CN112779262A - 猪RagC基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了猪RagC基因的应用。本发明根据人RagC基因序列和小鼠RagC基因序列的同源性设计了特异性引物，首次克隆出猪RagC基因ORF，并对猪RagC基因参与猪不同组织细胞中不同氨基酸感应的功能进行了应用探索。本发明发现过表达RagC基因参与赖氨酸激活的猪骨骼肌卫星细胞mTORC1信号通路蛋白质的表达水平，并且能够显著提高猪骨骼肌卫星细胞蛋白质合成能力；提示RagC的基因参与mTORC1感应赖氨酸浓度变化调控骨骼肌卫星细胞蛋白质合成促进猪肌肉生长的过程。

Description

猪RagC基因的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及猪RagC基因的应用。

背景技术

mTORC1能够感应胞内外氨基酸浓度变化，进而介导氨基酸调控蛋白质合成。RagC是募集mTORC1到溶酶体上激活的重要靶蛋白质。然而，不同氨基酸激活mTORC1的途径不同，不同细胞中氨基酸激活mTORC1的途径也不完全一致。RagC，是Rag GTPase成员之一，在哺乳动物中其余3个成员分别为RagA、RagB、RagD，均属于Ras小G蛋白家族。RagA和RagB高度同源、RagC和RagD高度同源，RagA或RagB能够与RagC或RagD结合形成异二聚体。现有研究证明，Rag GTPase能够介导氨基酸激活mTORC1信号通路，尤其是亮氨酸和精氨酸。

专利CN111394370A公开了猪RagA基因及其应用，具体公开了过表达RagA基因能够显著增加肠上皮细胞的活力，同时激活mTORC1信号通路。但目前国内外关于RagC基因的研究集中于人、小鼠和酵母上，而关于猪RagC基因的研究未见报道，特别是RagC参与不同氨基酸激活猪不同组织细胞中mTORC1信号通路的应用尚不可知。在解析氨基酸感应的过程中，RagC的功能研究至关重要，但是，有研究表明谷氨酰胺激活mTORC1不需要RagC参与。因此，有必要对RagC基因在猪组织细胞中氨基酸感应的功能进行***性研究，为后续猪RagC基因在提高猪生长质量的应用提供重要基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中猪RagC基因在猪细胞功能研究中的不足，提供猪RagC基因的应用。

本发明的第一个目的是提供猪RagC基因在提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。

本发明的第二个目的是提供猪RagC基因和/或其编码的蛋白在作为mTORC1通路激活剂提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。

本发明的第三个目的是提供猪RagC基因和/或其编码的蛋白在促进动物肌肉生长中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种提高猪细胞蛋白质合成能力的方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现的：

本发明根据人RagC基因序列和小鼠RagC基因序列的同源性设计了特异性引物，首次克隆出猪RagC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，并对猪RagC基因参与猪不同组织细胞中不同氨基酸感应的功能进行了应用探索。本发明发现过表达RagC基因参与赖氨酸激活的猪骨骼肌卫星细胞mTORC1信号通路蛋白质的表达水平，但过表达RagC基因不参与谷氨酸激活的猪肠上皮细胞mTORC1信号通路，说明不同细胞中RagC参与不同氨基酸感应的功能不一样。

因此，本发明要求保护以下应用：

猪RagC基因在提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。

猪RagC基因和/或其编码的蛋白在作为mTORC1通路激活剂提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。

优选地，所述动物细胞为猪组织细胞。

更优选地，所述猪组织细胞为猪骨骼肌卫星细胞。

所述猪RagC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

同样，猪RagC基因和/或其编码的蛋白在促进动物肌肉生长中的应用，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述动物为猪。

