CN112760322B - 一种水稻组成型强启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻组成型强启动子及其应用。具体地，本发明提供了能够在植物各个组织中表达的启动子Nubi5核酸序列及制备和使用方法。本发明首次揭示植物基因3'端反向序列具有强组成型启动子功能元件。还涉及含有该启动子的表达盒、重组表达载体和获得相应转基因植物的方法。本发明所公开的Nubi5启动子在植物的根、茎、叶、花和种子等器官中都表现很强的活性，在植物转基因领域具有很好的应用前景。

Description

一种水稻组成型强启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域。具体涉及一个水稻组成型强启动子及其应用。

背景技术

随着转基因技术的研究发展，启动子在许多农业方面重要不同物种中得以应用。转基因植物研发成功与否主要取决于几个因素，包括优化细胞培养条件、选择合适的转化方法，以及使用恰当的启动子成为转基因植株转化成功的至关重要的因素（McElroy etal., 1990）。此前，花椰菜花叶病毒CaMV35S组成型启动子已广泛应用在双子叶和单子叶的植物转化体系（Odell et al., 1985; Zhang et al., 1988），当然它也存在在单子叶植物中活力较低的问题（Peterhans et al., 1990）。另外两个目前应用较为广泛的组成型启动子是actin（He et al., 2009）和ubiquitin （Christensen et al., 1996）。许多多聚泛素（Polyubiquitin)启动子已从不同作物中分离获得，包括小麦（Christensen et al.,1996），烟草（Plesse et al.，2001），拟南芥（Callis et al., 1990），向日葵（Binet etal., 1990），马铃薯（Garbarino et al., 1995），西红柿（Rollfinke et al., 1998），水稻（Wang et al., 2003; Sivamani et al., 2006），甘蔗（Wei et al., 2003），大豆（Chieraet al. 2007）。大多数这类启动子的驱动外源基因的表达水平明显高于CaMV35S启动子。例如，研究表明小麦的ubi-1启动子，含有5'-UTR内含子元件，并在单子叶植物中高效表达（Wei et al., 2003; Atkinson et al., 2004）。虽然已从不同作物中克隆到一些启动子，但水稻中高效表达的组成型启动子克隆并不多。本发明利用分子生物学技术与方法，从水稻野生型日本晴品种的基因组中分离一个组成型基因上游1676bp的启动子区域，融合报告基因GUS，通过农杆菌转化方法转入粳稻日本晴品种，利用对不同组织进行GUS染色分析，进一步确定其组成型表达功能。

单子叶植物组成型启动子是植物转基因工程的一个重要资源。所谓启动子，通常是指位于结构基因5'端上游、能够指导RNA聚合酶同模板正确结合、启动基因转录的一段DNA序列。它的核心启动子元件，一般指RNA聚合酶起始转录所必需要的最小DNA序列，包括TATA盒 和CAAT盒。目前大多数启动子构建包括5'内含子和非编码区（UTR)，有助于转基因植株获得增强和特异性表达（Roger et al.,2009）。LOC_Os02g45770对应的基因是OsMADS6，该基因主要是OsMADS6在花分生组织的早期强烈表达，在内稃、浆片、心皮、胚珠的珠被以及花托中可以检测到转录本（Li et al.,2010；Duan et al.,2012)，而该基因3'端具有组成型强启动子元件还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个水稻组成型强启动子及其应用，本发明从日本晴品种中鉴定一个组成型启动子区域，利用这个功能区域改良水稻品质。通过创建了一个全长启动子。并将这个启动子融合报告基因β-葡萄糖醛酸酶基因（GUS基因），导入水稻日本晴品种中，进行GUS组织化学染色分析。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

根据生物信息学手段，利用启动子预测网站（http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/）对LOC_Os02g45770基因的3'端区域的反向序列1676bp长片段进行分析，发现其具普通启动子的功能元件，包括TATA box、CCAAT box 、YACT和TTATTT等元件（见表1）。最后对该段序列进行扩增、载体构建，转化表达验证。最终获得启动子为Nubi5，序列如SEQID NO.1所示。

本发明的具体步聚是：

根据之前的启动子表达区域，设计特异性引物，从水稻日本晴品种基因组中扩增到其启动子，并将它与报告基因GUS编码序列相连构建成融合基因，然后装载到Ti载体pCAMBIA1300中，该载体的图谱及多克隆位点等信息见图2，将构好的载体通过农杆菌转化到日本晴水稻中。通过GUS组织化学染色检测表明，该启动子在根、茎、叶、颖壳、种皮、胚和胚乳中均有表达，从而验证该启动子为组成型启动子。

本发明的优点在于：

本发明提供了一种水稻强组成型启动子，且与传统启动子不同的是该启子功能元件来源于基因的3'端反向序列，并在植物的根、茎、叶、花和种子等器官中都表现很强的活性，在植物转基因领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1 为启动子全长序列图，Nubi5启动子全长1676bp所在LOC_Os02g45770基因区域，从基因区7882bp反向到6206bp之间。

