CN112763464A - 一种用于对生物延迟发光的光谱测量***及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于对生物延迟发光的光谱测量***及方法，属于光谱测量技术领域。本发明***包括：激发光光源，接收脉冲信号，根据脉冲信号控制所述激发光光源发出预设波长的光源信号，使用光纤将光源信号耦合至光子收集***；光子收集器，将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子，并使用特种光纤束对DL光子进行收集，对收集后的DL光子进行分光后输出光谱图像；控制器，根据光谱图像完成对生物延迟发光的光谱测量。本发明与现有的滤光轮式的DL光谱测量***进行比较，具有能获得DL光子精细光谱延迟曲线，以及测量速度快的优势。
Description
技术领域
本发明涉及光谱测量技术领域，并且更具体地，涉及一种用于对生物延迟发光的光谱测量***及方法。
背景技术
生物延迟发光(Delayed Luminescence，简称DL)是在光束刺激生物后，生物分子发出的400nm到800nm波长范围的弱光，一般延迟时间为ms量级，随着时间衰减，光子数随时间变化曲线呈双曲线，而不是像荧光那样呈指数衰减。有将这种生物发光称为生物光子，但是目前还没有将生物光子发射过程完全阐释清楚，总之，生物内部多种分子原子参与了与这些光子的相互作用，因而具有较宽的分子光谱。因此新陈代谢，基因表达等基础的生物学过程变化都会引起生物光子发射的相关改变，因而与生命健康状态密切相关。
生物光子需要超级灵敏和时间分辨非常高的量子水平单光子探测技术。探测延迟发光的光谱需要分光及更少量的光子测量，因而要求***灵敏度更高。
现今，量子理论和技术的飞速发展，尤其是量子光学理论与实验上的进步，使得量子通讯和量子计算技术得到飞速发展，同时，伴随着单光子探测器，雪崩二极管和增强电荷耦合器件(ICCD)等光子探测装置的更新换代，使得光子探测能力得以步入单光子探测领域，这些探测***的量子效率甚至可以达到90％以上，同时光谱测量和分析技术也是突飞猛进，这些都使得我们在生物学领域测量生物光子的时间特性以及光谱性质提供了有力的手段。
最早的延迟发光在1951年，Strehler BL和Arnold W.在球藻植物样本中观察到，DL与生物的状态密切相关，是包括人、动物、植物、细胞功能状态非常灵敏的指示剂，最近，生物DL技术被用作研究中药品质，植物生长过程以及种子质量，疾病包括肿瘤、白血病诊断方法。
由于生物DL的强度比荧光弱1000倍以上，因而大多采用灵敏度极高的PMT管工作在计数(盖革)模式下，一般用一个高分辨的时间控制***控制光子的采集，人体的延迟发光的时间比植物短而弱，仅仅10ms左右，需要特殊的电路才能实现高时间精度的采集。
DL光子的光谱非常宽，从200nm的紫外到800nm的近红外。因此，对光谱分析是进一步精细化的分析生物状态变化的方法，可以从发射的光子中提取出诸多的光谱和时间信息，提供一种更为有力的解读生物状态，包括人类健康、植物生成以及细胞代谢等过程，诸多信息极其联系的工具，具有重要的研究和应用价值，由于生物的超弱光子辐射强度非常微弱，采用通用光谱测量例如光栅光谱仪的方法或是滤光片过滤的方法，都很难准确获得其光谱，因而，目前对生物超弱光子辐射的研究大多是对发光的强度进行分析，文献应用PMT以及在快门附近的一个滤光片轮装置来测量DL的光谱，用于分析中药的成分以及判别中药材的品质。其它大多数基本上运用这种滤光片轮的方式解决DL光谱采集，在PMT的控制上有所改进，但采集光谱时仍然需要切换滤光片轮，采用了光栅分光的光谱仪采集光谱，然而仅仅能采集开始us内非常强的荧光谱。
为了采集到更多的光子滤光，一般滤光片的带宽30-50nm，因而不能获得DL发射谱的精细结构，从分子光谱的角度，需要1-3nm的分辨率才能辨识分子光谱。
传统的光栅光谱仪配合低噪声高灵敏度的PMT可以采集到生物发光的荧光部分，即激发后马上测量几个us内的，发光强度大的荧光部分，而不能测到之后的延迟发光。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种用于对生物延迟发光的光谱测量***，包括：
激发光光源，所述激发光光源接收脉冲信号，根据脉冲信号控制所述激发光光源发出预设波长的光源信号，使用光纤将光源信号耦合至光子收集***；