优选地，以上所述应用为在猪骨骼肌卫星细胞中过表达猪RagC基因。

一种提高猪细胞蛋白质合成能力的方法，所述方法为在猪细胞中过表达猪RagC基因，包括以下步骤：

S1.PCR扩增猪RagC基因ORF；

S2.构建含猪RagC基因ORF的慢病毒过表达载体；

S3.将步骤S2的慢病毒过表达载体感染猪细胞，获得过表达猪RagC基因的猪细胞株。

优选地，所述猪细胞为猪骨骼肌卫星细胞。

优选地，步骤S1所述PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

优选地，步骤S2所述构建含猪RagC基因ORF的慢病毒过表达载体所选用的质粒为pLVX-AcGFP1-N1。

优选地，采用Real-time PCR鉴定是否已获得RagC基因的过表达细胞株，PCR鉴定RagC基因的过表达所用的引物的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了猪RagC基因的新应用。本发明根据人RagC基因序列和小鼠RagC基因序列的同源性设计了特异性引物，首次克隆出猪RagC基因ORF，并对猪RagC基因参与猪不同组织细胞中不同氨基酸感应的功能进行了应用探索。本发明发现过表达RagC基因参与赖氨酸激活的猪骨骼肌卫星细胞mTORC1信号通路蛋白质的表达水平，并且能够显著提高猪骨骼肌卫星细胞蛋白质合成能力；这提示RagC的基因参与mTORC1感应赖氨酸浓度变化调控骨骼肌卫星细胞蛋白质合成促进猪肌肉生长的过程，可以用于后续猪RagC基因在猪动物上的功能研究以及氨基酸感应中的开发。

附图说明

图1为RagC基因的PCR扩增产物的电泳结果图；图中M：DNA Marker DL2000，1和2：RagC目的条带(1200bp)。

图2为琼脂糖凝胶电泳后切胶回收RagC基因的结果图；图中M：DNA MarkerDL2000，1：RagC目的条带(1200bp)。

图3为带有酶切位点和Flag标签的RagC基因的PCR扩增产物的电泳结果图；图中M：DNA Marker DL2000，1：含RagC基因条带(1247bp)。

图4为切胶回收的带有酶切位点和Flag标签的RagC基因的结果图；图中M：DNAMarker DL2000，1：含RagC基因条带(1247bp)。

图5为经Xho I和EcoR I双酶切后纯化回收的RagC基因结果图；图中M：DNA MarkerDL2000，1：含RagC基因条带(1241bp)。

图6为经Xho I和EcoR I双酶切后纯化回收的pLVX-AcGFP1-N1片段结果图；图中M1：DNA Marker DL15000，1：pLVX-AcGFP1-N1片段(8771bp)。

图7为酶切鉴定获得的重组载体结果图；图中M2：DNA Marker DL10000，1和2分别为用Xho I和EcoR I限制酶单酶切鉴定重组载体(10012bp)，3为重组载体Xho I和EcoR I双酶切鉴定(8771bp)。

图8为重组过表达载体中RagC测序峰图(CMV-F单向测序)。

图9为使用MoFlo XDP超速流式细胞分选***获得GFP阳性细胞，Negativecontrol：阴性对照组(野生型猪肠上皮细胞)，Control：对照组(空质粒组，表达GFP标签)，RagC overexpression：RagC过表达组(表达GFP标签)。

图10为分选后观察对照组和RagC过表达组GFP荧光信号强度。

图11为过表达RagC稳转猪肠上皮细胞株的鉴定，A：RagC荧光信号强度、B：mRNA丰度和C：蛋白质表达水平(n＝3)；其中，Control：对照组(空质粒组)，RagC overexpression：RagC过表达组。

图12为免疫荧光鉴定Flag标签在RagC稳转猪肠上皮细胞株中同时过表达。

图13为谷氨酸激活猪肠上皮细胞中mTORC1信号且下调RagC总蛋白质表达水平。

图14为RagC不参与谷氨酸激活猪肠上皮细胞中mTORC1信号事件。

图15为赖氨酸上调猪骨骼肌卫星细胞RagC蛋白质表达水平且激活mTORC1信号通路。

图16为过表达RagC稳转猪骨骼肌卫星细胞后观察对照组和RagC过表达组GFP荧光信号强度。

图17为过表达RagC显著提高猪骨骼肌卫星细胞mTORC1信号通路蛋白质表达水平。

图18为过表达RagC显著提高猪骨骼肌卫星细胞蛋白质合成能力。

具体实施方式

根据下述具体实施案例，结合说明书附图对本发明的内容进一步说明，但实施案例不对本发明做任何形式的限定。除特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 PCR扩增猪RagC基因ORF

1、引物设计

根据人RagC基因序列(登录号为NM_022157.4)和小鼠RagC基因序列(登录号为NM_017475.2)的同源性，运用Primer Premier 5软件设计了特异性引物F1/R1，引物核苷酸序列如表1所示。

表1克隆用引物核苷酸序列

2、提取猪肠上皮细胞总RNA

吸弃6孔板中培养液，PBS润洗细胞两次。每孔加入1mL Trizol试剂，室温静置5min，4℃12000r/min离心10min，取上清至新离心管。加入0.2mL氯仿，剧烈振摇混匀，室温静置5min，4℃12000r/min离心15min(降速为零)，取上层水相至新离心管。按1:1比例加入异丙醇混匀，-80℃静置30min，4℃12000r/min离心10min。75％乙醇漂洗RNA沉淀2次，4℃12000r/min离心5min，吸弃上清。室温静置干燥沉淀，加入适量DEPC水溶解。用核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，通过普通琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的质量。

