CN112752571A - 组合物和治疗方法 - Google Patents

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CN112752571A CN201980057728.9A CN201980057728A CN112752571A CN 112752571 A CN112752571 A CN 112752571A CN 201980057728 A CN201980057728 A CN 201980057728A CN 112752571 A CN112752571 A CN 112752571A
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Abstract

本发明涉及用于治疗或控制炎症和/或疼痛的组合物，其包含能够形成纳米颗粒的聚合物和抗炎和/或止痛剂。本发明还涉及聚六亚甲基双胍的新用途。

Description

组合物和治疗方法
技术领域
本发明涉及用于炎症和/或疼痛的局部治疗的组合物。
背景技术
尽管药物制剂已经有了许多发展，但是局部应用的抗炎药和止痛药仍然存在渗透性差以及因此导致的功效差的问题。增加局部用药物的剂量水平通常会引起过敏反应并且由于与活性药物成分(API)的较高剂量相关的生产成本的增加而不合需要。尽管局部给药抗炎药和镇痛药存在问题，但只要可以改善API的渗透性，使其可以被递送至遭受炎症或疼痛的个体的肌肉或关节，它仍然是理想的给药途径。
本发明的目的是解决与炎症和/或疼痛的治疗和控制有关的上述问题中的一个或多个。本发明的另一个目的是提供炎症和/或疼痛的治疗。本发明的又一个目的是提供一种允许更好地渗透或递送抗炎和/或止痛剂的治疗方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种能够形成纳米颗粒的聚合物和抗炎和/或止痛剂。
该聚合物包括线性和/或支化或环状的聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物。
通过由聚合物和抗炎和/或止痛剂形成纳米颗粒，本发明人有利地发现，可以增强抗炎和/或止痛剂向角质层中和透过角质层的递送。
优选的是，聚合物包括线性和/或支化或环状的聚单胍(polymonoguanide)/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物。线性和/或支化或环状的聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物可以根据下式1a或式1b，其中在下表A和B中提供了示例：
式1a
Figure BDA0002960631150000011
式1b
Figure BDA0002960631150000021
其中：
“n”是指聚合物的重复单元数，并且n可以为2至1000不等，例如为2或5至10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900；
G1和G2独立地表示包含双胍或胍的阳离子基团，其中L1和L2直接连接至胍的氮原子。因此，双胍或胍基团是聚合物骨架的组成部分。双胍或胍基团在式1a中不是侧链部分。
阳离子基团的示例：
双胍
Figure BDA0002960631150000022
(如在PHMB中)
或者
胍
Figure BDA0002960631150000023
(如在PHMG中)
在本发明中，L1和L2是聚合物中G1和G2阳离子基团之间的连接基团。L1和L2可以独立地表示含有C1-C140碳原子的脂族基团，例如烷基基团，如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140、烷基；或L1和L2可以(独立地)为C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)、脂环基、杂环基、芳族基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基，或L1和L2可以(独立地)为可选地被一个或多个(优选一个)氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部打断的聚亚烷基团。合适的L1和L2的示例是表A中列出的基团。
L1、L2、G1和G2可以使用脂族基、脂环族基、杂环基、芳基、烷基芳基和氧化烯基进行修饰。
N和G3优选为端基。典型地，用于本发明的聚合物具有末端氨基(N)和氰基胍(G3)或胍(G3)端基。这种端基可以通过与脂族基、脂环族杂环基、杂环基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基连接来修饰(例如用1,6-二氨基己烷、1,6二(氰基胍基)己烷、1,6-二胍基己烷、4-胍基丁酸改性来修饰)。另外，端基可以通过与受体配体、葡聚糖、环糊精、脂肪酸或脂肪酸衍生物、胆固醇或胆固醇衍生物或聚乙二醇(PEG)连接来修饰。可选地，所述聚合物的端部可以是在N和G3位置处为胍或双胍或氰基胺或胺或氰基胍，或者在N处为氰基胺且在G3位置处为氰基胍，或者在N处为胍且在G3位置处为氰基胍，或在G3处为L1胺且在N处为氰基胍。G3可以是L1-胺、L2-氰基胍或L2-胍。取决于合成期间的聚合数(n)或聚合物链的断裂数和副反应，作为示例可以举出如上所述的端基的非匀质混合物。因此，如上所述，N和G3基团可以互换/呈现为非匀质混合物。可替代地，N和G3可以不存在，并且聚合物可以是环状的，在这种情况下，相应的末端L1和G2基团彼此直接连接。
在式1b中，X可以存在或不存在。L3、L4和X如上针对“L1或L2”所述。因此，L3和L4以及X是聚合物中G4和G5阳离子基团之间的连接基团。L3和L4以及X可以独立地表示含有C1-C140碳原子的脂族基团，例如烷基基团，如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140、烷基；或L3和L4以及X可以独立地为C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)、脂环基、杂环基、芳族基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基，或L3和L4以及X可以独立地为可选地被一个或多个(优选一个)氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部打断的聚亚烷基团。合适的L3和L4以及X的示例是表B中列出的基团。
“G4”和“G5”是阳离子部分，可以相同或不同。其中至少一个是双胍部分或氨基甲酰基胍，而另一部分可以是如上所述(双胍或氨基甲酰基胍)或胺。为了避免疑义，在式1b中，阳离子部分G4和G5不包括仅单胍基。例如，G4和G5通常不含单胍基。这样的化合物的示例是如表B中所列出的聚烯丙基双胍、聚(烯丙基双胍-共-烯丙胺)(poly(allylbiguanidnio-co-allylamine))、聚(烯丙基氨基甲酰基胍-共-烯丙胺)(poly(allylcarbamoylguanidino-co-allylamine))、聚乙烯基双胍。
