CN112779197A

CN112779197A - 利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸的方法

Info

Publication number: CN112779197A
Application number: CN201911086369.8A
Authority: CN
Inventors: 郝健; 卢希阳; 史吉平
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-05-11

Abstract

本发明公开了利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸的方法。该方法为：以木糖酸为碳源利用大肠杆菌或大肠杆菌基因工程菌发酵生产乙二醇和/或乙醇酸；所述大肠杆菌基因工程菌由大肠杆菌失活醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得，或者由大肠杆菌过表达醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得。本发明利用大肠杆菌，以木糖酸作为碳源进行发酵培养时，木糖酸在胞内代谢生成乙醇酸和/或乙二醇，并在发酵液中积累，具有较高的转化率和高的生产强度。进一步对大肠杆菌进行醛氧化酶基因aldA以及醇脱氢酶基因yqhD的失活或过表达，能够进一步提高乙醇酸和/或乙二醇的转化率及生产强度。

Description

利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸的方法

技术领域

本发明属于大肠杆菌基因工程菌技术领域，具体涉及利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸的方法。

背景技术

木糖是继葡萄糖之后自然界中含量第二丰富的单糖，占木质纤维素的18～30％，木糖的有效利用是木质纤维资源利用的关键点。木糖也可以作为部分微生物生长所使用的碳源，大肠杆菌可以利用木糖为碳源，但是生长情况不如以葡萄糖为碳源好。如何高效利用木糖是国际上一个研究热点。木糖酸是木糖的氧化产物，木糖酸的主要应用是作为酯类的生产原料和作为螯合剂。

乙醇酸又名羟基乙酸，是一种结构较小的α羟基酸，同时包含了羟基和羧基两个基团，兼有醇与酸的双重性。纺织业用其作为染色助剂，制药业用其作为皮肤护理剂。乙醇酸还可以用作食品添加剂、清洁剂、油漆添加剂、生物相容性高分子聚合物的合成前体等。

乙醇酸的主流生产有氯乙酸水解法、羟基乙腈水解法、甲醛羰基化法、和草酸电还原法。

乙二醇是最简单的二元醇，是一种重要的有机化工原料，在化学工业中应用广泛，主要用于生产聚酯纤维不饱和聚酯树脂、防冻剂、润滑剂、增塑剂、非离子表面活性剂以及***等，也可以用于涂料、照相显影液、刹车液和油墨等行业。近年来随着聚酯工业的迅猛发展，乙二醇的需求量在不断增加。根据原料不同乙二醇的生产路线分为乙烯法和合成气法。

生物法生产乙醇酸和乙二醇主要有乙醛酸途径，D-核糖-1-磷酸和L-木糖-1-磷酸途径、丝氨酸途径等。

发明内容

本发明的目的是，提供一种利用木糖酸为原料，利用大肠杆菌或其基因工程菌为生产菌株，生产乙二醇和/或乙醇酸的方法。

本发明中木糖酸与木糖酸盐不做区分，统一以木糖酸计。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

大肠杆菌基因工程菌，由大肠杆菌失活醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得，或者由大肠杆菌过表达醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得。所述失活醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD，通过敲除醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD实现。所述过表达醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD，通过将醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD与表达载体连接转入大肠杆菌进行表达来实现。

本发明还提供了利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，该方法为：以木糖酸为碳源配制培养基，利用大肠杆菌或大肠杆菌基因工程菌为生产菌株，在好氧条件下培养菌株，发酵生产乙二醇和/或乙醇酸；所述大肠杆菌基因工程菌由大肠杆菌失活醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得，或者由大肠杆菌过表达醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得。

优选地，利用失活醛氧化酶基因aldA的大肠杆菌基因工程菌生产乙二醇。

优选地，利用失活醇脱氢酶基因yqhD或者过表达醛氧化酶基因aldA的大肠杆菌基因工程菌生产乙醇酸。

优选地，利用过表达醇脱氢酶基因yqhD的大肠杆菌基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸。

优选地，生产乙二醇和/或乙醇酸的发酵培养条件为：将大肠杆菌或大肠杆菌基因工程菌接种到含有木糖酸为碳源的发酵培养基中，发酵温度为25℃-45℃，发酵过程中供氧，维持发酵液的pH值在5.0-7.5之间。通过发酵培养，菌体将木糖酸转化成乙二醇和乙醇酸。

优选地，所述发酵培养基的组成包括：木糖酸5-150g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-20g/L。进一步优选地，所述木糖酸在发酵培养基中的浓度为15-30g/L。