3、猪肠上皮细胞总RNA中DNA的消化

按表2所示消化反应体系加入并混匀各成分，37℃反应30min，65℃反应5min(灭活DNA酶)，以消化猪小肠上皮细胞总RNA中的DNA。

表2消化反应体系

4、cDNA合成

反转录反应按M-MLV试剂说明书进行，取2μg RNA，加3μL随机引物，加DEPC水至15μL，70℃变性5min，冰上冷却，短暂离心。然后按表3所示反转录反应体系加入其它成分，振荡混匀，短暂离心，37℃静置60min；80℃灭活5min，12℃静置10min，分装后保存于-20℃。

表3反转录反应体系

5、猪RagC基因ORF的PCR扩增

(1)实验方法

取上述步骤4获得的cDNA为模板，利用步骤1设计的特异性引物，以表4所示的PCR扩增体系扩增猪RagC基因。

表4扩增CDS区体系

(2)PCR扩增产物的回收

配制1.2％琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物点样后，110V电压进行琼脂糖电泳30min，电泳结束后用凝胶成像***拍照。然后，切取带有目的片段的琼脂糖凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN DP209)回收目的片段，方法按照试剂盒说明书进行。

(3)实验结果

图1和图2显示，RagC基因的PCR扩增产物、琼脂糖凝胶电泳后切胶回收的RagC基因大小均为1200bp。

6、含酶切位点的猪RagC基因ORF的PCR扩增

(1)含酶切位点的猪RagC基因扩增引物的设计

在RagC基因ORF两端设计一对引物F2/R2，其核苷酸序列如表5所示，上游引物带有Xho I酶切位点，下游引物带有EcoR I酶切位点。为了后期功能验证，上游引物同时加入Kozak序列(增强目的基因表达)和Flag标签，下游引物中去掉3个碱基CTA，使扩增的RagC基因ORF与连接的载体GFP融合表达，同时加入G碱基，保证不发生移码突变。

表5克隆用引物核苷酸序列

(2)实验结果

实验结果如图3和图4所示，带有酶切位点和Flag标签的RagC基因的PCR扩增产物、切胶回收的带有酶切位点和Flag标签的RagC基因的大小均为1247bp。

7、pLVX-AcGFP1-N1质粒的扩增提取

将含有慢病毒过表达载体pLVX-AcGFP1-N1的菌液接种于LA平板上，37℃培养过夜，待菌落长出，用灭菌牙签从LA平板上挑取单菌落，接种于5mL LA液体培养基中，37℃振摇过夜。参照质粒小提试剂盒(TIANGEN DP103)的方法提取质粒。

8、回收双酶切目的片段序列和慢病毒过表达载体

(1)实验方法

参照步骤5中的DNA产物的回收方法，回收目的片段，按表6所示反应体系进行目的片段和载体的双酶切，酶切后使用Universal DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN DP214)进行回收，按照试剂盒说明书的方法进行。

表6双酶切反应体系

(2)实验结果

实验结果如图5和图6所示，经Xho I和EcoR I双酶切后纯化回收的RagC基因大小为1241bp，经Xho I和EcoR I双酶切后纯化回收的pLVX-AcGFP1-N1片段大小为8771bp。

9、连接反应

将pLVX-AcGFP1-N1和RagC片段双酶切产物按照表7所示反应体系混匀，置于16℃环境连接过夜，酶切鉴定获得的重组载体结果如图7所示，重组载体的大小为10012bp。

表7 pLVX-AcGFP1-N1和RagC基因片段的连接反应体系

10、连接产物转化大肠杆菌stbl3感受态细胞

取连接产物10μL与50μL stbl3感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热休克45s，冰上放置3～5min，加入600μL无抗生素LB培养基，37℃，250r/min摇晃1h。取200μL无菌玻璃涂布器涂布于LA平板表面，37℃正置20min后倒置培养12h。

11、测序

(1)实验方法

上述连接产物经转化、挑单菌落后，操作同上述质粒的扩增和提取，提取的提取重组质粒进行PCR鉴定，选取酶切鉴定呈阳性的菌液送至广州擎科生物技术有限公司进行测序。确定结果后，取阳性菌液用康为世纪公司无内毒素质粒大提试剂盒GoldHi EndoFreePlasmid Maxi Kit(CWBIO CW2104)提取质粒，测浓度后，于-20℃保存备用。