聚烯丙基双胍的示例如下所示：
Figure BDA0002960631150000031
在聚烯丙基双胍的情况下，L3和L4相同，G4和G5相似，因此聚烯丙基双胍可简化如下。
Figure BDA0002960631150000041
聚(烯丙基氨基甲酰基胍-共-烯丙胺)的示例如下所示
Figure BDA0002960631150000042
用于本发明的聚合物通常会具有与其相关的反离子(counter ion)。合适的反离子包括但不限于：卤化物(例如氯化物)、磷酸盐、乳酸盐、膦酸盐、磺酸盐、氨基羧酸盐、羧酸盐、羟基羧酸盐、有机磷酸盐、有机膦酸盐、有机磺酸盐和有机硫酸盐。
用于本发明的聚合物可以是数“n”不同的聚合物的非匀质混合物，或者是通过标准纯化方法纯化的含有特定数“n”的匀质部分。如上所述，聚合物也可以是环状的并且另外可以是支化的。
“n”的优选数包括2至250、2至100、2至80和2至50。
Figure BDA0002960631150000043
Figure BDA0002960631150000051
表A.由式1a产生的聚合物类似物的示例。
Figure BDA0002960631150000061
例如，由式1a产生的化合物的CAS号
Figure BDA0002960631150000062
表B.由式1b产生的聚合物类似物的示例。
本发明的方法中使用的聚合物可以包括线性、支化或树枝状分子。该聚合物可以包括线性、支化或树枝状分子的组合。所述聚合物可以包括式1a或式1b的分子中的一种或任意组合，例如如上所述。
例如，所述聚合物可以包括聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)或聚亚乙基六亚甲基双胍(PEHMB)中的一种或多种。表A和表B中列出了一些示例。
因此，所述聚合物可以包括聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)、聚亚乙基六亚甲基双胍(PEHMB)、聚亚甲基双胍(PMB)、聚(烯丙基双胍-共-烯丙基胺)、聚(N-乙烯基双胍)、聚烯丙基双胍中的一种或多种的匀质或非匀质混合物。
最优选的聚合物包括聚六亚甲基双胍(PHMB)。
在一种实施方式中，抗炎和/或止痛剂包含相同的活性药物成分。对于本领域技术人员显而易见的是，已证明某些抗炎剂也具有止痛特性。在其他实施方式中，组合物包含单独的抗炎剂和单独的止痛剂。
抗炎剂可包括多种不同类型的抗炎剂，包括甾体抗炎剂(SAID)和非甾体抗炎剂。在某些实施方案中，优选地，抗炎剂包括非甾体抗炎剂(NSAID)。这样的NSAID可以选自以下的一种或多种：阿斯匹林(Anacin、Ascriptin、Bayer、Bufferin、Ecotrin、Excedrin)；水杨酸胆碱和水杨酸镁(CMT、Tricosal、Trilisate)；水杨酸胆碱(Artliropan)；塞来昔布(Celebrex)；双氯芬酸钾(Cataflam)；双氯芬酸钠(Voltaren、VoltarenXR)；双氯芬酸钠和迷索前列醇(Arthrotec)；二氟尼酸(Dolobid)；依托度酸(Lodine、LodineXL)；非诺洛芬钙(Nalfon)；氟比洛芬(Ansaid)；布洛芬(Advil、Motrin、MotrinIB、Nuprin)；吲哚美辛(Indocin、IndocinSR)；酮洛芬(Actron、Orudis、OrudisKT、Oruvail)；水杨酸镁(Arthritab、BayerSelect、Doan'sPills、Magan、Mobidin、Mobogesic)；甲氯灭酸钠(Meclomen)、甲灭酸(Ponstel)；美洛昔康(Mobic)；萘丁美酮(Relafen)；萘普生(Naprosyn、Naprelan)；萘普生钠(Aleve、Anaprox)；奥沙普秦(Daypro)；吡罗昔康(Feldene)；罗非昔布(Vioxx)；双水杨酯(Amigesic、Anaflex750、Disalcid、Marthritic、Mono-Gesic、Salflex、Salsitab)；水杨酸钠(各种类型)；舒林酸(Clinoril)；托美丁钠(Tolectin)；以及伐地考昔(Bextra)。
优选地，抗炎和/或止痛剂包括选自以下的一种或多种：雷帕霉素、他克莫司、布洛芬、环孢菌素、双氯芬酸、萘普生及其相关衍生物和盐。
最优选的抗炎和/或止痛剂是双氯芬酸及其相关衍生物和盐。双氯芬酸可以是双氯芬酸钾(Cataflam)、双氯芬酸钠(Voltaren、Voltaren XR)、或双氯芬酸盐与另一种药物活性成分的组合(例如与迷索前列醇的组合(以Arthrotec品牌销售))的形式。
如果抗炎和/或止痛剂包含双氯芬酸及其相关衍生物和盐，则平均均值直径(average mean diameter)可以在约50至250nm的范围内。优选地，纳米颗粒的平均均值直径将在100至200nm的范围内，更优选地，纳米颗粒的平均均值直径将在125至175nm的范围内，最优选地，平均均值直径为约150nm和/或平均众数直径(average modal diameter)约为138nm。
形成的纳米颗粒可以含有抗炎剂和/或止痛剂和/或在抗炎和/或止痛剂的存在下形成。可以使用各种方法来形成纳米颗粒，并且可以设想将纳米颗粒形成为聚合物和抗炎和/或止痛剂复合物。然而，聚合物纳米颗粒可以独立形成，然后与抗炎和/或止痛剂一起孵育，使得其吸收或附着在纳米颗粒上。可替代地，可以在与抗炎和/或止痛剂一起孵育期间形成纳米颗粒。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，组合物可以进一步包含以下组分的一种或多种：缓冲剂、赋形剂、粘合剂、油、水、乳化剂、甘油、抗氧化剂、防腐剂和香料或通常局部用霜、凝胶、膏喷雾、粉末、泡沫或摩丝中出现的任何其他组分。此外，该组合物可以是多种形式，例如糊剂或用于喷雾装置的悬浮液。优选地，该组合物是局部施用的。
该组合物可以用作药物。这样的药物可以包括局部用药物。
该组合物可以用于治疗或控制炎症和/或疼痛。
在本发明的相关方面，提供了用于在炎症和/或疼痛的治疗或控制中使用的组合物，该组合物包含能够形成纳米颗粒的聚合物和抗炎和/或止痛剂。
在本发明的相关方面，提供了用于治疗或控制炎症和/或疼痛的组合物，该组合物包含能够形成纳米颗粒的聚合物和抗炎和/或止痛剂。
进一步与本发明的第一方面有关，提供了包含能够形成纳米颗粒的聚合物和抗炎和/或止痛剂的组合物在制造或制备用于治疗或控制炎症和/或疼痛的药物中的用途。
这样的炎症和/或疼痛可以是肌肉的或骨骼的。该组合物可用于治疗或控制肌腱、韧带、肌肉和关节的创伤、风湿病、关节痛或关节炎。
根据本发明的另一方面，提供了聚六亚甲基双胍(PHMB)在药物的制备中形成含有抗炎和/或止痛剂或与抗炎和/或止痛剂关联的一种或多种纳米颗粒的用途。
纳米颗粒可以用作向患病区域递送抗炎和/或止痛剂的载体。患病区域可以是肌肉区域或骨骼区域。炎症和/或疼痛可包括肌腱、韧带、肌肉和关节的创伤、风湿病、关节痛或关节炎。