本发明提供的四株大肠杆菌基因工程菌，分别是：E.coli△aldA(通过敲除醛氧化酶基因aldA获得)；E.coli△yqhD(通过敲除醇脱氢酶基因yqhD获得)；E.coli/aldA(通过将醛氧化酶基因aldA与表达载体连接转入大肠杆菌获得)；E.coli/yqhD(通过将醇脱氢酶基因yqhD与表达载体连接转入大肠杆菌获得)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

大肠杆菌利用木糖酸作为碳源进行发酵培养时，木糖酸在胞内代谢生成乙醇酸和/或乙二醇，并在发酵液中积累，具有较高的转化率和生产强度。进一步对大肠杆菌进行醛氧化酶基因aldA以及醇脱氢酶基因yqhD的失活或过表达，能够进一步提高乙醇酸和/或乙二醇的转化率及生产强度。本发明提供的方法生产乙醇酸和/或乙二醇，工艺路线简单，具有较高的底物转化率和较低的副产物含量，生产成本低，具有很好的应用价值和经济效益。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

在本发明的实施方式中，所述敲除是将编码所述醛氧化酶和醇脱氢酶的基因序列替换为链霉素和安普霉素抗性基因。

在本发明的实施方式中，所述敲除在基因组上进行。

在本发明的实施方式中，所述来自大肠杆菌的醛氧化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的实施方式中，所述来自大肠杆菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的实施方式中，所述醛氧化酶基因aldA是通过质粒pDK6进行表达。

在本发明的实施方式中，所述醇脱氢酶基因yqhD是通过质粒pDK6进行表达。

在本发明的实施方式中，链霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的实施方式中，安普霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

获得基因敲除的基因工程菌株分为以下步骤：

步骤一、上下游同源臂的获得(以aldA为例)；

步骤二、抗性片段的获得；

步骤三、同源重组抗性片段的获得；

步骤四、大肠杆菌电击感受态细胞的制备及同源重组片段的电转化；

步骤五、PCR鉴定大肠杆菌△aldA重组子。

获得基因过表达的基因工程菌株(以aldA为例)分为以下步骤：

步骤一、高水平表达载体pDK6的线性化；

步骤二、aldA基因片段的获得；

步骤三、同源重组构建过表达质粒；

步骤四、化转至大肠杆菌DH5α；

步骤五、PCR鉴定pDK6-aldA转化子；

步骤六、提取质粒pDK6-aldA；

步骤七、电转细胞的制备及pDK6-aldA的电转化目的大肠杆菌；

步骤八、PCR鉴定pDK6-aldA转化子。

实施例1

以木糖酸为碳源通过大肠杆菌发酵生产乙二醇和/或乙醇酸。

所用大肠杆菌为野生型菌株W3110、BW25113、S17-1、DH5α、BL21。

将大肠杆菌接种到250mL锥形瓶中，其中装有50mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温37℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

发酵培养基组成为：木糖酸15g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。

对照培养基组成为：木糖15g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。

种子培养12小时，接种到250mL锥形瓶中，内装有50mL发酵培养基或对照培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温37℃。发酵20小时结束，测定采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱，利用视差和紫外检测器检测。流动相为0.05mol/L的稀硫酸溶液，流速0.8mL/min，柱温箱为60℃。发酵结果如表1所示。

表1，发酵罐发酵结果

由表1可以看出，大肠杆菌利用木糖酸为碳源培养能合成乙醇酸和乙二醇；大肠杆菌利用对照培养基中木糖为碳源不合成乙醇酸和乙二醇。

实施例2

以木糖酸为碳源通过大肠杆菌发酵生产乙二醇和/或乙醇酸。所用大肠杆菌为野生型菌株W3110。

发酵培养基组成为：木糖酸30g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁4g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基或对照培养基，保持发酵过程保持通风和搅拌，发酵温度37℃，发酵过程利用补加氨水溶液使发酵液的pH值分别稳定在5.0和7.5，发酵18小时结束，测定采用实施例1所列液相色谱法测定。发酵结果如表2所示。

表2，发酵罐发酵结果

由表2可以看出，大肠杆菌利用木糖酸为碳源在pH5.0-7.5的条件下发酵罐中均能合成乙醇酸和乙二醇。

实施例3

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装有3L发酵培养基，保持发酵过程保持通风和搅拌，发酵温度25℃和45℃，发酵过程利用补加氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在6，发酵26小时结束，采用实施例1方法测定发酵液中组分。发酵结果如表3所示。