光子收集器，所述光子收集器将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子，并使用特种光纤束对DL光子进行收集，对收集后的DL光子进行分光后输出光谱图像；
控制器，所述控制器输出脉冲信号控制激发光光源发出预设波长的光源信号，接收光子收集***输出的光谱图像，根据光谱图像完成对生物延迟发光的光谱测量。
可选的，预设波长的范围为300-550nm。
可选的，耦合的光源信号的光强不超过100mW/cm2。
可选的，光子收集器，包括：
激发收集头，所述激发收集头将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子；
特种光纤束，所述特种光纤束对DL光子进行收集；
光谱仪，所述光谱仪包括：
输入口，所述输入口接收收集的DL光子；
转轮及光栅，所述转轮上设置有光栅，所述光栅用于对收集的DL光子分光，输出光谱图像；
输出口，所述输出口接入光谱图像；
PMT管，所述PMT管传输光谱图像至控制器。
可选的，光谱仪为1:1成像的光谱仪。
可选的，激发收集头为双柱面镜的光子收集头。
可选的，光谱仪的光谱测量范围为350-850nm。
本发明还提出了一种用于对生物延迟发光的光谱测量方法，包括：
使用光纤将预设波长的光源信号进行耦合；
将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子，并使用特种光纤束对DL光子进行收集，对收集后的DL光子进行分光后输出光谱图像；
根据光谱图像完成对生物延迟发光的光谱测量。
可选的，预设波长的范围为300-550nm。
可选的，耦合的光源信号的光强不超过100mW/cm2。
本发明与现有的滤光轮式的DL光谱测量***进行比较，具有能获得DL光子精细光谱延迟曲线，以及测量速度快的优势。
附图说明
图1为本发明一种用于对生物延迟发光的光谱测量***的结构图；
图2为本发明一种用于对生物延迟发光的光谱测量***的光谱收集光纤和激发子***结构图；
图3为本发明一种用于对生物延迟发光的光谱测量***的双柱面镜的光子收集头结构图；
图4a为本发明一种用于对生物延迟发光的光谱测量***的结构图采用精确定位方法校正光谱仪宽狭缝中心波长；
图4b为本发明一种用于对生物延迟发光的光谱测量***的结构图采用精确定位方法校正光谱仪窄狭缝中心波长；
图5为本发明一种用于对生物延迟发光的光谱测量方法的流程图。
具体实施方式
现在参考附图介绍本发明的示例性实施方式，然而，本发明可以用许多不同的形式来实施，并且不局限于此处描述的实施例，提供这些实施例是为了详尽地且完全地公开本发明，并且向所属技术领域的技术人员充分传达本发明的范围。对于表示在附图中的示例性实施方式中的术语并不是对本发明的限定。在附图中，相同的单元/元件使用相同的附图标记。
除非另有说明，此处使用的术语(包括科技术语)对所属技术领域的技术人员具有通常的理解含义。另外，可以理解的是，以通常使用的词典限定的术语，应当被理解为与其相关领域的语境具有一致的含义，而不应该被理解为理想化的或过于正式的意义。
本发明提出了一种用于对生物延迟发光的光谱测量***，如图1所示，包括：
激发光光源，所述激发光光源接收脉冲信号，根据脉冲信号控制所述激发光光源发出预设波长的光源信号，使用光纤将光源信号耦合至光子收集***；
光子收集器，所述光子收集器将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子，并使用特种光纤束对DL光子进行收集，对收集后的DL光子进行分光后输出光谱图像；
控制器，所述控制器输出脉冲信号控制激发光光源发出预设波长的光源信号，接收光子收集***输出的光谱图像，根据光谱图像完成对生物延迟发光的光谱测量。
其中，预设波长的范围为300-550nm。
其中，耦合的光源信号的光强不超过100mW/cm2。
其中，光子收集器，包括：
激发收集头，所述激发收集头将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子；
特种光纤束，所述特种光纤束对DL光子进行收集；
光谱仪，所述光谱仪包括：
输入口，所述输入口接收收集的DL光子；