图2为 LOC_Os02g45770基因OsMADS6与内参基因ACTIN的RT-PCR半定量分析图，结果表明目标基因OsMADS6相比ACTIN的表达显示它是一个在种子中特异性表达的基因，而在根、茎、叶、颖壳中没有表达。

图3为植物表达载体图。

图4为植物表达载体pCAMBIA1300-Nubi5转基因阳性植株GUS基因RT-PCR检测结果图。

图5为植物表达载体pCAMBIA1300-Nubi5转基因阳性植株进行GUS组织染色分析结果。

具体实施方式

实施例1：1个启动子全长片段的获得。

日本晴水稻基因组DNA的提取：用日本晴品种水稻分蘖期新鲜的叶片用CTAB法提取其基因组DNA，放置-20℃冰箱溶解保存备用。

以生物信息学网站（http://rice.plantbiology.msu.edu/）上提取LOC_Os02g45770基因组信息，获得其基因3'端反向区域（图1）的基因序列，共计1676bp长度，设计1对特异性引物（见表2），PCR扩增条件是：94℃ 5min; 98℃ 30s, 58.5℃ 30s, 72℃2min,35个循环；72℃ 10min。PCR反应体系：10*KOD buffer 2ul, 10mMdNTP 1.5ul, 10mM引物PrF 2ul, 10mM引物PrR 2ul, 基因组DNA 2ul, KOD polymerase 1ul, 其余补双蒸水至50ul。

表1 全长启动子核心元件分析

表2 本发明设计的引物序列

PCR产物TA克隆到pMD-18T上，详细的操作参见Takara pMD-18T试剂盒操作说明书。连接产物在16℃过夜水浴放置12 h以上，42℃热击转入大肠杆菌DH5a，涂布含有氨苄青霉素(Amp)的LB培养基，37℃过夜，挑选单克隆菌落用含有Amp的LB培养基扩大培养。提取质粒，测序，选择正确序列的载体。

最终从水稻基因组中两端带酶切位点BamHI扩增启动子Nubi5序列，将它平端***HindIII+NcoI双酶切植物表达载体pCAMBIA1301中，形成最终表达载体pCAMBIA1301-Nubi5（如图3）。

实施例2：转基因水稻的RT-PCR分析及GUS组化染色分析

将上述构建载体pCAMBIA1301-Nubi5转化粳稻（日本晴）愈伤组织作为遗传转化的受体材料，利用农杆菌介导水稻幼胚种子愈伤组织实现遗传转化，通过抗性愈伤的筛选、分化和生根等步骤生长阳性植株，具体步骤如下：

1. 外植体：取授粉10-14 d 左右的幼胚，剥壳，用75% 无水乙醇处理3 min后，再用3%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水清洗3-4次，滤纸吸干后，挑胚，接种于N6+2.0 mg/L2, 4-D培养基上，27 ℃暗培养7-15 d。

2. 挑取1-2 mm淡黄色、致密的愈伤组织用作农杆菌转化。

3. 农杆菌侵染：从挑取农杆菌划板，2d后挑取单菌落在含50 mg/ml利福平和50mg/ml卡那霉素的YEB液体培养基（牛肉浸膏 5g/L, 酵母浸出液 1g/L， 蛋白胨 5g/L， 蔗糖 5g/L， MgSO₄.7H₂O 1g/L， pH 7.2.）中，摇床上250 rpm过夜培养，调整OD600读数在0.6～1.0之间；4000×g离心力离心5 min收集菌，并重悬于N6+DS液体培养基中（N6培养基+1mg/L 2,4-D+100μmol/L 乙酰丁香酮），获得农杆菌侵染液，OD600读数约1.0。转移20g胚性愈伤组织到50 mL离心管中，加50 mL农杆菌侵染液，28 ℃培养箱中静置20 min充分感染，倒出液体培养物，将胚性愈伤在滤纸上吹干，转至N6-AS固体培养基（N6固体培养基+ 100μmol/L As）上，26 ℃暗培养3～4 d。

4、抗性愈伤筛选：将侵染的愈伤组织从共培养转移到250 mL三角瓶中，加入终浓度250 mg/L羧苄青霉素溶液，28 ℃暗培养静置30 min，用无菌水清洗3～5次，转移到筛选培养基N6-S培养基（N6培养基+50mg/mL潮霉素）上，28 ℃暗培养生长抗性愈伤组织。

5、再生植株生长：将抗性愈伤组织转移到N6-R（MS基础培养基+0.5mg/L 6-BAP+0.2mg/L NAA）植物再生培养基中，28 ℃光培养15～25天，后转移到生根培养基MS培养基中，28 ℃光培养生长植株，最终获得两种突变体植株，命名为D86-1、D86-2。

