CN112791089B - 一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法 - Google Patents
一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法，其将实验小鼠随机分为6组，在对实验小鼠构建衰老模型的过程中，并进行给药，然后采用Morris水迷宫实验对小鼠衰老情况进行实验考察。本发明的实验方法可对鞣花酸及鞣花酸联合自噬抑制剂从记忆力、脱毛(毛发)等指标，来就其对衰老方面的影响进行有效的考察，可对鞣花酸及鞣花酸联合自噬抑制剂的抗衰老的药物的研发提供实验支持与验证。
Description
技术领域
本发明涉及实验技术领域，尤其涉及一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法。
背景技术
衰老是自然界的一切个体由遗传因素和内外环境相互影响下的生物学过程，其不可逆转，但是可以进行干预延缓衰老。目前关于衰老机制的研究有多种学说，自噬在衰老进程中发挥着重要作用。自噬是细胞维持自我稳态，清除有害物质(错误折叠蛋白聚集体，病原体，衰老细胞器)的一种稳态机制，可再生有利的物质以供细胞循环利用。在以往的研究中，自噬被证明参与衰老相关疾病的发病机制，提高机体自噬水平可减少Aβ1-42沉积,起到延缓或改善认知功能障碍作用。但是近几年也有研究发现在脑中动脉阻塞再灌注的大鼠海马C1区神经元大量死亡与自噬过度激活有关。可见自噬具有双重作用。
鞣花酸(Ellagic acid，EA)作为一种天然多酚二内酯广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中。现代药理学研究表明鞣花酸具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌等功效。目前关于EA体内清除氧自由基的研究较多，但其在D-半乳糖引起衰老以及联合自噬抑制剂在抗衰老作用的研究尚未见详细报道。
因此，本发明提供一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法，以为抗衰老药物研发提供科学依据。
发明内容
因此，本发明提供一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法，旨在研究鞣花酸及鞣花酸联合自噬抑制剂在抗衰老方面的作用，以为抗衰老药物研发提供科学依据。
本发明的技术方案为：
一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法，其实验步骤为：
S1：随机选取若干只小鼠，随机分成6组，分别为空白对照组、衰老组、阳性对照组、鞣花酸(EA)组、自噬抑制剂组、联合用药组；
S2：采用D-半乳糖致亚急性衰老法，将除了空白对照组的外小鼠每日颈背部皮下注射5％D-半乳糖溶液，连续注射42天，构建衰老动物模型，在同时，对阳性对照组、鞣花酸(EA)组、自噬抑制剂组、联合用药组的小鼠给药，空白对照组则进行灌胃，并且颈部皮下注射生理盐水；
在注射并给药期间，每周对小鼠的体重均进行测量与记录，每周对小鼠的饮水量、食量进行测量与记录，并通过统计软件进行统计处理，观察各组差异；
在注射并给药期间，每周记录小鼠脱毛状况，并定期对小鼠进行拍照记录，然后通过图像分析软件，计算各组42d后小鼠脱毛面积大小，并进行比较。
S3：在注射并给药结束后，第2天始，对所有小鼠进行连续Morris水迷宫实验，所述水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验；所述空间探索实验是在所述定位航行实验之后。
进一步地，步骤S3的Morris水迷宫实验为期6天，前5天连续进行定位航行实验，第6天进行空间探索实验。
进一步地，步骤S2中阳性对照组给药方式则是进行二甲双胍灌胃，鞣花酸(EA)组为鞣花酸灌胃，自噬抑制剂组为氯喹腹腔注射，联合用药组为鞣花酸灌胃并氯喹腹腔注射。
进一步地，步骤S3的Morris水迷宫实验时，每天实验前将所有小鼠提前1小时搬入行为学实验的房间适应该房间的环境；所述Morris水迷宫实验采用Morris水迷宫实验仪器，所述Morris水迷宫实验仪器包括可移动的平台和水池，所述水池的池壁底部及四周均被染成白色，并且在水池中的清水预先倒入一定量的二氧化钛，以此隐蔽平台；水池正上方设有与计算机连接的摄像机，以记录小鼠在一定时间内完整的游泳轨迹，并且自动计算出小鼠游泳的总路程、时间、游泳速度及找到平台所需的时间等。