表3，发酵罐发酵结果

温度(℃)	乙醇酸(g/L)	乙二醇(g/L)
			25	1.03	4.76
45	4.45	7.81

由表3可以看出，大肠杆菌利用木糖酸为碳源在25℃-45℃发酵罐中均能合成乙醇酸和乙二醇。

实施例4

aldA基因敲除菌株E.coli△aldA的构建

根据已公布的基因组信息序列分别设计序列如引物SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.6，分别以大肠杆菌W3110基因组为模板，采用PCR扩增体系和程序，扩增分别获得aldA上下游同源臂aldA-U-Hom、aldA-D-Hom。

以pIJ773质粒为模板，以SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10为引物，采用PCR扩增体系和程序，获得aldA-FRT-773片段。

aldA-U-Hom、aldA-D-Hom、aldA-FRT-773片段以摩尔量1：1：1的比例加入高保真聚合酶反应体系中进行融合反应，体系中核酸浓度不超过800ng/50μL。融合反应体系不添加引物，其余与PCR反应体系一致。融合反应程序与PCR反应程序除了循环数12个外，其余条件一致。以融合PCR的产物为模板，以SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6为引物，用高保真聚合酶进行扩增，采用PCR扩增体系和程序，得到带同源臂抗性片段aldA-FRT-773。

将DNA片段aldA-FRT-773电转化至大肠杆菌W3110，大肠杆菌中已经含有具有表达Red重组酶的质粒。

以SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12为引物采用PCR扩增体系和程序，PCR鉴定大肠杆菌△aldA重组子，阳性重组子进行测序，比对正确，证明敲除成功，菌株命名为E.coli△aldA。

实施例5

yqhD基因敲除菌株E.coli△yqhD的构建

根据已公布的基因组信息序列分别设计序列引物SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.14。分别以大肠杆菌W3110基因组为模板，采用PCR扩增体系和程序，扩增获得yqhD上下游同源臂yqhD-U-Hom、yqhD-D-Hom。

以pIJ778质粒为模板SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18引物，采用PCR扩增体系和程序，获得yqhD-FRT-778片段。

yqhD-U-Hom、yqhD-D-Hom、yqhD-FRT-778采用实施例4相同的方法进行融合，得到带同源臂抗性片段yqhD-FRT-778。

将DNA片段yqhD-FRT-778电转化至大肠杆菌W3110，大肠杆菌中已经含有具有表达Red重组酶的质粒。

以SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20引物PCR鉴定大肠杆菌△yqhD重组子，阳性重组子进行测序，比对正确，证明敲除成功，菌株命名为E.coli△yqhD。

实施例6

aldA基因过表达菌株E.coli/aldA的构建

根据已公布的基因组信息序列，分别设计序列如SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22，引物5’端带有与线性化表达质粒pDK6序列相同的序列和限制性内切酶EcoRI/HindIII酶切位点。以大肠杆菌基因组为模板，采用PCR扩增体系和程序，获取带同源臂的aldA基因片段。

aldA基因片段与表达载体pDK6分别利用限制性内切酶EcoRI/HindIII进行酶切连接，转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取单菌落，以SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24引物对PCR验证，阳性转化子进行测序，比对正确，证明表达载体构建成功，质粒命名为pDK6-aldA。pDK6-aldA转入大肠杆菌W3110，命名为E.coli/aldA。

实施例7

yqhD基因过表达菌株E.coli/yqhD的构建

与pDK6-aldA构建过程相同，采用的克隆引物分别为SEQ ID NO.25/SEQ IDNO.26，验证引物为SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24，构建获得表达质粒pDK6-yqhD。将pDK6-yqhD转入大肠杆菌W3110，命名为E.coli/yqhD。

实施例8

以木糖酸为碳源通过大肠杆菌野生型以及基因工程菌株发酵生产乙二醇和/或乙醇酸。

所用发酵菌株为：野生型菌株E.coli；aldA基因敲除菌株E.coli△aldA；yqhD基因敲除菌株E.coli△yqhD；aldA基因过表达菌株E.coli/aldA；yqhD基因过表达菌株E.coli/yqhD。

将上述菌株分别接种到15mL试管中，其中装有3mL种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温37℃进行种子培养。

发酵培养基组成为：木糖酸15g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钠2g/L，磷酸氢二钠3g/L。

种子培养12小时，接种到250mL锥形瓶中，内装有50mL发酵培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温37℃。发酵20小时结束，采用实施例1方法测定发酵液中组分。发酵结果如表4所示。