转轮及光栅，所述转轮上设置有光栅，所述光栅用于对收集的DL光子分光，输出光谱图像；
输出口，所述输出口接入光谱图像；
PMT管，所述PMT管传输光谱图像至控制器。
其中，光谱仪为1:1成像的光谱仪。
其中，激发收集头为双柱面镜的光子收集头。
其中，光谱仪的光谱测量范围为350-850nm。
下面结合实施例及附图对本发明进行进一步的说明：
本发明中激发光源可以采用半导体激光器、氙灯等，控制器包括控制***及***软件等。
本发明的原理包括：
DL激发：激发光光源可以使用半导体激光器或其它能在脉冲信号控制下稳定的发射波长在300-550nm的光源，功率大致几十个毫瓦到几百毫瓦量级；经光纤耦合到激发收集光子头3，产生所需要面积和形状的光斑；对于动植物，光强不要太大，一般<10mW/cm2，不要超过100mW/cm2；
DL收集：被激发的DL光子，经过一根特殊设计的光纤收集到通用光谱仪，收集光纤一头连接在激发收集光子头上，一头接光谱仪5的输入口，因采集样品一般为圆形，收集光纤连接在收集光子头3为大致4.2mm直径的圆形区域，另一头为14*1mm的长方形如图2所示，具体需要根据生物样本采集区域和光谱仪成像需要确定光纤的几何尺寸。
DL光子经狭缝形状的光纤头，以及安装在光谱仪转轮上的分光光栅进行分光，并成像于光谱仪的输出口，采用1:1成像的光谱仪，输出口9是一个与光纤长方头同样大小的狭缝，长*宽同样保持为14*1mm，狭缝后放置PMT管10，由于PMT管的感光阴极面直径大，可以超过20mm，可以保证将从狭缝出射的光子全部收集到PMT，PMT工作于盖革计数模式，可选适当的光谱灵敏度范围，采集光子时，通过控制光谱仪的转轮7来获得需要波长段的光子。
激发光光源，要求激发光源能够快速响应脉冲信号，控制响应时间<1us，半导体激光器以及各种脉冲激光器均能满足要求，氙灯也能实现快速发光的要求，激发光的脉冲宽度应该可以调节，一般在10us到1s的范围内，如果采用脉冲激光器，则脉冲宽度非常短(<10ns)，能量不要超过1mJ/每脉冲(>1ns的脉冲宽度)，并且建议这种激光器谨慎地对人体或者动物进行实验，半导体激光器使用脉冲可以在10us到1s，激发人体或者动物的DL时，光强度控制在100mW/cm2以内，以免造成损害，所以选择大于1mW/cm2，因更低的强度激发的光子数太少，难以测量。
激发光的光斑面积应与激发收集光子头的收集孔对应，光斑直径为孔直径的2倍，以获得均匀的光斑，在单路激发光的情况下，激发光的角度与收集光纤的角度越小越好，以获得更均匀的光斑，如果夹角过大(例如>30o)，则可以将对侧增加一路激发光，以获得均匀的光斑。
光子收集器，生物样本被激发后，向空间4π立体角各向同性地发射微弱的生物光子，由于DL光子非常弱，因而要尽量多地收集到激发后发射的生物光子，需要将一定形状(一般圆形或正方形)面积的生物光子，根据光谱仪适配的孔径角，变换成长方形的狭缝区域，采用特殊设计的光纤束，狭缝的面积等于收集生物光子的面积。
通过双柱面镜将一个正方(或长方)的光子发射区域，如图3所示，成像到光谱仪输入面上，图中W0*H0的发光面经CL1和CL2后成像为一个Wi*Hi的像，CL1对发光物面的放大率是Hi/H0，CL1对发光物面的放大率是Wi/W0，物面的方形变换为长的狭缝状，以利于光谱仪分光谱的实现。
光谱仪的数值孔径越大越好，一般要求>0.2，否则收集到的光子数就会减少，降低采集的SNR，推荐采用宽谱的闪耀光栅，整个仪器在350-800nm的效率>80％，光谱仪的分辨率根据实验需求，一般<1nm即可，重复精度也要求<1nm，前述的Hi，即狭缝的高度，若采用1*14mm的狭缝，匹配狭缝最高为14mm的光谱仪，要求输入狭缝6和输出狭缝9的尺寸一致，例如1:1成像的光谱仪，狭缝大小必须保证一样的尺寸，才能最大限度地收集光子，光谱仪的测量谱范围350-850nm。
光电倍增管须采用面积能够收集到狭缝出射所有光子，14mm长的狭缝需要直径20mm光阴极的PMT。PMT的暗计数<100cps，在350-850nm光谱的量子效率>10。
控制器，包括控制气和***软件，控制***由具有精确时序控制的电路构成，从***软件接收命令和工作参数，然后按照数据采集的要求，通过控制激发光源、光谱仪以及对PMT的光电脉冲计时计数，实现整个采集过程的控制。
要求对一个谱段进行时间分辨率<1us的数据采集，并且能够重复激发和采集这个波段的数据，以提高采集数据的SNR，采集完成后控制光谱仪转轮转动到下一个谱段采集。
