CN112774742B - 一种血液细胞过滤冲洗装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血液细胞过滤冲洗装置，该装置包括芯片、滤膜、过滤夹持部件和冲洗夹持部件，芯片顺序包括主封闭层、第一芯片和第二芯片，滤膜位于第一芯片和第二芯片之间，第一芯片和第二芯片中包括暴露滤膜的中空结构，过滤夹持部件包括与封闭层夹持接触的第一过滤夹持层和与第二芯片夹持接触的第二过滤夹持层，冲洗夹持部件包括与封闭层夹持接触的第一冲洗夹持层和与第二芯片夹持接触的第二冲洗夹持层，滤膜与第一芯片和所第二芯片之间为不可逆键合。本发明通过流道结构，有效提高了该结构与后续单元的集成效果，减少了细胞损失。

Description

一种血液细胞过滤冲洗装置
技术领域
本发明提供了一种细胞分离装置，具体讲提供了一种血液细胞过滤冲洗装置。
背景技术
外周血中存在的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)及循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)被认为是肿瘤转移和复发的重要原因和标志物。其存在既代表着原发灶肿瘤的侵袭能力，也预示着在远端形成转移灶的可能性。因此，精确检测单位体积内血液中CTC及CTM的数量可为癌症的早期筛查提供重要依据；为肿瘤患者病情发展提供动态监控及预后依据；同时，还可为肿瘤细胞致病机制及耐药机制提供研究窗口。相对于外周血中存在的其他正常血细胞，单位体积中的CTC及CTM的数量极为稀少，比例约为1：109，因此对目标细胞的精确筛选、富集及释放是实现可靠检测的前提。换而言之，对目标细胞的捕捉率以及释放率是影响CTC及CTM的重要指标。
目前，基于形态学富集的膜过滤技术(isolation by size of epithelial tumorcell，ISET)是检测CTC及CTM的主要方法之一。具有操作方法简单、成本较低、富集获的CTC及CTM的生物活性高等优势。但由于CTC细胞直径与部分血液细胞直径相似，仅使用ISET技术会造成富集纯度的降低，因此，ISET技术需将经微孔滤膜富集后的CTC与CTM从滤膜转移至其他操作单元以提高富集指标。鉴于微流控技术的处理单元具有试剂消耗量少、反应分析时间快、成本低、易于集成等优势，因此常作为后续处理单元使用。然而，该技术也存在一些技术弊端，如过滤后的细胞与微孔滤膜不易分离；初始样本的输入量与微流控单元的处理容量两者间不兼容；模块兼容性差造成过滤与后续处理的步骤分离以及细胞损失。
发明内容
针对现有技术中存在过滤后细胞与微孔滤膜不易分离，且分离时导致细胞损失的不足，本发明提供了一种血液细胞过滤冲洗装置。
本发明提供一种血液细胞过滤分离装置，包括芯片、滤膜、过滤夹持部件和冲洗夹持部件，芯片顺序包括封闭层、第一芯片和第二芯片，滤膜位于第一芯片和第二芯片之间，第一芯片和第二芯片中包括暴露滤膜的中空结构；过滤夹持部件包括与封闭层夹持接触的第一过滤夹持层和与第二芯片夹持接触的第二过滤夹持层；第一过滤夹持层包括对应于滤膜的样品入口；第二过滤夹持层包括对应于滤膜的过滤液出口；冲洗夹持部件包括与封闭层夹持接触的第一冲洗夹持层和与第二芯片夹持接触的第二冲洗夹持层；第一冲洗夹持层包括对应于滤膜一侧位置处的侧向冲洗液入口，第一冲洗夹持装置包括对应于滤膜另一侧位置处的冲洗液出口，所述第二冲洗夹持层包括对应于所述滤膜上方处的垂直冲洗液入口和排气口，其改进之处在于：第一冲洗夹持层包括连通侧向冲洗液入口和冲洗液出口的冲洗液流道；滤膜与第一芯片和所第二芯片之间为不可逆键合。
优选的，第二芯片和第二芯片的厚度为0.6mm～3mm；样品入口和样品出口对应滤膜的有效面积小于1cm2；侧向冲洗液入口、垂直冲洗液入口和冲洗液出口的直径为1.5mm～2.5mm；排气口的直径为0.2mm～1mm。