根据本发明的另一方面，提供了一种制备用于治疗或控制炎症和/或疼痛的组合物的方法，该方法包括在适合于形成纳米颗粒的条件下，将能够形成纳米颗粒的聚合物与抗炎和/或止痛剂混合。
优选的是，该方法用于制备本文中如上所述的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗或控制炎症和/或疼痛的组合物，该组合物包含由PHMB和抗炎和/或止痛剂形成的纳米颗粒或纳米颗粒缀合物。
在本发明的相关的第一方面，提供了由PHMB和抗炎和/或止痛剂形成的纳米颗粒或纳米颗粒缀合物在制造或制备用于治疗或控制炎症和/或疼痛的药物中的用途。
PHMB(聚六亚甲基双胍)被认为是安全有效的杀生物剂，并被用作消毒剂和防腐剂：US7897553、US 4758595、US2008261841；和US 20040009144。还发现PHMB和相关分子是有用的进入促进剂。令人惊奇地观察到，PHMB(例如)本身进入各种细胞，包括细菌、真菌和哺乳动物细胞。更令人惊讶的是，PHMB(例如)能够形成含有范围广泛的分子的纳米颗粒并将这些分子递送到PCT/GB2012/052526这样的细胞中。最后，发现所递送的范围从核酸到小分子的分子在细胞内部发挥作用。此外，用某些天然产物分子(如视黄酸和维生素C)进行的研究证明了对天然产物的稳定作用的增强，因此它们在与PHMB结合时不太可能分解。
在此，我们概括性地描述了能够渗透到角质层中并且透过角质层的抗炎和/或止痛剂与形成纳米颗粒的PHMB的制剂的发明。
具体实施方式
现在将仅通过举例的方式，参考以下实验和附图来描述本发明的实施方式，其中：
图1为显示了如实施例1中所述的双氯芬酸和Nanocin的制剂颗粒尺寸(z-平均值)与多分散性指数(PDI)的图；
图2a是LM10拍摄双氯芬酸和PHMB颗粒的图像，而图2b是显示如实施例1中所述的在20％乙醇中双氯芬酸/Nanocin制剂的颗粒群的LM10分布与尺寸的图；
图3显示了如实施例1中所述的脱水的双氯芬酸纳米颗粒的SEM显微照片(以10kV，10Kx Mag成像)；
图4显示了如实施例1中所述的WETSEM胶囊中的纳米颗粒的反向散射图像(以30kV，4.6kx Mag成像)；
图5是显示如实施例1所述的在2、4和24小时的时间内对TNF-α、IL-8和IL-1α响应研究的LPS剂量(0至1ug/ml)的图；
图6是显示如实施例1所述的在2h、4h和24h时THP-1细胞中对LPS的IL-8响应的图；
图7是显示如实施例1所述的在2h、4h和24h时THP-1细胞中对LPS刺激的TNF-a响应的图；
图8a是显示在用LPS刺激THP-1细胞24h后所有API的IL-8水平与剂量-响应的图，图8b是显示在API存在下用THP-1细胞进行LPS暴露24h后的IL-8刺激的图(其中，样品被稀释1/5)，图8c是显示在10ug/ml LPS存在下各种抗炎药(30ug/ml)孵育24小时后THP-1细胞中的IL-8释放的图(IL-8水平用细胞计数归一化)，图8d是显示在有和没有Nanocin并存在各种API的情况下用THP-1细胞进行LPS暴露24h后的IL-8刺激的图，图8e是显示在有和没有Nanocin(100μg/ml)并存在30ug/ml的各种API的情况下LPS刺激的THP-1细胞孵育24小时后的活细胞数的图，图8f是显示在有Nanocin的情况下，在2h和24h时不同时间的THP-1细胞活力的图；
图9是显示如实施例1中所述的在有和没有Nanocin并存在或不存在双氯芬酸的情况下，THP-1对LPS刺激的响应的图(用细胞计数归一化后的IL-8响应)；
图10是显示如实施例1中所述的IL-8分泌(按响应顺序)的图；
图11是显示如实施例1中所述的在有和没有Nanocin并存在或不存在双氯芬酸的情况下，THP-1对LPS刺激的响应的图(用细胞计数归一化后的TNF-a响应)；
图12是显示如实施例1中所述的TNF-α分泌(按响应顺序)的图；
图13是显示如实施例1中所述的NaCl2样品强度的图；
图14是显示如实施例1中所述的平均NaCl2样品强度的图；
图15是显示如实施例1中所述的双氯芬酸+Nanocin和单独的双氯芬酸渗透到角质层中的横截面图；
图16显示了实施例2中所用的用于化学成像的样品制备的示意图；
图17显示了实施例2中所用的横截面分析和胶带剥离分析；
图18显示了实施例2中所述的示例截面图像(H&E染色)；
图19显示了如实施例2中所述的对API+Nanocin使用ToF-SIMS化学成像进行的横截面分析。
图20显示了如实施例2中所述的对他克莫司+Nanocin使用ToF-SIMS化学成像进行的横截面分析；
图21显示了如实施例2中所述的对双氯芬酸+Nanocin使用ToF-SIMS化学成像进行的横截面分析；
图22a-22c显示了显示如实施例2中所述的API+胶带剥离分析的图，图22a显示了正负离子谱(positive and negative spectra)中的环孢菌素+Nanocin，图22b显示了正负离子谱中的雷帕霉素+Nanocin，图22c显示了正负离子谱中的他克莫司+Nanocin；
图23a-23c显示了实施例2中描述的API+FITC-Nanocin胶带剥离分析的荧光显微照片，图23a显示了对照TS 1和TS 2的显微照片，图23b显示了他克莫司+FITC-Nanocin的TS1和TS 2的显微照片，图23c显示了双氯芬酸+FITC-Nanocin的TS 1和TS 2的显微照片；
图24显示了如实施例2中所述的以三个重复使用ToF-SIMS化学成像对双氯芬酸+Nanocin TS 1进行的横截面分析；
图24显示了如实施例2中所述的以三个重复使用ToF-SIMS化学成像对双氯芬酸+Nanocin TS 2进行的横截面分析；
图25显示了如实施例2中所述的以三个重复使用ToF-SIMS化学成像对双氯芬酸+Nanocin TS 2进行的横截面分析；
图26显示了如实施例2中所述的以三个重复使用ToF-SIMS化学成像对双氯芬酸+Nanocin TS 3进行的横截面分析；
图27显示了如实施例2中所述的以三个重复使用ToF-SIMS化学成像对双氯芬酸TS1进行的横截面分析；
图28显示了如实施例2中所述的以三个重复使用ToF-SIMS化学成像对双氯芬酸TS2进行的横截面分析；
图29显示了如实施例2中所述的以三个重复使用ToF-SIMS化学成像对双氯芬酸TS3进行的横截面分析；
图30显示了如实施例2中所述的使用ToF-SIMS化学成像进行的横截面分析，所述ToF-SIMS化学成像用于：a)对照样品(空白)1，b)对照样品(空白)2，c)双氯芬酸样品1，d)双氯芬酸样品2，e)双氯芬酸+Nanocin 1，f)双氯芬酸+Nanocin 2，g)双氯芬酸+Nanocin 3，和h)双氯芬酸+Nanocin 4；
图31显示了人与猪的双氯芬酸和Nanocin分布(％)的图。通过定量LC-MS分析样品中双氯芬酸的存在。计算每个样品中发现的药物相比于已应用至Franz扩散池上室的总量的比例(％)；和
图32是显示在人皮肤研究中对环氧合酶1的抑制的图。根据制造商的说明，使用Abcam的分析试剂盒确定环氧合酶-1(Cox-1)抑制。确定Cox-1的抑制百分比，并归一化到溶媒单独处理的平均值。
实施例