表4，摇瓶发酵结果

菌株	乙醇酸(g/L)	乙二醇(g/L)
			E.coli	0.57	0.65
E.coli0△aldA	0.00	1.25
			E.coli△yqhD	0.73	0.00
E.coli/aldA	3.82	0.25
			E.coli/yqhD	1.50	2.09

由表4可以看出：E.coli△aldA利用木糖酸为碳源在摇瓶发酵中能合成较野生型多的乙二醇，同时不产生乙醇酸。而E.coli△yqhD利用木糖酸为碳源在摇瓶发酵中能合成较野生型多的乙醇酸，同时不产生乙二醇。E.coli/aldA利用木糖酸为碳源在摇瓶发酵中能合成较野生型多的乙醇酸，同时合成少量乙二醇。而E.coli/yqhD利用木糖酸为碳源在摇瓶发酵中能合成较野生型多的乙醇酸和乙二醇。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸的方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 479

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Met Ser Val Pro Val Gln His Pro Met Tyr Ile Asp Gly Gln Phe Val

1 5 10 15

Thr Trp Arg Gly Asp Ala Trp Ile Asp Val Val Asn Pro Ala Thr Glu

20 25 30

Ala Val Ile Ser Arg Ile Pro Asp Gly Gln Ala Glu Asp Ala Arg Lys

35 40 45

Ala Ile Asp Ala Ala Glu Arg Ala Gln Pro Glu Trp Glu Ala Leu Pro

50 55 60

Ala Ile Glu Arg Ala Ser Trp Leu Arg Lys Ile Ser Ala Gly Ile Arg

65 70 75 80

Glu Arg Ala Ser Glu Ile Ser Ala Leu Ile Val Glu Glu Gly Gly Lys

85 90 95

Ile Gln Gln Leu Ala Glu Val Glu Val Ala Phe Thr Ala Asp Tyr Ile

100 105 110

Asp Tyr Met Ala Glu Trp Ala Arg Arg Tyr Glu Gly Glu Ile Ile Gln

115 120 125

Ser Asp Arg Pro Gly Glu Asn Ile Leu Leu Phe Lys Arg Ala Leu Gly

130 135 140

Val Thr Thr Gly Ile Leu Pro Trp Asn Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala

145 150 155 160

Arg Lys Met Ala Pro Ala Leu Leu Thr Gly Asn Thr Ile Val Ile Lys

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Thr Pro Asn Asn Ala Ile Ala Phe Ala Lys Ile Val

180 185 190

Asp Glu Ile Gly Leu Pro Arg Gly Val Phe Asn Leu Val Leu Gly Arg

195 200 205

Gly Glu Thr Val Gly Gln Glu Leu Ala Gly Asn Pro Lys Val Ala Met

210 215 220

Val Ser Met Thr Gly Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Ile Met Ala Thr

225 230 235 240

Ala Ala Lys Asn Ile Thr Lys Val Cys Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ala

245 250 255

Pro Ala Ile Val Met Asp Asp Ala Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys Ala