***软件设定采集参数：需要至少能够设定一次试验采集的谱段，和每次采集的中心波长；每个中心波长的激发时间、重复激发次数、激发关闭后开始采集时间(us精度)、采集门宽(ms级别)、探测器采集次数/每门等等。
然后下发采集指令到控制器，接收控制器不断回传的采集数据，然后将原始数据进行计算、组合成这个中心波长延迟发光曲线显示到屏幕上。
采集完成后根据采集参数，用反卷积滤波法，解算扫描的各个中心波长曲线数据，得到正确的光谱延迟发光曲线。
激发光光源，实验证明，在延迟发光研究中，波长280nm至532nm之间的激发波长能够产生较大的激发效率(量子效率)，一般短的波长，激发效率更高，超过600nm，激发出生物光子的效率非常低。
如果需要测定生物样本的激发谱，采用氙灯和滤光片轮来改变激发波长或者可调谐的脉冲激光器均是良好的选择。
使用本发明可以采集光谱延迟发光曲线，当激发活体生物时，不宜采用太强的激发光，这时候为了得到更多的光子计数，可以采用多次重复激发和采集条件，以收集更多的从生物样本发出的延迟光子来提高信噪比。
一般生物延迟发光时间从ms到s的量级。例如采集手指腹的发光，大致发光20ms基本降低到10us时的1/100以下。可以设定激发脉冲宽度10ms，采集门宽为20ms，在20ms内，每隔0.2ms采集一次光子计数，这样有100个时间区间，开始的第一个时间区间大约能够平均收到<10个到50个光子引起的脉冲，最后的区间仅仅采集不到1个光子计数。因此，可以重复这个采集进行50次，每次间隔50ms，如此采集条件，可以在第一个时间区间里采集到上千个光子，降低了量子涨落(散粒噪声)。
一般各个中心波长的延迟发光曲线接近双曲线。
使用本发明进行光谱数据的滤波和反卷积，由于使用较宽的狭缝采集延迟发光的光子，得到的(每个波长延迟曲线同一时间区间)光谱响应曲线实际上是真正的光谱曲线与狭缝函数的卷积。需要用反卷积的光谱重建方法得到真正的光谱响应曲线。
测量弱光时最大的噪声是量子涨落引起的散粒噪声。而散粒噪声的幅度与测量到的光子数的方根成正比，因此需要通过增加每个时间区间的实际测量到的光子数来降低噪声。
***的标定技术，采用较宽的狭缝，使得采集中心波长的误差增大，需要进行校正。同时整个***的光谱响应曲线也需要校正。
本发明采用了特制的定位销方法校正中心波长。因光谱仪输入面6的狭缝采用特制的光纤，固定时与光谱仪原有狭缝重合，校正时，将输入面狭缝调整到<0.1mm的宽度，在输出面上，如图4a所示先将一个特殊加工的高精度面板，如4b所示，锁紧于光谱仪的输出面，其狭缝宽与输入缝一样<0.1mm，经过卤素灯的光谱精确校正后，将图4a的宽狭缝面板锁紧于光谱仪的输出面，因为这两个高精度面板对角线两端有定位孔，将圆柱定位销子***面板的孔内，同时对准光谱仪同样高精度加工的底板定位孔，实现高精度复位(复位精度<0.05mm)，由于加工时两个狭缝的位置已经确定，如果窄狭缝刚好在宽狭缝中间并平行，则两个缝的中心波长相等。
本发明还提出了一种用于对生物延迟发光的光谱测量方法，如图5所示，包括：
使用光纤将预设波长的光源信号进行耦合；
将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子，并使用特种光纤束对DL光子进行收集，对收集后的DL光子进行分光后输出光谱图像；
根据光谱图像完成对生物延迟发光的光谱测量。
可选的，预设波长的范围为300-550nm。
可选的，耦合的光源信号的光强不超过100mW/cm2。
本发明与现有的滤光轮式的DL光谱测量***进行比较，具有能获得DL光子精细光谱延迟曲线，以及测量速度快的优势。
本领域内的技术人员应明白，本申请的实施例可提供为方法、***、或计算机程序产品。因此，本申请可采用完全硬件实施例、完全软件实施例、或结合软件和硬件方面的实施例的形式。而且，本申请可采用在一个或多个其中包含有计算机可用程序代码的计算机可用存储介质(包括但不限于磁盘存储器、CD-ROM、光学存储器等)上实施的计算机程序产品的形式。本申请实施例中的方案可以采用各种计算机语言实现，例如，面向对象的程序设计语言Java和直译式脚本语言JavaScript等。