实施例1-将抗炎药与Nanocin进行药物重配用作治疗剂
背景
选择了一个研究程序来对与
Figure BDA0002960631150000111
(英国Tecrea Ltd)(聚六亚甲基双胍(PHMB))一起配制的多种抗炎药进行筛选，以确定哪种对于作为治疗和控制炎症和/或疼痛的治疗剂向前推进是最佳的。活性药物成分(API)/Nanocin的选择过程由以下研究程序确定：
·在水和乙醇溶媒中的溶解性。
·所选的API与Nanocin的配制，关注颗粒的形成、尺寸和质量。
·使用电子显微镜确认目的制剂的纳米颗粒的形成。
·测量API的抗炎活性，并确定nanocin不会拮抗这种作用。
还使用了局部皮肤施用研究来确定对API进行配制是否会增强API向皮肤中的递送。
选择了不同类别的五种抗炎药进行初步筛选，所述五种抗炎药的详细信息见下表1。
Figure BDA0002960631150000112
Figure BDA0002960631150000121
表1
确定了每种化合物在乙醇和水中的溶解性，并在下表2中显示：
Figure BDA0002960631150000122
表2(其中X＝不溶，Y＝可溶)
然后，由于Celcoxib的不溶性，从该程序中去掉了Celcoxib，但作为替代品，测试了布洛芬(一种非选择性COX抑制剂，在水和乙醇中具有更好的溶解性)。
配制工作
由于双氯芬酸(D)最易溶，因此首先将双氯芬酸与Nanocin一起配制。测试了双氯芬酸与Nanocin的比例(D:N)，并显示了不同比例下颗粒尺寸的变化。然而，如图1所示，多分散性指数(混合物中纳米颗粒尺寸变化的量度)仅在1:1mg/ml混合物中报告为“良好”。
双氯芬酸和Nanocin在20％乙醇中的比例为1:1mg/ml时产生了不透明溶液，最初认为这是由于不溶性引起的，但是在30％乙醇溶媒和水中也会发生这种情况。
当通过Nanosight LM10(纳米颗粒检测机)处理组合的制剂时，样品太亮而无法读取，但冲出样品后，有迹象表明有很多纳米颗粒。必须将制剂以1:100的比例稀释，以达到可被扫描的纳米颗粒水平。即使在这种稀释下，颗粒数也以数十亿个/ml计(见图2a)。
来自LM10以及DLS的数据表明，该制剂的均值颗粒尺寸约为150nm，众数(来自LM10)为138nm。在1:1mg/ml溶液以1:100稀释时，颗粒数为7×109个颗粒/ml。从DLS上看，多分散性指数被描述为是良好的。群体分布可见于图2b。
双氯芬酸制剂的EM分析
该制剂还在英国EM Support Systems Ltd的扫描电子显微镜(SEM)下进行了检测。首先是镀金干燥样品，然后使用WET SEM。
图3所示的电子显微照片显示，脱水后颗粒在100-300nm之间。具有纳米颗粒之间的桥接，其是在脱水过程中发生的，但也可能部分是由尚未形成纳米颗粒的残留聚合物引起的。
纳米颗粒的WETSEM成像成功完成，并获得了图像。图4显示了溶液中的纳米颗粒的反向散射图像。正如预期的那样，对比度非常低，这是因为纳米颗粒仅由聚合物组成，而没有能够提供更大对比度的较重元素，不过可以看到单独的颗粒。另外，观察到了一些聚集或较密区域，这可能是因为存在游离聚合物，所述游离聚合物也将带电并被吸引到胶囊的表面。
用其他API进行配制
当将其他API与Nanocin以0.33:1mg/ml或1:1mg/ml(API:Nanocin)的浓度配制时，有证据表明两种浓度中均形成了纳米颗粒。
下表3显示了0.33:1mg/ml的API:Nanocin的DLS数据。
Figure BDA0002960631150000131
表3
下表4显示了1:1mg/ml的API:Nanocin的DLS数据。
Figure BDA0002960631150000141
表4
使用雷帕霉素的PDI较高，并且只有1:1mg/ml的D:N制剂给出了“良好”报告，而0.33:1mg/ml的则没有。
炎症测定
图5-7显示了使用THP-1细胞(人单核细胞系)建立的抗炎测定结果。用脂多糖(LPS)刺激后，细胞因子(特别关注与炎症有关的细胞因子-TNF-α、IL-8、IL-1α)的释放是测试化合物的潜在抗炎作用的有效模型***(参考文献1)。
为了使测定的条件标准化，在2、4和24小时的时间内，对TNF-α、IL-8和IL-1α的响应研究了LPS剂量(0-1ug/ml)。结果显示，IL-1α和IL-8在24小时后获得其最大表达，而TNF-α具有更早的在2至4小时之间的响应，这在炎症级联反应中是众所周知的。由于IL-8和IL-1α均指示了炎症反应的更后期，并且IL-8显示更为清晰的响应曲线，因此使IL-8进入到了筛选过程，而IL-1α则被终止。
API剂量范围对IL-8响应的影响
在THP-1细胞测定中测试了每种API的0-30ug/ml的剂量范围(见图8a)。雷帕霉素、双氯芬酸、环孢菌素和他克莫司在抑制LPS炎症响应方面表现为比布洛芬更有效。他克莫司和环孢菌素的MIC为0.3ug/ml，双氯芬酸和雷帕霉素则为1ug/ml。
然后，在与或者不与Nanocin一起配制的情况下，对API进行测试，浓度为30ug/mlAPI和100ug/ml Nanocin。如先前所示，布洛芬(I)在降低IL-8释放方面几乎没有作用，而其他API则有作用(图8b)。
使用每个样品的细胞计数将图8b的结果归一化(图8c)，该结果将他克莫司确定为在30ug/ml下更有效的抗炎药。
对于配制的样品和单独的Nanocin，IL-8的水平几乎降至零(图8c)，这不是由于IL-8释放受到抑制，而是由于Nanocin引起的细胞死亡(图8d)。
THP-1细胞对Nanocin浓度敏感，因此对该细胞进行了Nanocin剂量试验(图8e)。浓度为10ug/ml时Nanocin在2小时后对细胞活力产生显著影响，浓度为1ug/ml时Nanocin在24小时后对细胞活力产生显著影响。
如图9-12所示，在不影响细胞活力的足够低的Nanocin浓度下测试了制剂。首先在20％乙醇中配制1:1mg/ml(Nanocin:API)，然后将储备制剂用无血清介质稀释，并以1或0.1ug/ml的最终浓度进行了测试。
总结
两种细胞因子的测量显示，单独的双氯芬酸和单独的Nanocin都降低了LPS刺激的炎症响应。当一起配制时，分泌的细胞因子的水平仍大大低于LPS刺激的响应。数据表明，单独的Nanocin可以起到一些抗炎作用。
局部皮肤研究
如实施例2中更详细描述的，使用猪耳皮肤进行了体外渗透研究。
实验研究涉及在Franz扩散池中将各种制剂施用到皮肤上，将其以无限剂量放置24小时。最初制剂是在20％乙醇中的1mg/ml Nanocin和300ug/ml API。使用FITC标记的Nanocin时也使用了相同浓度的制剂。检测方法为：Franz扩散池方法1：完全OCT包埋法和冷冻切片；Franz扩散池方法2：部分OCT包埋和冷冻切片；Franz扩散池方法3：部分OCT包埋和胶带剥离；以及飞行时间二次离子质谱(ToF-SIMS)荧光显微镜。
简而言之，在该浓度下，所有方法中都没有检测到API，除了与Nanocin配制在一起的双氯芬酸外，其在角质层中具有新的二次离子。提出了假设：双氯芬酸与Nanocin的共同配制导致化合物的电离模式发生实质性变化，从而导致指纹图谱不同。