(2)实验结果

对获得的重组质粒pLVX-Flag-RagC-AcGFP1-N1测序，测序峰图如图8所示，测序后得到猪RagC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其ORF编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例2猪RagC基因过表达细胞株的构建

1、猪RagC过表达载体构建

以实施例1中测序成功的重组质粒pLVX-Flag-RagC-AcGFP1-N1为猪RagC基因过表达载体，其扩增和质粒提取同实施例1。

2、慢病毒包装辅助质粒pMD2.G和psPAX2的转化、扩增、提取方法均同实施例1，唯一不同之处是转化时所用的细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞。

3、慢病毒包装细胞293T细胞的培养、传代

用完全培养基(含有10％FBS和1％青/链霉素的高糖DMEM培养基)重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养。

当293T细胞融合率达到90％时传代，具体方法如下：吸弃培养基，PBS润洗1遍，用0.25％胰蛋白酶溶液消化4min。吸弃胰蛋白酶溶液，加入等体积完全培养基终止消化，并将细胞悬液移至10mL离心管，4℃1000r/min离心3min。吸弃上清，加入完全培养基重悬细胞，按1:4接种于新的培养瓶中培养，隔天换液。

4、慢病毒包装

将重组质粒pLVX-Flag-RagC-AcGFP1-N1、空质粒pLVX-AcGFP1-N1分别与慢病毒包装辅助质粒pMD2.G和psPAX2一起共转染293T细胞进行慢病毒包装(重组质粒与慢病毒包装辅助质粒的质量之比为：pLVX-RagC-AcGFP1-N1：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1)，具体参照广州广誉生物科技有限公司GO3000转染试剂操作说明，产生重组和对照慢病毒颗粒，浓缩纯化和测定滴度后，-20℃保存待用。

5、获得过表达猪RagC稳转细胞株

(1)实验方法

用收获的慢病毒颗粒感染猪肠上皮细胞和猪骨骼肌卫星细胞，通过流式细胞技术和药物嘌呤霉素(分别为2.5μg/mL和3μg/mL)进行筛选，获得稳转猪RagC的猪肠上皮细胞和猪骨骼肌卫星细胞株，应用细胞免疫荧光技术、Real-time PCR和Western blotting鉴定RagC过表达，以用来说明是否已获得过表达RagC基因的稳转猪肠上皮细胞和猪骨骼肌卫星细胞；其中，Real-time PCR鉴定RagC基因的过表达所用的引物F3/R3及其序列如表8所示。

表8 Real-time PCR鉴定RagC基因的过表达所用的引物及其序列

(2)实验结果

结果如图9～12所示，表明已获取过表达RagC的稳转猪肠上皮细胞和猪骨骼肌卫星细胞。其中，从图9中R3区域的面积大小、图10中可检测到GFP绿色荧光信号可以发现RagC过表达成功；图11表明表明已获得RagC过表达的稳转猪肠上皮细胞株；图12提示在猪骨骼肌卫星细胞中RagC过表达成功。

实施例3猪RagC基因的功能验证

1、RagC基因在猪肠上皮细胞中过表达后发挥的功能

(1)实验方法

以猪肠上皮细胞系为材料，5×10⁴个细胞/孔接种6孔细胞培养板，经24h贴壁、血清饥饿15h和氨基酸饥饿4h后，分为对照组(0mmol/L)和谷氨酸组(5mmol/L)处理，收集细胞蛋白质样品。通过western blotting检测mTORC1信号通路关键蛋白质表达水平和RagC表达水平；其次，以野生型、空质粒和RagC过表达细胞为试验材料，以5×10⁴个细胞/孔接种6孔细胞培养板，分为对照组(0mmol/L)和谷氨酸组(5mmol/L)处理，收集细胞蛋白质样品，通过western blotting检测mTORC1信号通路关键蛋白质表达水平，观察RagC基因在猪肠上皮细胞中过表达后对mTORC1信号通路的影响。

(2)实验结果

结果如图13和图14所示，结果表明谷氨酸处理激活猪肠上皮细胞中mTORC1信号(图13A-B)且下调RagC总蛋白质表达水平(图13C-D)；而图14结果表明RagC基因过表达不参与谷氨酸激活猪肠上皮细胞中mTORC1信号事件。