优选的，冲洗液流道与滤膜处于不同平面。第一过滤夹持层包括闭合阀门，冲洗液流道上设置有阀门区域，阀门区域的直径为冲洗液流道宽度的1.1～2倍，深度方向为与闭合阀门曲面配合的弧形曲面。冲洗液流道包括连接所述侧向冲洗液入口的冲洗液入口流道和连接所述冲洗液出口的冲洗液出口流道。
所述冲洗液入口流道为2条或多条，冲洗液出口流道为一条，冲洗液出口流道与冲洗液入口流道的宽度比为冲洗液出口流道与冲洗液入口流道的条数的反比。
优选的，不可逆键合包括热压键合。第一芯片和第二芯片为PMMA，超声键合处理包括将滤膜材料放置于第一芯片和第二芯片之间，固定后放入乙醇或丙酮溶剂中，在低于45℃的温度下，用100W-360W的超声处理不超过3分钟；或者在热压键合前用256nm、0.1J/cm2-10J/cm2的紫外光对第一芯片和第二芯片进行辐照。
本发明提供的技术方案具有以下有益效果：本发明提供的技术方案将微孔滤膜集成于微流控芯片内，通过垂直样本入口和侧向冲洗缓冲液入口这样设置的不同流道解决了微孔滤膜上细胞的释放率低，初始样品用量与后续处理单元承载能力不配套的弊端；克服了上下游模块兼容性差所造成的处理步骤的分离及细胞损失等问题。
附图说明
图1键合前芯片分体图
图2：键合后芯片整体结构图
图3：过滤夹持结构图
图4：冲洗夹持结构图
图5：芯片配合过滤夹持部件使用示意图
图6：芯片配合冲洗夹持部件使用示意图
图7：第一冲洗夹持层的一种俯视结构图
图8：第一冲洗夹持层的另一种俯视结构图；
1.芯片，2.滤膜，3.过滤夹持部件，4.冲洗夹持部件，11.第一芯片，12.第二芯片，13.封闭层，111.第一芯片样本过滤入口，112第一芯片倒角，121.第二芯片过滤液出口，31.第一过滤夹持层，32第二过滤夹持层，41.第一冲洗夹持层，42.第二冲洗夹持层，411.第一冲洗夹持层侧向冲洗液入口，412第一冲洗夹持层冲洗液出口，413.第一冲洗夹持层冲洗液入口流道；414第一冲洗夹持层冲洗腔；415.第一冲洗夹持层冲洗液出口流道；416.第一冲洗夹持层阀门区域，421.第二冲洗夹持层冲洗液垂直入口；422.第二冲洗夹持层排气口。
具体实施方式
本发明提供的血液细胞过滤冲洗装置包括芯片1、滤膜2、过滤夹持部件3和冲洗夹持部件4；如图1所示，芯片1包括第一芯片11、第二芯片12和封闭层13；滤膜2位于第一芯片11和第二芯片12之间，第一芯片11和第二芯片12间的中空结构暴露的滤膜2；如图3所示，过滤夹持部件3包括与封闭层13夹持接触的第一过滤夹持层31，和与第二芯片12夹持接触的第二过滤夹持层32，第一过滤夹持层31对应于第一芯片11的滤膜的样品入口111，第二过滤夹持层32对应于滤膜2的过滤液出口121；如图4所示，冲洗夹持部件4包括与封闭层13直接接触的第一冲洗夹持层41和与第二芯片12夹持接触的第二冲洗夹持层42，第一冲洗夹持层41包括冲洗液侧向入口411和冲洗液出口412；第二冲洗夹持层42包括对应于滤膜上方处的垂直冲洗液入口421和保持压力平衡的排气口422，第一芯片与滤膜及出口侧连接面有倒角112，防止构成液流死区。
第一冲洗夹持层的冲洗液流道，与芯片1的封闭层13直接接触，与滤膜2处于不同平面；第一冲洗夹持层的冲洗液流道包括连接所述冲洗液侧向入口411的冲洗液入口流道413和连接所述冲洗液出口412的冲洗液出口流道415。
为保障冲洗液流动通畅，第一冲洗夹持层的冲洗液出口流道与第一冲洗夹持层的冲洗液入口流道的宽度比为第一冲洗夹持层的冲洗液出口流道与第一冲洗夹持层的冲洗液入口流道的条数的反比。
第一芯片11与第二芯片12间及第二芯片12与滤膜2间的封装为不可逆键合，芯片与过滤夹持装置间为可逆键合。
本发明的微孔滤膜材料为聚对二甲苯(parylene)、聚碳酸脂(PC)或聚对苯二甲酸乙二脂(TETP)。芯片的材料为PMMA(polydimethylsiloxane、PDMS或聚二甲基硅氧烷)。
芯片与微孔滤膜材料间的不可逆键合包括：
1.将微孔滤膜材料置于芯片之间后，用洁净夹固定放入乙醇或丙酮溶剂中，在低于45℃的温度和100W-360W的超声功率下超声处理3min以下；