由于双氯芬酸已经显示出信号迹象，决定推进已经用于皮肤治疗的另一类抗炎剂他克莫司，随后向ISAC提供了更高剂量的1:1mg/ml的API:Nanocin的制剂，以改善ToF SIMS中的信号。
对来自3双氯芬酸和3双氯芬酸+Nanocin的前3个胶带剥离条进行的ToF-SIMS分析似乎表明组合制剂使得活性成分渗透至角质层的顶层中，而单独的活性剂则没有。
呈现了CN-(皮肤化学组成的标志物)和被用作双氯芬酸(盐)的标志物的Cl-、NaCl2-和Na2Cl3-的分布。基于峰的搜索(peak search)使用它们以寻找两种样品类型与对照(空白)之间的差异。
CN-标志物用于展示皮肤组织的成功剥离以及该组织在胶带剥离条上的相应位置。可看出Cl-是或多或少普遍存在的并且在一定程度上与天然皮肤化学组成有关，然而NaCl2-和Na2Cl3-离子标志物表现为与对照样品相比差异很大，并且确实似乎与活性成分相关。它们是化合物的盐结构的符合逻辑的片段。
将双氯芬酸+Nanocin样品与单独的双氯芬酸的样品进行比较，可以很容易地确定，在所有前者样品的胶带剥离条1-3中，NaCl2-和Na2Cl3-离子均大量而非均匀地存在，但后者中则均不存在。Cl-存在于两个样品系列的所有胶带剥离条中，但在组合制剂中强度显著增加。
来自所有样品然后组合成各自的组的离子强度数据的图支持了这种说法。
双氯芬酸和Nanocin结果的一个例子如图15所示。ToF-SIMS横截面分析比较了1mg/ml双氯芬酸和1mg/ml双氯芬酸+双氯芬酸+Nanocin，可以看出该分析表明Nanocin制剂促进了(非均匀分布的)向角质层中的渗透，其中仅双氯芬酸制剂则较不明显。
通过部分包埋法制备样品似乎提供了更好的样品稳定性(留下下方软骨)，并减少了OCT对图像分析的影响。
CN-和PO2-用作皮肤化学组成的标志物，而Cl-、NaCl2-和Na2Cl3-用作双氯芬酸(盐)的标志物。
注意到，对照样品没有显示出这些标志物在角质层中积累的证据。单独双氯芬酸的样品显示，在角质层区域中以及概括地说在表皮中，这些离子的强度略有升高。然而，双氯芬酸+Nanocin样品显示出在角质层中的显著升高，表现为强度不一致不均匀的尖峰。这些通常与有助于确认位置的PO2-信号的抑制有关。
实施例2-在有和没有渗透增强剂的情况下的局部递送的活性药物成分的体外渗透评估
背景
这些实验的目的是评估在使用和不使用Nanocin作为渗透增强剂的情况下，所选活性药物成分(API)在猪皮肤切片上的“体外”渗透。
在实验过程中，计划开发Franz扩散池方案来模拟雷帕霉素、他克莫司、布洛芬、环孢菌素和双氯芬酸API的局部递送和随后的渗透。然后将单独的这些API和与Nanocin共同配制的这些API都局部施用至猪皮肤。然后将从Franz扩散池中回收的皮肤切片冷冻冻结，然后冷冻切片以提供组织的横截面薄片。然后，通过飞行时间二次离子质谱(ToF-SIMS)和荧光显微镜(FM)对切片进行化学成像，以确定API的位置并评估它们渗透皮肤切片的程度。在项目的初始阶段需要表征代表纯物质API的二次离子峰。这些将首先用于确定API的分布。使用(额外的)FITC标记的Nanocin变体来提供具有荧光活性的渗透增强剂，然后可以通过FM来检测Nanocin变体，以确定这些制剂的渗透和组织位置。荧光检查在项目的第一部分中进行。
Franz扩散池方法1：完全OCT包埋法和冷冻切片
用于Franz扩散池分析的猪耳来自当地屠宰场。屠宰的猪的年龄在4-6个月之间。用去离子水清洁耳朵，并从下方软骨上小心地移出皮肤外层。然后将切下的皮肤在-20℃下储存直至使用。所有耳朵均在采购后的6个月内用于渗透实验。
在设置Franz扩散池之前，将皮肤置于室内温度和压力下使皮肤解冻。在该情形下，猪皮肤上多余的毛发没有被修剪(以提升确定毛囊递送的能力)。将皮肤切片直接切成直径为3cm的较小的切片大小，以确保皮肤能够安装在Franz扩散池的供应室和接受室之间。
接受室中装满3ml在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10％乙醇。组装Franz扩散池后，使皮肤在37℃水浴中平衡30分钟。这样做是为了确保皮肤达到32℃的生理温度。然后用所需的API制剂处理皮肤。
23小时后，从皮肤上去除多余制剂，并使用不刮擦的海绵用3％Teepol溶液进行清洁。然后将皮肤切片切成1cm×1cm的正方形(对应于治疗的皮肤部位的有效面积)。然后将该皮肤切片切成两半，以便可以装入含有最佳切割温度(OCT)树脂的基模中。将皮肤切片直立放置，以便在切片时获得垂直横截面。将基模放在液氮浴中的冷却铝块上，使得OCT凝固。然后将模具保存在-80℃下直至进行横切。然后使用Leica CM 3050S低温恒温器进行连续横切，以生成多个横截面薄片以进行图像分析。
Franz扩散池方法2：部分OCT包埋和冷冻切片
以与上述方法1相同的方式采购并预备猪皮肤。用去离子水清洁耳朵，然后在-20℃下储存直至使用。所有耳朵均在采购后的6个月内用于渗透实验。对于该实验的设置，使用与软骨连接的内部皮肤生成具有增强的稳定性的切片。
在设置Franz扩散池之前，将皮肤置于室内温度和压力下使皮肤解冻。猪皮肤上的多余毛发再次按照标准方案没有被修剪(以提升确定毛囊递送的能力)，除此之外，将皮肤切成直径为3cm的较小切片，以安装在Franz扩散池的供应室和接受室之间。接受室中装满3ml在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10％乙醇。
组装Franz扩散池后，使皮肤在37℃水浴中平衡30分钟。这样做是为了确保皮肤达到32℃的生理温度。然后用选定的制剂处理皮肤。23小时后，从皮肤上去除多余制剂，并使用不刮擦的海绵用3％Teepol溶液清洗该切片。
将皮肤切片切成1cm×1cm的正方形(对应于治疗的皮肤部位面积)。然后将该更小的皮肤切片切成两半，放在液氮浴中的冷却铝块上以将皮肤冻结实。然后将这些冷冻的皮肤切片直立放置在部分填充有OCT的基模中，要确保用于切片的皮肤部分不会被包埋到OCT中。
然后将皮肤切片保存在-80℃下直至进行横切。使用Leica CM 3050S低温恒温器，冷冻切片至厚度为20μm。将所得切片转移到玻璃显微镜载玻片上，并进行成像分析。
Franz扩散池方法3：部分OCT包埋和胶带剥离
按照与(上述)方法1所列出的相同的步骤采购猪皮肤，并使猪皮肤经历标准制备和Franz扩散池处理，直至在处理后从Franz扩散池中移出样品。
在Franz扩散池提取后，将样品切成1cm×1cm的大小时，根据标准方案对它们进行连续胶带剥离。依次将粘性胶带条施加至治疗的皮肤区域并除去。使用辊将粘性胶带压在皮肤上以伸展皮肤表面。对于根据该方法制备的每个样品，收集15个胶带剥离条。对所得的胶带剥离条进行成像分析。
飞行时间二次离子质谱(ToF-SIMS)
所有ToF-SIMS样品切片分析都是在ToF-SIMS IV仪器(ION-TOF GmbH，Münster，德国)上在超高真空条件下进行的，操作参数如下：
·初级离子束：铋液态金属离子枪(Bi3+)25kV(脉冲目标电流为约1.0)
·溅射离子束：NA
·分析仪：单级反射器
·电荷补偿：pA.低能电子(20eV)