2、RagC基因在猪骨骼肌卫星细胞中过表达后发挥的功能

(1)实验方法

以猪骨骼肌卫星细胞为材料，以5×10⁴个细胞/孔接种6孔细胞培养板，经24h贴壁、血清饥饿15h和氨基酸饥饿4h后，检测不同浓度赖氨酸(0、0.25、0.5、1mmol/L)处理对mTORC1信号通路关键蛋白质表达和RagC表达水平的影响；其次，检测RagC基因过表达对猪骨骼肌卫星细胞中mTORC1信号通路关键蛋白质表达和RagC表达水平的影响。

(2)实验结果

结果如图15～17所示，图15结果表明0.50mmol/L赖氨酸显著提高猪骨骼肌卫星细胞RagC总蛋白质表达水平，并激活mTORC1信号通路；图16显示RagC基因在猪骨骼肌卫星细胞中过表达成功；图17结果表明过表达RagC基因显著提高猪骨骼肌卫星细胞mTORC1信号通路的蛋白质表达水平。

3、过表达RagC对猪骨骼肌卫星细胞蛋白质合成能力的影响

(1)实验方法

以空质粒和RagC过表达猪骨骼肌卫星细胞为材料，以5×10⁴个细胞/孔接种6孔细胞培养板，培养48h后，加入1.00μg/ml的嘌呤霉素处理30min。以RIPA裂解液收集细胞样品，以Western blotting检测嘌呤霉素水平来测定猪骨骼肌卫星细胞中蛋白质的合成。

(2)实验结果

结果如图18所示，过表达RagC显著提高猪骨骼肌卫星细胞蛋白质合成能力。说明过表达RagC基因参与赖氨酸激活的猪骨骼肌卫星细胞mTORC1事件，提示RagC的基因参与mTORC1感应赖氨酸浓度变化调控骨骼肌卫星细胞蛋白质合成促进猪肌肉生长的过程。

本发明证明，不同细胞中RagC参与不同氨基酸感应的功能不一样，而RagC的基因能参与mTORC1感应赖氨酸浓度变化从而调控猪骨骼肌卫星细胞蛋白质合成，可以用于后续猪RagC基因在猪动物上的功能研究以及氨基酸感应中的开发。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 猪RagC基因的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtccctgc agtacggggc ag 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagatggca tttcgcggcg tgc 23

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctcgaggc caccatggat tacaaggatg acgacgataa gatgtccctg cagtacggg 59

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggaattcgg atggcatttc gcggc 25