2.键合预处理：在在波长256nm、强度为0.1J/cm2-10J/cm2的紫外光下辐照进行热压键合。
本发明的一实施方案中，芯片上微孔滤膜材料与底层沟道不在同一平面，用封闭层13封闭第一芯片芯片冲洗夹持层41的微通道；同时为保证13与41紧密连接，不会造成液体泄露，封闭层13的材质为PDMS、PVC或PET柔性薄膜，或经过密封表面处理的PMMA或PC硬质材料。
本发明的一个实施例中，芯片的制作工艺包括，以PMMA为芯片材质、以PDMS为150-300μm厚度的柔性薄膜材质，所述柔性薄膜材料与固化剂的质量比为10:1-14:1；键合方法包括：
1.对经表面硅烷化处理后的PMMA和PDMS柔性薄膜两者待键合的表面朝上放入功率为80-300W的氧气或空气等离子体中表面处理20-90s；
2.再于该PDMS薄膜表面旋涂一层未固化的PDMS薄层后，再与PMMA表面贴合，进行热压键合固化。
本发明提供的血液细胞过滤冲洗装置的过滤冲洗过程如下：
如图5所示，将芯片1以封闭层13、第一芯片11和第二芯片12由上而下的方式放置，并利用过滤夹持部件3固定，第一过滤夹持层31与封闭层13直接接触，第二过滤夹持层32与第二芯片12直接接触。
将样本按箭头所示从第一芯片样本过滤入口倒入，液体自主通入流阻较小的流道，样本通过微滤膜从第二芯片过滤液出口121流出，收集流出部分废液作其他检测，第二芯片过滤液出口121可为集成引流管，在重力和毛细力作用下加快过滤效率。样品过滤完毕后，用缓冲液重复上述过滤步骤。借此过程实现对不同尺度细胞或杂质的分离，小于目标尺寸的细胞及杂质穿过滤膜被滤除或回收，大于目标尺寸的细胞截留在滤膜之上。
移除图3所示过滤夹持部件，将芯片1翻转180°，并利用冲洗夹持部件4将其固定，第一冲洗夹持层41与封闭层13直接接触，第二冲洗夹持层42与第二芯片12直接接触。
关闭第一冲洗夹持层41侧向冲洗液入口411和冲洗液出口412，从第二冲洗夹持层42冲洗液垂直入口421注入PBS磷酸盐缓冲溶液，基于流阻关系注入的缓冲溶液通过滤膜2充满下方腔室进而漫过滤膜2。如此可保证滤膜即使向下形变时，滤膜仍能浸泡于溶液中。而滤膜上的细胞会在重力作用自发脱落，该过程可持续30s-5min。之后关闭第二冲洗夹持层42上的排气口422和冲洗液垂直入口421，开启第一冲洗夹持层41侧向冲洗液入口411以及冲洗液出口412，以200μL/min～1mL/min的流速将洗脱液PBS溶液通入芯片侧向冲洗入口，按此法既可实现过滤膜上无沉积，自发脱落的细胞也能保证了其形态的完整性。
图7和图8所示分别为第一冲洗夹持层的微流通道的两种结构俯视图。其中411为第一冲洗夹持层的侧向冲洗液入口，第一冲洗夹持层的冲洗腔115形状可为圆形或不规则多边形，对应芯片1的滤膜开口形状，其主要目的是配合冲洗液出口，尽量减小芯片滤膜死区。为保证侧向冲洗效率，第一冲洗夹持层的冲洗液侧向入口流道413的数量大于2，设置方式可采用但不限于图7和图8所示的分布方式。
在本发明的一个优选实施方案中，所述芯片结构尺寸为：
第一芯片11和第二芯片12的厚度各为0.6mm-3mm。第一芯片样本过滤入口111的有效面积不大于1cm2，第一冲洗夹持层的冲洗液入口的直径为1.5mm～2.5mm；第一冲洗夹持层的冲洗液入口流道宽度W1：0.8mm～2mm，沟道深度100μm-600μm、第二冲洗夹持层的排气口422直径0.2mm～1mm；第一冲洗夹持层的冲洗液出口流道宽度W2：1mm～3mm；。