·数据采集和分析：使用SurfaceLab 6软件(IONTOF GmbH)进行。
成像特定的详细信息：
·分析面积：在500μm×500μm的面积上采集数据。
·分辨率：256×256像素
·扫描次数：20次扫描
荧光显微镜
使用配备CoolLED pE-4000荧光照明、pE-100明场照明和Nikon plan Fluor 10x(0.30NA)物镜的尼康Eclipse T1和QIMAGING optiMOS倒置相机对荧光显微镜下的样品切片进行成像。通过在490nm处激发来捕获荧光，收集410-500(曝光时间50μs)、500-550(曝光时间200μs)、550-650(曝光时间200μs)和650-750(曝光时间200μs)处的发射。在10μs的曝光时间下捕获明场。将所有荧光和明场图像校正为12位图像(0-4095)。
图16示意性地显示了用于化学成像的样品制备，而图17显示了横截面分析与胶带剥离分析。图18显示了示例切片图像(H&E染色)。
实验计划
该项目一开始的实验计划是准备和分析：
1.用于ToF-SIMS的API+Nanocin横截面
Figure BDA0002960631150000181
环孢菌素+Nanocin横截面
Figure BDA0002960631150000191
布洛芬+Nanocin横截面
Figure BDA0002960631150000192
雷帕霉素+Nanocin横截面
Figure BDA0002960631150000193
他克莫司+Nanocin横截面
Figure BDA0002960631150000194
双氯芬酸+Nanocin横截面
2.用于ToF-SIMS的API横截面
Figure BDA0002960631150000195
环孢菌素横截面
Figure BDA0002960631150000196
布洛芬横截面
Figure BDA0002960631150000197
雷帕霉素横截面
Figure BDA0002960631150000198
他克莫司横截面
Figure BDA0002960631150000199
双氯芬酸横截面
3.用于FM的API+FITC-Nanocin横截面
Figure BDA00029606311500001910
环孢菌素+FITC-Nanocin截面
Figure BDA00029606311500001911
布洛芬+FITC-Nanocin横截面
Figure BDA00029606311500001912
雷帕霉素+FITC-Nanocin横截面
Figure BDA00029606311500001913
他克莫司+FITC-Nanocin横截面
Figure BDA00029606311500001914
双氯芬酸+FITC-Nanocin横截面
ToF-SIMS API+Nanocin横截面分析
环孢菌素+Nanocin样品均因角质层分层而失败。布洛芬+Nanocin样品均因角质层分层而失败。雷帕霉素+Nanocin(成功制备了2个样品)说明性数据如图19所示。没有证据表明在皮肤表面或者角质层内的活性剂检查中识别到了意味着发生渗透的雷帕霉素标志物。但是，这可能是由于检测测定的灵敏度所导致的。显示出最大空间差异的离子与OCT和皮肤化学组成有关，并且与对照样品(空白)一致。表明完全不存在(不能检测到)雷帕霉素。
他克莫司+Nanocin
成功制备了1个样品，并且有1个样品因严重污染而弃用。数据如图20所示。没有证据表明在皮肤表面或者角质层内的API检查中识别到了意味着发生渗透的他克莫司离子标志物。显示出最大差异的离子再次似乎与皮肤化学组成和OCT介质有关，并且与对照样品(空白)一致。表明完全不存在(不能检测到)他克莫司。
双氯芬酸+Nanocin
成功制备了两个样品，图21显示了数据。没有证据表明在皮肤表面或者角质层内的API检查中识别到了意味着发生渗透的双氯芬酸离子标志物。但是，可以看到在参考文献检查中未看到的其他离子(C14H27O2-、C16H31O2-、C14H29O8-和C22H43O2-)显示出与角质层位置一致的空间变化。观察到这些离子的质量范围为(200-400m/z)，而对照样品(未处理)中却没有这些离子。这可能表明，Nanocin-双氯芬酸的共同配制对化合物化学组成的电离基质(ionization matrix)具有足够的影响，使得产生了显著不同的二次离子指纹图谱。如果是这种情况，那么在该分析中看到的离子可能反映了双氯芬酸-nanocin复合物的渗透，但这需要进一步的工作来扩展。
API+nanocin横切样品的ToF-SIMS分析突出了几个关键点：
·用于该分析的猪皮肤样品的制备一致性差。角质层分层被认为是一直存在的问题，从而确定了经过这些处理的样品的结构完整性差。这类数据没有针对所有API进行收集
·基于来自参考文献的识别到的二次离子标志物，在成功制备的样品上不能收集到关于API位置的证据。
·但是，在双氯芬酸的情况下，通过对比搜索，发现了与角质层相关的新的感兴趣的二次离子。
·提出了假设：双氯芬酸与Nanocin的共同配制导致化合物的电离模式发生实质性变化，从而导致指纹图谱不同。
·如果有效，则这些新的标志物可能表明双氯芬酸渗透到了皮肤中。
·然而，还不清楚对API/Nanocin的检测是否是检测极限的反映。
ToF-SIMS胶带剥离分析
以下实验用于使分析面积最大化，API/Nanocin应是可检测到的，并且确保检测不到不是阈值问题。
Figure BDA0002960631150000201
环孢菌素+Nanocin胶带剥离条
Figure BDA0002960631150000202
布洛芬+Nanocin胶带剥离条
Figure BDA0002960631150000203
雷帕霉素+Nanocin胶带剥离条
Figure BDA0002960631150000204
他克莫司+Nanocin胶带剥离条
Figure BDA0002960631150000205
双氯芬酸+Nanocin胶带剥离条
ToF-SIMS-API+Nanocin胶带剥离分析
图22a显示了环孢菌素+Nanocin的结果。布洛芬+Nanocin样品均因角质层分层而失败。图22b显示了雷帕霉素+Nanocin的结果。图22c显示了他克莫司+Nanocin的结果。对于双氯芬酸+Nanocin样品，均因角质层分层而失败。
API-Nanocin处理过的胶带剥离条样品的ToF-SIMS分析与横截面数据一致：
·再次看出用于该分析的猪皮肤样品的制备一致性是个问题。角质层分层一直存在，从而确定了经过这些处理的样品的结构完整性差。这类数据没有针对所有API进行收集
·对环孢菌素、雷帕霉素和他克莫司制剂(含Nanocin)收集的数据显示，S1.1中确定的代表性二次离子的离子强度(在胶带剥离条1和2中)与对照(空白样品)中所见的相同。
·这支持了对于任何渗透而言证据不足，并且在上表面处证据也有限/完全没有。
胶带剥离条的荧光显微镜
选择了两种API(双氯芬酸和他克莫司)FITC-Nanocin样品来评估FM成像是否会展示与ToF-SIMS数据相矛盾的任何明显渗透。
Figure BDA0002960631150000211
双氯芬酸+FITC-Nanocin胶带剥离条