260 265 270

Ile Val Asp Ser Arg Val Ile Asn Ser Gly Gln Val Cys Asn Cys Ala

275 280 285

Glu Arg Val Tyr Val Gln Lys Gly Ile Tyr Asp Gln Phe Val Asn Arg

290 295 300

Leu Gly Glu Ala Met Gln Ala Val Gln Phe Gly Asn Pro Ala Glu Arg

305 310 315 320

Asn Asp Ile Ala Met Gly Pro Leu Ile Asn Ala Ala Ala Leu Glu Arg

325 330 335

Val Glu Gln Lys Val Ala Arg Ala Val Glu Glu Gly Ala Arg Val Ala

340 345 350

Phe Gly Gly Lys Ala Val Glu Gly Lys Gly Tyr Tyr Tyr Pro Pro Thr

355 360 365

Leu Leu Leu Asp Val Arg Gln Glu Met Ser Ile Met His Glu Glu Thr

370 375 380

Phe Gly Pro Val Leu Pro Val Val Ala Phe Asp Thr Leu Glu Asp Ala

385 390 395 400

Ile Ser Met Ala Asn Asp Ser Asp Tyr Gly Leu Thr Ser Ser Ile Tyr

405 410 415

Thr Gln Asn Leu Asn Val Ala Met Lys Ala Ile Lys Gly Leu Lys Phe

420 425 430

Gly Glu Thr Tyr Ile Asn Arg Glu Asn Phe Glu Ala Met Gln Gly Phe

435 440 445

His Ala Gly Trp Arg Lys Ser Gly Ile Gly Gly Ala Asp Gly Lys His

450 455 460

Gly Leu His Glu Tyr Leu Gln Thr Gln Val Val Tyr Leu Gln Ser

465 470 475

<210> 2

<211> 387

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val

20 25 30

Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp

35 40 45

Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly

50 55 60

Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu

65 70 75 80

Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser

85 90 95

Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu

100 105 110

Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys

115 120 125

Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser

130 135 140

Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg Lys Thr Thr Gly Asp Lys

145 150 155 160

Gln Ala Phe His Ser Ala His Val Gln Pro Val Phe Ala Val Leu Asp

165 170 175

Pro Val Tyr Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val

180 185 190

Val Asp Ala Phe Val His Thr Val Glu Gln Tyr Val Thr Lys Pro Val

195 200 205

Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu

210 215 220

Ile Glu Asp Gly Pro Lys Ala Leu Lys Glu Pro Glu Asn Tyr Asp Val

225 230 235 240

Arg Ala Asn Val Met Trp Ala Ala Thr Gln Ala Leu Asn Gly Leu Ile

245 250 255

Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu

260 265 270

Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val

275 280 285

Leu Pro Ala Leu Trp Asn Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu

290 295 300

Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Glu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln

325 330 335

Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser

340 345 350

Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu

355 360 365

Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu

370 375 380

Ala Ala Arg

385

<210> 3

<211> 1490

<212> DNA

<213> pIJ778 质粒(PIJ778 plasmid)

<400> 3

attttgtagc atttctccag cactctggag aaatagatga ttccggggat ccgtcgacct 60

gcagttcgaa gttcctattc tctagaaagt ataggaactt cgaagttccc gccagcctcg 120

cagagcagga ttcccgttga gcaccgccag gtgcgaataa gggacagtga agaaggaaca 180

cccgctcgcg ggtgggccta cttcacctat cctgcccggc tgacgccgtt ggatacacca 240

aggaaagtct acacgaaccc tttggcaaaa tcctgtatat cgtgcgaaaa aggatggata 300

taccgaaaaa atcgctataa tgaccccgaa gcagggttat gcagcggaaa atgcagctca 360

cggtaactga tgccgtattt gcagtaccag cgtacggccc acagaatgat gtcacgctga 420

aaatgccggc ctttgaatgg gttcatgtgc agctccatca gcaaaagggg atgataagtt 480

tatcaccacc gactatttgc aacagtgccg ttgatcgtgc tatgatcgac tgatgtcatc 540

agcggtggag tgcaatgtca tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc 600

agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta 660

cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt 720

gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 780

ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 840

cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg 900

caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt 960

gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt 1020

tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa 1080

ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg 1140

gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga 1200

gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct agacaggctt atcttggaca 1260

agaagaagat cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgtcc actacgtgaa 1320

aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata agatgccgct cgccagtcga ttggctgagc 1380

tcatgaagtt cctattccga agttcctatt ctctagaaag tataggaact tcgaagcagc 1440

tccagcctac atgactttcg ttttcgggca tttcgtccag acttaagttc 1490

<210> 4

<211> 1369

<212> DNA

<213> pIJ773 质粒(PIJ773 plasmid)