进一步地，所述定位航行实验为每天上午、下午各1次，其实验操作为：将小鼠面向池壁分别从1个固定的入水点放入水中，放入水中同时开始计时，观察记录小鼠找到水下隐藏的平台所需时间，该结果即为逃避潜伏期；如果该小鼠60s内未能成功找到平台，则需实验者将小鼠引导到水下隐藏的平台上，并让其在台上维持站立15s观察周围环境，并记录潜伏期为60s。
进一步地，所述空间探索实验的实验操作为：将水中隐蔽的平台撤掉，固定水池中任一个位置作为实验的入水点，让小鼠在水池内游泳探索、寻找平台60s，并记录其在实验期问的逃避潜伏期、游泳速度、原平台所在象限的游泳总时间及穿越原平台所在位置次数。
进一步地，所述鞣花酸为石榴鞣花酸。
进一步地，步骤S2中的图像分析软件为imageproplus。
本发明还提供了二甲双胍的应用，其在制备预防改善毛发脱落药物中的应用，所述毛发脱落主要是指由于衰老而导致。
本发明还提供了氯喹新的应用，其在制备预防改善毛发脱落药物中的应用，所述毛发脱落主要是指由于衰老而导致。
进一步地，氯喹与鞣花酸复配应用于制备抗衰老药物中，具体的应用于预防改善毛发脱落。
采用上述技术方案，具有的有益效果如下：
本发明的实验方法可对鞣花酸及鞣花酸联合自噬抑制剂从记忆力、脱毛(毛发)等指标，来就其对衰老方面的影响进行有效的考察，可对鞣花酸及鞣花酸联合自噬抑制剂的抗衰老的药物的研发提供实验支持与验证。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例定位航行实验中小鼠游泳潜伏期对比曲线图；
图2为本发明的实施例空间探索实验中小鼠穿过逃逸平台及有效区域次数；
图3为本发明实施例空间探索实验中小鼠潜伏期；
图4为本发明实施例空间搜索实验中小鼠游泳轨迹图，其中A：空白对照组；B：衰老组C：鞣花酸组D：联合用药组E：自噬抑制剂F：阳性对照组；
图5为本发明实施例中小鼠脱毛情况，从上到下依次为空白对照组、衰老模型组、阳性对照组、鞣花酸(EA)组、自噬抑制剂组、联合用药组；
图6为本发明实施例中小鼠脱毛面积对比柱形图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：本实例提供了一种鞣花酸联合自噬抑制剂对小鼠模型衰老影响的实验方法，其实验步骤为：
S1：选取健康清洁级昆明种小鼠48只，1月龄，雌性，体重(24+2)g，随机分为空白对照组、衰老组、阳性对照组、鞣花酸(EA)组、自噬抑制剂组、联合用药组，每组8只，实验小鼠购自新疆医科大学实验动物中心。自由饮用自来水,放独立式鼠笼饲养箱内饲养,空气过滤净化,室温空调26-28℃。
S2：采用D-半乳糖致亚急性衰老法，将除了空白对照组的外小鼠每日颈背部皮下注射5％D-半乳糖溶液(1000mg/Kg)，连续注射42天，构建衰老动物模型，在同时，对阳性对照组、鞣花酸(EA)组、自噬抑制剂组、联合用药组的小鼠给药，空白对照组则进行灌胃并且颈部皮下等量注射生理盐水；其中阳性对照组给药方式则是进行二甲双胍(50mg/kg·d)灌胃，鞣花酸(EA)组为鞣花酸(50mg/kg·d)灌胃，自噬抑制剂组为氯喹(50mg/kg·3d)腹腔注射，联合用药组为鞣花酸(50mg/kg·d)灌胃并氯喹(50mg/kg·3d)腹腔注射。
在注射并给药期间，每周对小鼠的体重均进行测量与记录，每周对小鼠的饮水量(见表2)、食量(见表3)进行测量与记录，并通过SPSS25.0统计软件进行统计处理，观察各组差异；
在注射并给药期间，每周记录小鼠脱毛状况，并在第4d，31d，42d对小鼠进行拍照记录(见图5)，然后通过imageproplus6.0图像分析软件，计算各组42d后小鼠脱毛面积大小，并进行比较(见图6)。
本步骤中所给药D-(+)-半乳糖(D-gal)购于江苏鹏翔生物医药有限公司，二甲双胍(MF)购于北京京丰制药集团，石榴鞣花酸(EA)购于上海麦克林生化科技有限公司，氯喹(CQ)购于中国武汉鼎辉生物化工有限公司，电子天平(上海菁海仪器有限公司)。