<210> 5

<211> 1200

<212> DNA

<213> 猪RagC基因ORF

<400> 5

atgtccctgc agtacggggc agaggagacg cccctcgccg gcagttacgg cgcggcggac 60

tcgttcccaa aggacttcgg ctacggcgtg gaggaggagg aagaggaggc tgcagccggg 120

ggtggcgggg ttggggcggg ggccggtgga ggctgtggcc cggggggtgc tgacagctcc 180

aagccgagga ttctgctcat ggggctccgg cgcagcggca agtcttccat ccagaaggtg 240

gtgtttcata aaatgtcgcc caatgagacc ctctttttgg aaagtaccaa caagatttac 300

aaagatgaca tttctaatag ctcctttgtg aatttccaaa tatgggattt tcctgggcaa 360

atggactttt ttgacccaac ttttgactat gagatgatct tcaggggaac aggagcattg 420

atatatgtca ttgatgcaca ggatgactac atggaggctt taacaagact tcacattact 480

gtttctaaag cctacaaagt taatccagac atgaattttg aggtttttat tcacaaagtt 540

gatggtctgt ctgatgatca caaaatagaa acacagaggg atattcatca aagggccaat 600

gatgaccttg cagatgctgg gctagaaaaa ctccacctta gcttttattt gactagtatc 660

tatgaccatt caatatttga agccttcagt aaggtggtgc agaaacttat tccacaactg 720

ccaaccctgg aaaacctatt aaatatcttt atatcaaatt caggtattga aaaagctttt 780

ctcttcgatg ttgtcagcaa aatctacatt gcaaccgaca gttctcctgt ggatatgcag 840

tcttatgaac tttgctgtga catgattgat gttgtaattg atgtgtcttg tatatatggg 900

ttaaaggaag atggaagtgg aagtgcttat gacaaagaat ctatggccat catcaagctg 960

aataatacaa ctgttcttta tttaaaggag gtgactaaat ttttggcact ggtctgcatt 1020

cttagggaag aaagttttga acgaaaaggt ttaatagact acaacttcca ctgtttccgt 1080

aaagctattc atgaggtttt tgaggttggt gtgacttctc acaggagctg tggtcaccag 1140

agcagtgccc ccagcctgaa agcgttgaca cacaacggca cgccgcgaaa tgccatctag 1200

<210> 6

<211> 399

<212> PRT

<213> 猪RagC蛋白

<400> 6

Met Ser Leu Gln Tyr Gly Ala Glu Glu Thr Pro Leu Ala Gly Ser Tyr

1 5 10 15

Gly Ala Ala Asp Ser Phe Pro Lys Asp Phe Gly Tyr Gly Val Glu Glu

20 25 30

Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Ala

35 40 45

Gly Gly Gly Cys Gly Pro Gly Gly Ala Asp Ser Ser Lys Pro Arg Ile

50 55 60

Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Gln Lys Val

65 70 75 80

Val Phe His Lys Met Ser Pro Asn Glu Thr Leu Phe Leu Glu Ser Thr

85 90 95

Asn Lys Ile Tyr Lys Asp Asp Ile Ser Asn Ser Ser Phe Val Asn Phe

100 105 110

Gln Ile Trp Asp Phe Pro Gly Gln Met Asp Phe Phe Asp Pro Thr Phe

115 120 125

Asp Tyr Glu Met Ile Phe Arg Gly Thr Gly Ala Leu Ile Tyr Val Ile

130 135 140

Asp Ala Gln Asp Asp Tyr Met Glu Ala Leu Thr Arg Leu His Ile Thr

145 150 155 160

Val Ser Lys Ala Tyr Lys Val Asn Pro Asp Met Asn Phe Glu Val Phe

165 170 175

Ile His Lys Val Asp Gly Leu Ser Asp Asp His Lys Ile Glu Thr Gln

180 185 190

Arg Asp Ile His Gln Arg Ala Asn Asp Asp Leu Ala Asp Ala Gly Leu

195 200 205

Glu Lys Leu His Leu Ser Phe Tyr Leu Thr Ser Ile Tyr Asp His Ser

210 215 220

Ile Phe Glu Ala Phe Ser Lys Val Val Gln Lys Leu Ile Pro Gln Leu

225 230 235 240

Pro Thr Leu Glu Asn Leu Leu Asn Ile Phe Ile Ser Asn Ser Gly Ile

245 250 255

Glu Lys Ala Phe Leu Phe Asp Val Val Ser Lys Ile Tyr Ile Ala Thr

260 265 270

Asp Ser Ser Pro Val Asp Met Gln Ser Tyr Glu Leu Cys Cys Asp Met

275 280 285

Ile Asp Val Val Ile Asp Val Ser Cys Ile Tyr Gly Leu Lys Glu Asp

290 295 300

Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Asp Lys Glu Ser Met Ala Ile Ile Lys Leu

305 310 315 320

Asn Asn Thr Thr Val Leu Tyr Leu Lys Glu Val Thr Lys Phe Leu Ala

325 330 335

Leu Val Cys Ile Leu Arg Glu Glu Ser Phe Glu Arg Lys Gly Leu Ile

340 345 350

Asp Tyr Asn Phe His Cys Phe Arg Lys Ala Ile His Glu Val Phe Glu

355 360 365

Val Gly Val Thr Ser His Arg Ser Cys Gly His Gln Ser Ser Ala Pro

370 375 380

Ser Leu Lys Ala Leu Thr His Asn Gly Thr Pro Arg Asn Ala Ile

385 390 395

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acagagggat attcatcaaa ggg 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggttggcagt tgtggaataa gt 22

Claims (10)

1.猪RagC基因在提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。

2.猪RagC基因和/或其编码的蛋白在作为mTORC1通路激活剂提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。

3.根据权利要求1和2所述应用，其特征在于，所述动物细胞为猪细胞。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述猪细胞为猪骨骼肌卫星细胞。

5.猪RagC基因和/或其编码的蛋白在促进动物肌肉生长中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述动物为猪。

7.根据权利要求1～6任一所述应用，其特征在于，所述应用为在猪骨骼肌卫星细胞中过表达猪RagC基因。

8.一种提高猪细胞蛋白质合成能力的方法，其特征在于，所述方法为在猪细胞中过表达猪RagC基因，包括以下步骤：

S1.PCR扩增猪RagC基因ORF；

S2.构建含猪RagC基因ORF的慢病毒过表达载体；

S3.将步骤S2的慢病毒过表达载体感染猪细胞，获得过表达猪RagC基因的猪细胞株。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述猪细胞为猪骨骼肌卫星细胞。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

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