<400> 4

attccgggga tccgtcgacc tgcagttcga agttcctatt ctctagaaag tataggaact 60

tcgaagttcc cgccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 120

agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg 180

ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 240

tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta 300

tgcagcggaa aatgcagctc acggtaactg atgccgtatt tgcagtacca gcgtacggcc 360

cacagaatga tgtcacgctg aaaatgccgg cctttgaatg ggttcatgtg cagctccatc 420

agcaaaaggg gatgataagt ttatcaccac cgactatttg caacagtgcc gttgatcgtg 480

ctatgatcga ctgatgtcat cagcggtgga gtgcaatgtc gtgcaatacg aatggcgaaa 540

agccgagctc atcggtcagc ttctcaacct tggggttacc cccggcggtg tgctgctggt 600

ccacagctcc ttccgtagcg tccggcccct cgaagatggg ccacttggac tgatcgaggc 660

cctgcgtgct gcgctgggtc cgggagggac gctcgtcatg ccctcgtggt caggtctgga 720

cgacgagccg ttcgatcctg ccacgtcgcc cgttacaccg gaccttggag ttgtctctga 780

cacattctgg cgcctgccaa atgtaaagcg cagcgcccat ccatttgcct ttgcggcagc 840

ggggccacag gcagagcaga tcatctctga tccattgccc ctgccacctc actcgcctgc 900

aagcccggtc gcccgtgtcc atgaactcga tgggcaggta cttctcctcg gcgtgggaca 960

cgatgccaac acgacgctgc atcttgccga gttgatggca aaggttccct atggggtgcc 1020

gagacactgc accattcttc aggatggcaa gttggtacgc gtcgattatc tcgagaatga 1080

ccactgctgt gagcgctttg ccttggcgga caggtggctc aaggagaaga gccttcagaa 1140

ggaaggtcca gtcggtcatg cctttgctcg gttgatccgc tcccgcgaca ttgtggcgac 1200

agccctgggt caactgggcc gagatccgtt gatcttcctg catccgccag aggcgggatg 1260

cgaagaatgc gatgccgctc gccagtcgat tggctgagct cataagttcc tattccgaag 1320

ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaagcagctc cagcctaca 1369

<210> 5

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actacaacac tatccgcacc ac 22

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gcttttatac ctccgccgag a 21

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gaagcagctc cagcctacat gagaatcgat accagttcag tgaccgaacc tgttttcac 59

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<212> DNA

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ggtcgacgga tccccggaat cattaccaca tcaatccatg cgtctccacg ccaggtaac 59

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<212> DNA

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gttacctggc gtggagacgc atggattgat gtggtaatga ttccggggat ccgtcgacc 59

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<212> DNA

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gtgaaaacag gttcggtcac tgaactggta tcgattctca tgtaggctgg agctgcttc 59

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<212> DNA

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gccataaatg ttatcggaca gt 22

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acggaagatt cacttatcgt tg 22

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atctgtttgc cgagaatacg c 21

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atgcctttcc atgcttcgac 20

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<212> DNA

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gaagcagctc cagcctacat gactttcgtt ttcgggcatt tcgtccagac ttaagttc 58

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<212> DNA

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ggtcgacgga tccccggaat catctatttc tccagagtgc tggagaaatg ctacaaaat 59

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<212> DNA

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attttgtagc atttctccag cactctggag aaatagatga ttccggggat ccgtcgacc 59

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<212> DNA

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gaacttaagt ctggacgaaa tgcccgaaaa cgaaagtcat gtaggctgga gctgcttc 58

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<212> DNA

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cgatacgctc atgttggctt 20

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caatttcgcc gagttcgtct 20

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ggaggagaga cgtgcgaatt catgtcagta cccgttcaac atcc 44

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atgagcggat acataaagct tttaagactg taaataaacc acctggg 47

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tgtgcaaaag tttcactacg c 21

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ttctcaccgg attcagtcgt c 21

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<213> 引物(primer)

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ggaggagaga cgtgcgaatt catgaacaac tttaatctgc acaccc 46

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<212> DNA

<213> 引物(primer)

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atgagcggat acataaagct tttagcgggc ggcttcgta 39

Claims

1.大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌由大肠杆菌失活醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得，或者由大肠杆菌过表达醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得。

2.利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，其特征在于，该方法为：以木糖酸为碳源利用大肠杆菌或大肠杆菌基因工程菌发酵生产乙二醇和/或乙醇酸；所述大肠杆菌基因工程菌由大肠杆菌失活醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得，或者由大肠杆菌过表达醛氧化酶基因aldA或醇脱氢酶基因yqhD获得。

3.如权利要求2所述的生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，其特征在于：利用失活醛氧化酶基因aldA的大肠杆菌基因工程菌生产乙二醇。

4.如权利要求2所述的生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，其特征在于：利用失活醇脱氢酶基因yqhD或者过表达醛氧化酶基因aldA的大肠杆菌基因工程菌生产乙醇酸。

5.如权利要求2所述的生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，其特征在于：利用过表达醇脱氢酶基因yqhD的大肠杆菌基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸。

6.如权利要求2-5任一项所述的生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，其特征在于：将大肠杆菌或大肠杆菌基因工程菌接种到含有木糖酸为碳源的发酵培养基中，发酵温度为25℃-45℃，发酵过程中供氧，维持发酵液的pH值在5.0-7.5之间。

7.如权利要求6所述的生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：木糖酸5-150g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-20g/L。

8.如权利要求7所述的生产乙二醇和/或乙醇酸的方法，其特征在于：所述木糖酸在发酵培养基中的浓度为15-30g/L。