S3：在注射并给药结束后，第2天始，对所有小鼠进行连续Morris水迷宫实验，所述水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验；所述空间探索实验是在所述定位航行实验之后。每天实验前将所有小鼠提前1小时搬入行为学实验的房间适应该房间的环境；所述Morris水迷宫实验采用Morris水迷宫实验仪器，所述Morris水迷宫实验仪器包括可移动的平台和水池，所述水池的池壁底部及四周均被染成白色，并且在水池中的清水预先倒入一定量的二氧化钛，以此隐蔽平台；水池正上方设有与计算机连接的摄像机，以记录小鼠在一定时间内完整的游泳轨迹，并且自动计算出小鼠游泳的总路程、时间、游泳速度及找到平台所需的时间等。
在对小鼠连续给药42d后，通过Morris水迷宫实验考察动物的学***台所需时间，该结果即为逃避潜伏期。如果该小鼠60s内未能成功找到平台，则需实验者将小鼠引导到水下隐藏的平台上，并让其在台上维持站立15s观察周围环境，并记录潜伏期为60s。
小鼠在完成前5天的定位航行实验后，在第6天，将水中隐蔽的平台撤掉，固定水池中任一个位置作为实验的入水点，让小鼠在水池内游泳探索、寻找平台60s，并记录其在实验期问的逃避潜伏期、游泳速度、原平台所在象限的游泳总时间及穿越原平台所在位置次数，实验结果见图1、图2、图3。
其中采用SPSS25.0统计软件包进行统计处理,检验水准α＝0.05。多组间均数的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
实验结果：
(1)石榴鞣花酸对实验小鼠活跃度观察(见表1)
第3周开始，与空白对照组(C)比较，衰老组(M)活跃只数减少，活跃程度降低；与衰老组(M)比较，鞣花酸组(鞣花酸干预组，EA)活跃只数较多，活跃程度提高；与鞣花酸组(EA)比较，联合用药组(EA+CQ)活跃只数减少，活跃程度降低；与阳性对照组(MF)比较，鞣花酸(EA)组活跃状态，只数相近，见表1。
表1：各组给药对实验小鼠活跃程度的影响
注：+表示小鼠静卧不动；++表示小鼠慢速走动；+++小鼠快速来回走动。
表中的C组即为空白对照组，M组为衰老组，EA为鞣花酸组，EA+CQ为联合用药组，MF为阳性对照组，CQ为自噬抑制剂组。
(2)石榴鞣花酸对实验小鼠饮水量的影响(见表2)
第5周开始，与M组比较，四个给药组(EA，EA+CQ，CQ，MF组)饮水量明显高于M组(P<0.01)，各给药组间饮水量差距不大(P>0.05)；第6周开始，与EA组比较，EA+CQ、CQ组饮水量稍降低，EA组与MF组未见明显区别。
表2：EA对实验小鼠饮水量的影响(ml/只·天)
注：与M组比较，*P<0.05,**P<0.01；与EA组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与CQ组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；
(3)石榴鞣花酸对于实验小鼠食量的影响(见表3)
第3周开始，与空白对照组(C组)相比，其他组食量均减少(P<0.05)，各给药组间差距不大(P>0.05)；第6周开始，与C组比较，衰老组(M组)食量减少；与M组比较，鞣花酸组(EA组)食量稍增多，CQ组、尤其MF组、EA+CQ食量明显减少；与EA组比较，联合用药组(EA+CQ组)、CQ组、MF组食量减少；与阳性对照组(MF组)比较，EA组饮食量增加。
表3 EA对衰老小鼠食量的影响(g/只)
注：与C组比较○P<0.05,○○P<0.01，与M组比较，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001；与EA组比较，#P<0.05，##P<0.01；与MF组比较，，▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；
(4)Morris水迷宫实验结果
①定位航行实验结果(见表四、图1)
随训练时间延长，各组小鼠找到平台时间逐渐缩短。与空白对照组(C组)相比较，衰老组(M组)小鼠在训练第4天(P＜0.05)及第5天(P＜0.01)找到平台潜伏期明显延长；与衰老组(M组)比较，在训练第3天，鞣花酸组(EA组)小鼠找到平台潜伏期明显缩短(P＜0.05)，最先显示出改善作用，在训练第5天，鞣花酸组(EA组)小鼠、氯喹组(CQ组)找到平台潜伏期明显缩短，具有统计学差异(P＜0.05)；与EA组比较，联合用药组(EA+CQ组)、MF组潜伏期延长，显示出在改善脑定位方面EA优于MF。
表4定位航行实验中EA对衰老模型小鼠潜伏期影响(S)