方法详细说明如下：第一芯片层和第二芯片层及滤膜不可键合后，将芯片1放入过滤夹持部件中，过滤夹持装置与芯片通过压力实现夹紧密封。待处理样本从上开口倒入实现液体重力方向的过滤，当样品过滤完毕后，用缓冲液重复上述过滤步骤。借此过程实现对不同尺度细胞或杂质的分离，小于目标尺寸的细胞及杂质穿过滤膜被滤除，大于目标细胞将被截留在滤膜上。撤除施加在过滤夹持装置与芯片上的压力，将芯片翻转180°，后放入冲洗夹持装置中，冲洗夹持装置与芯片通过压力实现夹紧密封。关闭第一冲洗加持层侧向冲洗液入口411和第一冲洗加持层冲洗液出口412，从第二冲洗夹持层冲洗液垂直入口421注入PBS磷酸盐缓冲溶液，基于流阻关系注入的缓冲溶液通过滤膜2充满下方腔室进而漫过滤膜2。滤膜上的细胞会在重力作用自发脱落。之后关闭所述冲洗夹持部件4上的第二冲洗加持层的排气口422以及第二冲洗加持层的冲洗液垂直入口422，开启第一冲洗加持层的侧向冲洗液入口411以及第一冲洗加持层的冲洗液出口412，使横向液流将腔室中的细胞转移出芯片。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种血液细胞过滤冲洗装置，包括芯片、滤膜、过滤夹持部件和冲洗夹持部件；所述芯片顺序包括封闭层、第一芯片和第二芯片；所述滤膜位于所述第一芯片和所述第二芯片之间；所述第一芯片和所述第二芯片中包括暴露所述滤膜的中空结构；所述过滤夹持部件包括与所述封闭层夹持接触的第一过滤夹持层和与所述第二芯片夹持接触的第二过滤夹持层；所述第一过滤夹持层包括对应于所述滤膜的样品入口，第二过滤夹持层包括对应于所述滤膜的过滤液出口；所述冲洗夹持部件包括与所述封闭层夹持接触的第一冲洗夹持层和与所述第二芯片夹持接触的第二冲洗夹持层；所述第一冲洗夹持层包括对应于所述滤膜一侧位置处的侧向冲洗液入口；所述第一冲洗夹持层包括对应于所述滤膜另一侧位置处的冲洗液出口，所述第二冲洗夹持层包括对应于所述滤膜上方处的垂直冲洗液入口和排气口，其特征在于：所述第一冲洗夹持层中包括连通所述侧向冲洗液入口和冲洗液出口的冲洗液流道；所述滤膜与所述第一芯片和第二芯片之间为不可逆键合。
2.如权利要求1所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述第一芯片和第二芯片的厚度为0.6mm~3mm；所述样品入口和样品出口对应滤膜的有效面积小于1cm2；所述侧向冲洗液入口、所述垂直冲洗液入口和所述冲洗液出口的直径为1.5mm~2.5mm；所述排气口的直径为0.2mm~1mm。
3.如权利要求1所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述冲洗液流道与所述滤膜处于不同平面。
4.如权利要求3所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述第一过滤夹持层包括闭合阀门，所述冲洗液流道上设置有阀门区域，所述阀门区域的直径为所述冲洗液流道宽度的1.1~2倍，深度方向为与所述闭合阀门曲面配合的弧形曲面。
5.如权利要求4所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述冲洗液流道包括连接所述侧向冲洗液入口的冲洗液入口流道和连接所述冲洗液出口的冲洗液出口流道。
6.如权利要求5所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述冲洗液入口流道为2条或多条，所述冲洗液出口流道为一条，所述冲洗液出口流道与所述冲洗液入口流道的宽度比为所述冲洗液出口流道与所述冲洗液入口流道的条数的反比。
7.如权利要求6所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述不可逆键合包括热压键合。
8.如权利要求7所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述第一芯片和第二芯片为PMMA，热压键合处理包括将所述滤膜材料放置于所述第一芯片和所述第二芯片之间，固定后放入乙醇或丙酮溶剂中，在低于45ºC的温度下，用100W-360W的超声处理不超过3分钟。
9.如权利要求7所述的血液细胞过滤冲洗装置，其特征在于：所述第一芯片和第二芯片为PMMA，在所述热压键合前用256nm、0.1J/cm2-10 J/cm2的紫外光对所述第一芯片和第二芯片进行辐照。
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