Figure BDA0002960631150000212
他克莫司+FITC nanocin胶带剥离条
API+FITC-Nanocin胶带剥离条分析的数据如图23a-23c所示。使用Franz扩散池方法3(部分OCT嵌入和胶带剥离)生成了FITC标记的nanocin-双氯芬酸和他克莫司处理过的皮肤样品，以支持对处理后检测API/Nanocin制剂的能力的研究。还制备了空白样品(未处理)作为对照。
胶带剥离的样品提供了皮肤表面的侧面视角，相对于横截面的制备，该侧面视角应使得检测活性物质(荧光团)的能力最大化。
通过FM对收集的样堆中的前3个胶带剥离条层(TS)进行成像，以评估是否可以通过荧光团的位置来推断并评估nanocin-API复合物的渗透。
上述说明性图像(TS 1和2)和收集的荧光强度(FI)数据表明，对照样品与他克莫司和双氯芬酸样品上所观察到的固有荧光之间没有显著差异。双氯芬酸样品在视觉上似乎在TS1(上表面)上显示出更多的荧光，但是这不能通过FI确定为在统计学上是显著的。
该数据支持了ToF-SIMS胶带剥离数据，没有证据表明关键组分(API/nanocin)渗透或残留在皮肤表面。
双氯芬酸vs双氯芬酸+Nanocin浓度升高的ToF-SIMS分析
由于双氯芬酸是唯一可以确定某些渗透迹象(横截面分析)的活性成分，因此决定只关注该API(在有或没有Nanocin的情况下)。也确定了制剂中API的升高的浓度(1mg/ml)将用于提高检测功效。
此外，为了解决样品制备问题并改善皮肤切片的结构完整性(避免分层)，使用了经过调整的制备方法。使用了仍然与下方软骨连接的皮肤切片来提供足够的支撑，以使得部分包埋技术得以使用。这提供了更强健的物理结构，还具有使围绕OCT浸出(OCTleaching)和图像解析复杂化的分析问题减少的额外好处。
这些实验对以下进行了研究：
Figure BDA0002960631150000213
双氯芬酸+Nanocin胶带剥离条
Figure BDA0002960631150000221
双氯芬酸胶带剥离条
Figure BDA0002960631150000222
双氯芬酸+Nanocin横截面
Figure BDA0002960631150000223
双氯芬酸横截面
图24显示了ToF-SIMS双氯芬酸+Nanocin TS1(重复1-3)；图25显示了ToF-SIMS双氯芬酸+Nanocin TS2(重复1-3)；图26显示了ToF-SIMS双氯芬酸+Nanocin TS3(重复1-3)；图27显示了ToF-SIMS双氯芬酸TS1；图28显示了ToF-SIMS双氯芬酸TS2；图29显示了ToF-SIMS双氯芬酸TS3
图13和14显示了胶带剥离分析实验中使用的ToF-SIMS离子强度对比。
观察结果
对来自3双氯芬酸和3双氯芬酸+Nanocin的前3个胶带剥离条进行的ToF-SIMS分析似乎表明组合制剂使得活性成分渗透至角质层的顶层中，而单独的活性剂则没有。
呈现了CN-(皮肤化学组成的标志物)和被用作双氯芬酸(盐)的标志物的Cl-、NaCl2-和Na2Cl3-的分布。基于峰的搜索使用它们来寻找两种样品类型与对照(空白)之间的差异。
CN-标志物用于展示皮肤组织的成功剥离以及该组织在胶带剥离条上的相应位置。可看出Cl-是或多或少普遍存在的并且在一定程度上与天然皮肤化学组成有关，然而NaCl2-和Na2Cl3-离子标志物表现为与对照样品相比差异很大，并且确实似乎与活性成分相关。它们是化合物的盐结构的符合逻辑的片段。
将双氯芬酸+Nanocin样品与单独的双氯芬酸的样品进行比较，可以很容易地确定，在所有前者样品的胶带剥离条1-3中，NaCl2-和Na2Cl3-离子均大量而非均匀地存在，但后者中则均不存在。Cl-存在于两个样品系列的所有胶带剥离条中，但在组合制剂中强度显著增加。
来自所有样品然后组合成各自的组的离子强度数据的图支持了这种说法。
图30显示了双氯芬酸与双氯芬酸+Nanocin的结果。
ToF-SIMS横截面分析比较了1mg/ml双氯芬酸和1mg/ml双氯芬酸+双氯芬酸+Nanocin，可以看出该分析说明Nanocin制剂促进了(非均匀分布的)向角质层中的渗透，其中仅双氯芬酸制剂则较不明显。
通过部分包埋法制备样品似乎提供了更好的样品稳定性(留下下方软骨)，并减少了OCT对图像分析的影响。
CN-和PO2-用作皮肤化学组成的标志物，而Cl-、NaCl2-和Na2Cl3-用作双氯芬酸(盐)的标志物。
注意到，对照样品没有显示出这些标志物在角质层中积累的证据。单独双氯芬酸的样品显示，在角质层区域中以及概括地说在表皮中这些离子的强度略有升高。然而，双氯芬酸+Nanocin样品显示出在角质层中的显著升高，表现为强度不一致不均匀的尖峰。这些通常与有助于确认位置的PO2-信号的抑制有关。
关键发现是没有证据表明环孢菌素、布洛芬、雷帕霉素或他克莫司发生了渗透，无论有或者没有Nanocin，尽管不能忽视这可能是由于检测这些API的方法的灵敏度造成的。通过胶带剥离分析和ToF-SIMS成像，一些证据表明当与Nanocin共同配制时，双氯芬酸发生了渗透。
总结
通过Franz扩散池实验方法成功生成了各种API处理的皮肤样品。然而，随后样品向横截面薄片的推进证明存在不一致，多个样品失败了，最常见的原因是角质层发炎和分层。使用ToF-SIMS对(非FITC标记的)nanocin-API制剂处理过的样品收集的初始数据不能证明使用已识别的离子标志物无法检测到API和nanocin。没有进行研究单独API ToF-SIMS和API+FITC-Nanocin FM的实验，而是基于该数据开始进行方法调整，以通过胶带剥离进行一些皮肤表面的侧面分析，以观察在检查较大的预期表面面积时是否可以检测到离子标志物。
还对横截面薄片的二次离子数据集进行了更高级的数据分析。这项工作强调了：双氯芬酸-Nanocin样品切片显示了一些独特的(相对于空白参考样品)二次离子定位于角质层的证据。这些标志物(质量范围200-400m/z)与参考文献研究中列出的参考标志物不一致。其他API***中没有找到这样的证据。这表明Nanocin与API的共同配制产生了独特的电离基质，从而导致与单独的API和Nanocin不同的二次离子结构。
FITC标记的nanocin-API处理的样品的荧光显微镜成像未呈现出皮肤的前3个胶带剥离条层内存在荧光团的证据。基于该数据开始进行另外的方法更改，以便仅仅专注于双氯芬酸，并在样品制备机制上使用了变体来提高样品的稳定性。配制了更高浓度(1mg/ml)的双氯芬酸，以确保超过检测限。在仍然与软骨连接的皮肤切片上使用部分包埋方案，有效改善处理过程中的样品活力，并消除OCT对图像分析和组分浸出的影响。改善了样品活力，同时减少了样品损失，并通过消除OCT化学组成的影响，改善了化学成像能力。用双氯芬酸(单独)和双氯芬酸加Nanocin处理的样品制备横截面薄片和胶带剥离条。
对这两个***的重复的胶带剥离分析显示，在ToF-SIMS横截面分析中识别的相同离子的位置存在差异，但仍比在逻辑上对应于双氯芬酸结构的其他离子标志物明显。胶带剥离数据表明在nanocin配制的变型中API存在非均匀渗透，而在单独的API***中则没有。这主要是基于与双氯芬酸盐有关的离子(Cl-、NaCl2-、Na2Cl3-)的使用。横截面分析支持了这种说法，表明双氯芬酸在与Nanocin共同配制时渗透到了角质层中(通过上面列出的相同标记物)。这些离子在角质层中的分布有些不均匀，其强度的尖峰位于特定的点。