注：与C组比较○P<0.05,○○P<0.01，与M组比较，*P<0.05,**P<0.01；与MF组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与CQ组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；
②空间搜索实验结果(见表5、图2、图3、图4)
与正常组比较，衰老组(M组)小鼠在平台所在象限的停留时间明显延长(P＜0.01)，穿过原平台的次数减少(P＜0.05)，游动距离短，与M组相比，EA，CQ组在平台所在象限的停留时间明显缩短(P＜0.01)，游动距离延长,EA+CQ，MF组未见明显差异。与阳性对照组(MF组)相比，EA组，CQ组潜伏期缩短，穿越逃逸平台次数增加，详见表5，图2,3,4。
表5.空间探索实验中EA对衰老小鼠潜伏期及穿越次数影响(S)
注：与C组比较○P<0.05,○○P<0.01；与M组比较*P<0.05,**P<0.01；与EA组比较，#P<0.05，##P<0.01；与MF组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。
(5)对实验小鼠脱毛面积的影响(见表6、图5、图6)
在给实验小鼠连续给药期间，在第4d，31d，42d观察小鼠脱毛情况，通过imageproplus6.0分析软件，计算给药42d后小鼠脱毛面积大小并进行比较，各组情况详见表6。
表6 EA对衰老小鼠脱毛面积影响(mm2)
注：与C组比较○P<0.05,○○P<0.01，○○○P<0.001；与M组比较，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001；与EA组比较，#P<0.05，##P<0.01；与MF组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；
对表6进行分析，实验42d后，与空白对照组(C组)比较，衰老组(M组)脱毛面积明显扩大(P<0.001)，与M组相比，给药EA组，CQ组，MF组脱毛面积显著缩小(P<0.001),EA+CQ组脱毛面积明显缩小(P<0.01)。与EA组相比，EA+CQ组脱毛面积增大，与MF组相比，EA组脱毛面积未见区别,CQ组脱毛面积明显减少。
二甲双胍(CQ)作为临床常用的降糖药物,还可能通过减少活性氧簇(reactiveoxygen species，ROS)产生、减轻DNA损伤，激活AMPK、抑制mTOR作用，以及激活自噬而发挥抗衰老作用。氯喹是临床上常用的抗疟药，同时也作为一种自噬抑制剂广泛应用于自噬的研究。它可通过升高溶酶体内pH值，阻止自噬体与溶酶体的结合而抑制自噬。
通过本发明的实验方法，观察小鼠饮食量与活跃状态发现，与空白对照组相比，衰老组饮食量，活跃程度明显下降，指示由于衰老，精神萎靡，行动缓慢，食量显著下降。而与衰老组比较给药各组其活跃程度，饮食量增加。通过实施例，可以很明显地看出石榴鞣花酸可显著提高模型小鼠的活跃程度，且与自噬抑制剂氯喹无统计学明显差异(P>0.05)。以上结果表明石榴鞣花酸具有提高小鼠活跃程度的作用，并且其活性可能与抑制自噬有关。
Morris水迷宫实验测试以上结果显示，持续给药42d后模型组潜伏期延长，穿越平台次数，有效区域次数减少，小鼠的学***台次数，有效区域次数增加，且结果优于阳性对照药MF(P<0.05)。以此，通过实验方法可进一步地实验与验证鞣花酸可显著改善衰老模型小鼠的学习、记忆能力，且与氯喹无统计学明显差异(P>0.05)。并通过外观指标脱毛面积发现，给药组EA，CQ，MF组脱毛面积明显缩小，其结果具有统计学差异(P<0.001)，并且给药组间无明显统计学差异(P>0.05)。
本实施例中，采取自抑制剂氯喹进行实验，实验结果表明氯喹有抗衰老作用，可以改善衰老小鼠学习记忆能力，尤其在改善毛发脱落上有非常明显作用。并且降糖药二甲双胍也是具有一定的抗衰老作用，其在改善毛发脱落上也是具有非常明显的作用。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，上述实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.氯喹在制备预防或改善衰老所致的毛发脱落的药物中的应用。
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