat ttacccccag agccaggatc cctacagtca cgtgaatgat 240
ccctactctc tgaacccact gcatgcccaa cctcaacccc agcacccagg gtggcctggc 300
cagcggcaga gccaggaatc aggactgctt catacccacc gagggttgcc ccatcaactg 360
tcaggccttg acccacgacg cgactacaga agacatgagg acctgctgca tggtccccac 420
gccctcagct ccggcctggg ggacctgtcc atccatagtt tgccgcacgc gattgaggaa 480
gttccccatg tcgaggatcc cggtatcaac attcctgacc agactgtgat aaagaaaggt 540
ccagtgtccc tcagtaagtc caattccaat gcggtttctg ccattccaat taataaggac 600
aacttgttcg ggggggtggt gaatccaaat gaggtctttt gttccgtgcc agggagactg 660
tcccttttgt cctcaaccag caaatacaag gtgaccgtgg ccgaagtgca gcggcggctc 720
tctccacccg aatgcttgaa cgcctcattg ctggggggag tcctgaggag ggccaagtcc 780
aaaaacgggg ggagaagcct gagggagaaa cttgacaaaa ttggtctgaa cctccccgct 840
ggacggagga aagcggctaa tgtgactctg ctgaccagcc tggtggaagg cgaagcggtg 900
cacctggcca gggattttgg ttacgtttgt gaaactgaat tccccgccaa ggccgtggcc 960
gagtttctga accgccagca ctctgatcca aatgagcaag tgactcgaaa aaacatgttg 1020
ttggccacca agcagatctg caaagaattt accgatctcc tggctcagga tcggtctccc 1080
ctgggcaatt caagaccaaa tccaatcctc gagcctggga tccagtcctg cctgacacac 1140
tttaatctga taagtcacgg ctttggctca cctgcagttt gcgctgccgt tacagctctg 1200
cagaattatt tgaccgaagc ccttaaagca atggataaga tgtacctgtc taataacccc 1260
aacagccata ctgacaataa cgccaagagc tcagacaagg aagaaaaaca cagaaaa 1317
<210> 2
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Met Leu Trp Lys Leu Thr Asp Asn Ile Lys Tyr Glu Asp Cys
1 5 10 15
Glu Asp Arg His Asp Gly Thr Ser Asn Gly Thr Ala Arg Leu Pro Gln
20 25 30
Leu Gly Thr Val Gly Gln Ser Pro Tyr Thr Ser Ala Pro Pro Leu Ser
35 40 45
His Thr Pro Asn Ala Asp Phe Gln Pro Pro Tyr Phe Pro Pro Pro Tyr
50 55 60
Gln Pro Ile Tyr Pro Gln Ser Gln Asp Pro Tyr Ser His Val Asn Asp
65 70 75 80
Pro Tyr Ser Leu Asn Pro Leu His Ala Gln Pro Gln Pro Gln His Pro
85 90 95
Gly Trp Pro Gly Gln Arg Gln Ser Gln Glu Ser Gly Leu Leu His Thr
100 105 110
His Arg Gly Leu Pro His Gln Leu Ser Gly Leu Asp Pro Arg Arg Asp
115 120 125
Tyr Arg Arg His Glu Asp Leu Leu His Gly Pro His Ala Leu Ser Ser
130 135 140
Gly Leu Gly Asp Leu Ser Ile His Ser Leu Pro His Ala Ile Glu Glu
145 150 155 160
Val Pro His Val Glu Asp Pro Gly Ile Asn Ile Pro Asp Gln Thr Val
165 170 175
Ile Lys Lys Gly Pro Val Ser Leu Ser Lys Ser Asn Ser Asn Ala Val
180 185 190
Ser Ala Ile Pro Ile Asn Lys Asp Asn Leu Phe Gly Gly Val Val Asn
195 200 205
Pro Asn Glu Val Phe Cys Ser Val Pro Gly Arg Leu Ser Leu Leu Ser
210 215 220
Ser Thr Ser Lys Tyr Lys Val Thr Val Ala Glu Val Gln Arg Arg Leu
225 230 235 240
Ser Pro Pro Glu Cys Leu Asn Ala Ser Leu Leu Gly Gly Val Leu Arg
245 250 255
Arg Ala Lys Ser Lys Asn Gly Gly Arg Ser Leu Arg Glu Lys Leu Asp
260 265 270
Lys Ile Gly Leu Asn Leu Pro Ala Gly Arg Arg Lys Ala Ala Asn Val
275 280 285
Thr Leu Leu Thr Ser Leu Val Glu Gly Glu Ala Val His Leu Ala Arg
290 295 300
Asp Phe Gly Tyr Val Cys Glu Thr Glu Phe Pro Ala Lys Ala Val Ala
305 310 315 320
Glu Phe Leu Asn Arg Gln His Ser Asp Pro Asn Glu Gln Val Thr Arg
325 330 335
Lys Asn Met Leu Leu Ala Thr Lys Gln Ile Cys Lys Glu Phe Thr Asp
340 345 350
Leu Leu Ala Gln Asp Arg Ser Pro Leu Gly Asn Ser Arg Pro Asn Pro
355 360 365
Ile Leu Glu Pro Gly Ile Gln Ser Cys Leu Thr His Phe Asn Leu Ile
370 375 380
Ser His Gly Phe Gly Ser Pro Ala Val Cys Ala Ala Val Thr Ala Leu
385 390 395 400
Gln Asn Tyr Leu Thr Glu Ala Leu Lys Ala Met Asp Lys Met Tyr Leu
405 410 415
Ser Asn Asn Pro Asn Ser His Thr Asp Asn Asn Ala Lys Ser Ser Asp
420 425 430
Lys Glu Glu Lys His Arg Lys
435