为了进一步确认Nubi5启动子是否是属于组成型强表达，我们对转基因苗进行RT-PCR分析及GUS组化染色分析。采集了转基因日本晴水稻植株纯系的根、茎、叶、颖壳和种子，提取RNA，反转录成cDNA做模板，以水稻ACTIN基因作为内参，分析Nubi5启动子驱动的GUS报告基因在转基因水稻的表达情况（图4），从图4中结果得知，由Nubi5驱动的目标基因GUS在水稻植株根、茎、叶、颖壳和种子中均有表达，属组成型启动子。剪取pCAMBIA1301-Nubi5转基因水稻植株的根、茎、叶、颖壳和种子（种子用解剖刀模切），浸没在染色液中，37℃保温3-12 h，转入70%乙醇中脱色2-3次。解剖镜下观察、拍照（图5），可知，结果表达根、茎、叶、颖壳和种子均染上色。

RT-PCR检测引物：其中ACINT基因引物为actinF: 5'-TGTGCTTGATTCTGGTGATGG-3',actinR: 5'-ATCTTCATTAGGCAGTCAGTCAG-3'; GUS基因引物为GusF: 5'-CGGTGATGATAATCGGCTGAT-3', GusR: 5'-CCTGCGTCAATGTAATGTTCTG-3'。ACTIN扩增片段大小为123bp；GUS基因扩增片段大小为186bp。

PCR检测体系的程序：10*天根Mix buffer 12.5, 10mM GusF(对照用ActinF)2ul, 10mMGusR(对照用ActinR) 2ul, Taq polymerase 0.5ul, cDNA 1ul,其余不足补双蒸水至25 ul。PCR反应条件：94℃，预变性2 min; 94℃变性30 s， 58℃退火30 s，72℃延伸30 s，28个循环；72℃延伸10 min。

以上结果表明，启动子Nubi5加外源基因GUS可以使目的基因在植株全组成表达，因此Nubi5启动子在转基因工程中具有良好的应用前景。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 一种水稻组成型强启动子及其应用

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1676

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcaaacag ctagcagtag cttacacaca aaaacataca gattaaaggg ccacgcaaga 60

ccattaggtg gctcgcagag agatccgaga tacatgtagc ccactccaca tcccttttat 120

tattagctcc aacttctgac agctgatcga tggctgctta gctcaaagaa cccatcccag 180

catgaagttg ttctctgcac ctgcaggggc agtgctcctc tgaatagtgt ttgcttcagc 240

aggcacaaat tgatgaggat acctagtaac ataatcgttt ttcagataat ataatggaag 300

caagatatac acagtcagtt tgatgagaat ctttcattag ttctactagt tcggatgctg 360

tgatcgagct gtatgcattt gagctagaag ttataagtat atgcatttct ggtcttggct 420

tttcttgatt aatcttaccc aatttgcaag gtgggttcag agtccatggc cgcggagtgt 480

ggcggcggct gcacgtatgc ggcgccattc tccaccacgg cgccctgagc ccaggaggct 540

tgctgcatgg ctctgtagtt gctggtggaa ccttcaacct cgagctgcag cattggatat 600

gagaatatat gaatgaaaat tatcaataaa taattatatg tgcaccgcat tggcataaca 660

gatttccgag tgaataagaa ccttgtgctt gagttgccta ttaatttcac ccagctgacg 720

ctcctgtggc acaagaaaaa tatattggag atagtataat atgtaacaac tctcatgaaa 780

gaaatctctc gcaagaacga agctaccatt tctttagtta tacagtcaaa ggctacacga 840

tctaccctaa ttaacttgca tgcggtatac cctagcagcc ttgctggcaa tatagatgca 900

ttgtcaaagc tagccaagtc atttcgtggt ttaatttaga ttatcactag tagctagcac 960

tcctgaagtc acccgcccat ggcaatgctg atactgtatg tatgcttgag aaactttgga 1020

ttgataatgt acctttctgc gaagttcctc cacttgttcc atcatcagtt gcgtctgcac 1080

aaaaaccatt caagcacagt catattgagt tgacagtaat ataatgaagt gtagattata 1140

tccagtttct gaactttcat gtgttctacc tagctatttc ttgggatctt ttatggtcct 1200

tgggagattt tgaagcatgt acgacgcacc acaaaatgaa tactagtgta tatttaatct 1260

ctctacctct atccttcaaa gttctatttt ctttgggtta ttcacttatt ctttttttag 1320

cagctaaatt ttcctgaaac tccagaattg aagccatatt atttcatcag ctactcattg 1380

tcattactat ccttgttgac gggattgtca tgcagctttg aagtgtttta ttttgaaaag 1440

agtaaacata taattattaa ttagcctaaa caagcagcca taagtagtag tatatctgaa 1500

attgacagtt tagattaatg ttgcagttgc tcggccctgt cactacacat gtatccatat 1560

aaagaaaaag ggcatgcgtg ctagccattc tatatttcta ttctatactt agatagtctt 1620

ttatatgaaa tttagtgcca ctgtatgcat caccttcgtg cctagaatag ggtgaa 1676

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgcaaacag ctagcagtag ctt 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcaccctat tctaggcacg aag 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtgcttgat tctggtgatg g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcttcatta ggcagtcagt cag 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggtgatgat aatcggctga t 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgcgtcaa tgtaatgttc tg 22

Claims (2)

1.一种水稻组成型强启动子，其特征在于：所述启动子为Nubi5，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的一种水稻组成型强启动子在转基因水稻中的应用。

Images