实施例3-人皮肤研究
人皮肤研究证实了增强的NSAID(双氯芬酸)向人健康皮肤中的药物递送(见图31和32)。人的腹部皮肤以符合伦理的方式来自健康人供体。将一式三份的皮肤盘状物以表皮面朝上置于的静态扩散池(Franz扩散池)中。将药物溶液(单独的双氯芬酸或与聚己缩胍配制形成纳米颗粒的双氯芬酸)添加到Franz扩散池的上室中。将Franz扩散池组装完全，然后在分析之前于32℃下孵育24小时。在该时间点，拆解Franz扩散池，移出皮肤盘状物。将盘状物洗涤并通过用纸巾轻擦进行干燥。然后使用粘性胶带将皮肤的上层连续剥离三遍。还从Franz扩散池的上室和下室中取样。
使用Waters ACQUITY QDa质谱检测器通过定量LC-MS分析所有样品中双氯芬酸的存在(图31)。此外，使用购自Abcam的体外测定分析了胶带剥离条上的样品抑制环氧合酶1(Cox-1)的能力(图32)。
在24小时时，任何一种接受流体样品中几乎都没有检测到双氯芬酸，这表明此时只有很少的药物通过了皮肤。唯一的例外是双氯芬酸/聚己缩胍样品中的一个，其中在接受流体中发现了大量的所用药物。然而，这是由于在该一个样品中流体从皮肤盘状物中泄漏出来的缘故(图31；DN1:1_1)。
与单独的双氯芬酸处理的盘状物相比，双氯芬酸/聚己缩胍处理过的样品证明药物向皮肤上层中的递送显著增强，这是通过与单独的双氯芬酸处理的皮肤相比，从双氯芬酸/聚己缩胍皮肤胶带剥离条中获得的更高的药物浓度来证明的(图31)。如下表6所示，在各个胶带条中，双氯芬酸/聚己缩胍:单独的双氯芬酸处理的样品之间的药物比率随着每次连续胶带剥离而增加，这表明不仅药物与皮肤上层的缔合增强了，而且向皮肤中的渗透也增强了。Cox-1测定证实了这些观察结果，并进一步证明了来自双氯芬酸/聚己缩胍处理的样品的胶带剥离条中的双氯芬酸水平足以产生明显的Cox-1抑制作用，而单独的双氯芬酸处理的样品中的水平则不能(图32)。对上室中残留药物量的分析(图31)还证明，在双氯芬酸/聚己缩胍溶液中，大部分药物已从室中流失，可能是由于渗透到皮肤中造成的。相反，大多数所用药物仍留在双氯芬酸单独治疗的上室中。
Figure BDA0002960631150000241
Figure BDA0002960631150000251
表6-用指定制剂处理的人皮肤样品的连续胶带剥离条中的双氯芬酸浓度的分析
剥离皮肤后，将胶带剥离条悬浮在5ml甲醇中以从胶带溶解出药物，然后再通过LC-MS分析。
这些结果证明了，在将双氯芬酸与聚己缩胍配制成制剂后，双氯芬酸向人皮肤中的皮肤递送明显增强了。
前述实施方式并非意在限制权利要求所提供的保护范围，而是意在描述可如何将本发明付诸实践的实施例。
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Claims (23)

1.一种组合物，其包含能够形成纳米颗粒的聚合物和抗炎和/或止痛剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述聚合物包括线性和/或支化或环状的聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述聚合物包括聚六亚甲基双胍。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，形成的所述纳米颗粒含有所述抗炎和/或止痛剂和/或所述纳米颗粒在所述抗炎和/或止痛剂的存在下形成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述抗炎剂包括非甾体抗炎(NSAID)剂。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述抗炎和/或止痛剂包括选自以下的一种或多种：雷帕霉素、他克莫司、布洛芬、环孢菌素、双氯芬酸、萘普生及其相关衍生物和盐。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含以下组分的一种或多种：缓冲剂、赋形剂、粘合剂、油、水、乳化剂、甘油、抗氧化剂、防腐剂和香料。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用作药物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述药物是局部用药物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于治疗或控制炎症和/或疼痛。
11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述炎症和/或疼痛是肌肉的或骨骼的。
12.根据权利要求10和11所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于治疗或控制肌腱、韧带、肌肉和关节的创伤、风湿病、关节痛或关节炎。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为霜、凝胶、膏、喷雾、粉末、泡沫或摩丝的形式。
14.一种聚六亚甲基双胍(PHMB)在药物的制备中形成含有抗炎和/或止痛剂或与抗炎和/或止痛剂关联的一种或多种纳米颗粒的用途。
15.根据权利要求14所述的PHMB的用途，其特征在于，所述抗炎和/或止痛剂包括非甾体抗炎(NSAID)剂。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的PHMB的用途，其特征在于，所述抗炎和/或止痛剂包括选自以下的一种或多种：雷帕霉素、他克莫司、布洛芬、环孢菌素、双氯芬酸、萘普生及其相关衍生物和盐。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的PHMB的用途，其特征在于，用于治疗或控制炎症和/或疼痛的药物的制备中。
18.根据权利要求17所述的PHMB的用途，其特征在于，所述药物是局部用药物。
19.根据权利要求18所述的PHMB的用途，其特征在于，所述纳米颗粒用作向患病区域递送抗炎和/或止痛剂的载体。
20.根据权利要求19所述的PHMB的用途，其特征在于，所述患病区域是肌肉区域或骨骼区域。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的PHMB的用途，其特征在于，所述炎症和/或疼痛包括肌腱、韧带、肌肉和关节的创伤、风湿病、关节痛或关节炎。
22.一种制备用于治疗或控制炎症和/或疼痛的组合物的方法，其包括在适合于形成纳米颗粒的条件下，将能够形成纳米颗粒的聚合物与抗炎和/或止痛剂混合。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法用于制备根据权利要求1至13中任一项所述的组合物。
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