本申请是参照根据本申请实施例的方法、设备(***)、和计算机程序产品的流程图和/或方框图来描述的。应理解可由计算机程序指令实现流程图和/或方框图中的每一流程和/或方框、以及流程图和/或方框图中的流程和/或方框的结合。可提供这些计算机程序指令到通用计算机、专用计算机、嵌入式处理机或其他可编程数据处理设备的处理器以产生一个机器，使得通过计算机或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令产生用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的装置。
这些计算机程序指令也可存储在能引导计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式工作的计算机可读存储器中，使得存储在该计算机可读存储器中的指令产生包括指令装置的制造品，该指令装置实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能。
这些计算机程序指令也可装载到计算机或其他可编程数据处理设备上，使得在计算机或其他可编程设备上执行一系列操作步骤以产生计算机实现的处理，从而在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的步骤。
尽管已描述了本申请的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种用于对生物延迟发光的光谱测量***，所述***包括：
激发光光源，所述激发光光源接收脉冲信号，根据脉冲信号控制所述激发光光源发出预设波长的光源信号，使用光纤将光源信号耦合至光子收集***；
光子收集器，所述光子收集器将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子，并使用特种光纤束对DL光子进行收集，对收集后的DL光子进行分光后输出光谱图像；
控制器，所述控制器输出脉冲信号控制激发光光源发出预设波长的光源信号，接收光子收集***输出的光谱图像，根据光谱图像完成对生物延迟发光的光谱测量。
2.根据权利要求1所述的***，所述预设波长的范围为300-550nm。
3.根据权利要求1所述的***，所述耦合的光源信号的光强不超过100mW/cm2。
4.根据权利要求1所述的***，所述光子收集器，包括：
激发收集头，所述激发收集头将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子；
特种光纤束，所述特种光纤束对DL光子进行收集；
光谱仪，所述光谱仪包括：
输入口，所述输入口接收收集的DL光子；
转轮及光栅，所述转轮上设置有光栅，所述光栅用于对收集的DL光子分光，输出光谱图像；
输出口，所述输出口接入光谱图像；
PMT管，所述PMT管传输光谱图像至控制器。
5.根据权利要求4所述的***，所述光谱仪为1:1成像的光谱仪。
6.根据权利要求4所述的***，所述激发收集头为双柱面镜的光子收集头。
7.根据权利要求4所述的***，所述光谱仪的光谱测量范围为350-850nm。
8.一种用于对生物延迟发光的光谱测量方法，所述方法包括：
使用光纤将预设波长的光源信号进行耦合；
将耦合的光源信号照射至目标生物，采集目标生物被耦合的光源信号激发出的DL光子，并使用特种光纤束对DL光子进行收集，对收集后的DL光子进行分光后输出光谱图像；
根据光谱图像完成对生物延迟发光的光谱测量。
9.根据权利要求8所述的方法，所述预设波长的范围为300-550nm。
10.根据权利要求8所述的方法，所述耦合的光源信号的光强不超过100mW/cm2。
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| CN202011503435.XA CN112763464A (zh) | 2020-12-18 | 2020-12-18 | 一种用于对生物延迟发光的光谱测量***及方法 |
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- 2020-12-18 CN CN202011503435.XA patent/CN112763464A/zh active Pending
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