CN112739793A - 发光标记物颗粒 - Google Patents

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Abstract

一种发光标记物颗粒，其具有包含发光材料的发光颗粒芯部，以及结合至该发光颗粒芯部的第一表面基团和第二表面基团。第一表面基团包含极性基团并且是不与生物分子结合的惰性基团。第二表面基团包含生物分子结合基团。

Description

发光标记物颗粒
发明背景
在一些实施方案中，本公开提供了用作生物传感器应用中的标记物的发光标记物颗粒，任选为发光标记物纳米颗粒。
已经公开了氧化硅纳米颗粒和发光材料作为标记或检测试剂。
WO 2018/060722公开了包含氧化硅和具有极性基团的发光聚合物的混合物的复合颗粒。
Estevez,M-C.等人‘Highly Fluorescent Dye-Doped Silica NanoparticlesIncrease Flow Cytometry Sensitivity for Cancer Cell Monitoring’Nano.Res.2009,2,448-461公开了用聚乙二醇官能化的染料掺杂的氧化硅纳米颗粒。
US 2010/209946公开了用水分散基团、屏蔽基团和生物分子结合基团官能化的氧化硅纳米颗粒。
Nanoscale,2013,vol.5,pp 8593-8601,Geng等人描述了氧化硅共轭的聚合物(CP)纳米颗粒，其中LEP具有侧挂的非极性烷基侧链，并且其中纳米颗粒具有“SiO2@CP@SiO2”结构。
Behrendt等人J.Mater.Chem.,2013,vol.1,pp 3297-3304,描述了氧化硅-LEP纳米颗粒，其中LEP共价结合到氧化硅。该发光聚合物具有侧挂于聚合物主链的烷氧基硅烷基基团，其在纳米颗粒形成期间与氧化硅单体反应。
Nanoscale Res.Lett.,2011,vol.6,p 328公开了在氧化硅基质中捕集小分子。
Langmuir,1992,vol.8,pp 2921-2931公开了染料与硅烷偶联剂的偶联，然后将其纳入氧化硅球中。
Chem.Mater.,2014,vol.26,pp 1874-1880,Geng等人公开了负载聚(9,9-二己基芴-交替-2,1,3-苯并噻二唑)(PFBT)的纳米颗粒。
发明内容
下面阐述本文公开的某些实施方案的方面的概述。应当理解，呈现这些方面仅仅是为了向读者提供这些某些实施方案的简要概述，并且这些方面并不意图限制本公开的范围。实际上，本公开可以涵盖可能未阐述的多个方面和/或方面的组合。
期望配置发光颗粒以结合生物分子从而形成胶体，该胶体在使用时和/或在存储时是稳定的，且特别地该胶体不聚集。本发明人发现，在通常用于生物学测定的水溶液例如缓冲水溶液中，维持此类胶体的稳定性特别成问题。
本发明人已发现，可以从具有极性表面基团(其具有生物分子结合基团)和没有生物分子结合基团的表面基团的颗粒形成含有发光标记物纳米颗粒的稳定胶体，同时维持发光标记物颗粒结合至生物分子的能力。
因此，在一些实施方案中，提供了一种发光标记物颗粒，其具有包含发光材料的发光颗粒芯部，以及结合至该发光颗粒芯部的第一表面基团和第二表面基团。第一表面基团包含极性基团并且是惰性的。第二表面基团包含生物分子结合基团。
在一些实施方案中，第一表面基团:第二表面基团的摩尔比大于90:10。
对于其中发光材料是聚合物的发光颗粒，上述的聚集问题可能会加剧。然而，本发明人发现，使用如本文关于包含发光聚合物的发光芯部所述的表面基团可以实现良好的稳定性。因此，在一些实施方案中，发光材料是发光聚合物。
在一些实施方案中，纳米颗粒芯部包含无机基质。该无机基质可以是无机氧化物，任选为氧化硅。
本发明人发现，可以形成具有带生物分子结合基团和不带生物分子结合基团的表面基团的标记物颗粒，使得可以控制生物分子结合基团与非生物分子结合基团的比例。可以选择该比例以平衡颗粒的胶体稳定性和颗粒的生物分子结合能力。
因此，在一些实施方案中，提供了一种形成发光标记物颗粒的方法，其中使发光颗粒芯部与第一反应性化合物和第二反应性化合物反应以分别形成第一表面基团和第二表面基团，或第一表面基团和第二表面基团的前体，所述芯部具有结合至其表面的多个第一反应性基团，所述第一表面基团和第二表面基团的前体可以经历一个或多个其他反应从而形成第一表面基团和第二表面基团。
可以将颗粒分散在液体中，例如用于测定(assay)。
因此，在一些实施方案中，提供了一种胶体悬浮液，该胶体悬浮液包含悬浮在液体中的颗粒。
所述颗粒可以用于标记生物分子，例如追踪或检测生物分子。因此，在一些实施方案中，提供了标记生物分子的方法，该方法包括将生物分子结合至所述颗粒的步骤。
在一些实施方案中，提供了一种用于靶标分析物的测定方法，该方法包括使样品接触本文所述的发光标记物颗粒，以及确定靶标分析物与发光标记物的任何结合。
任选地，通过流式细胞术来分析与发光标记物颗粒接触的样品。
任选地，确定结合至发光标记物颗粒的靶标分析物的量。
任选地，样品包含细胞的混合物，并且对结合至发光标记物的一种或多种不同类型的靶标细胞进行鉴定和/或量化。
附图说明
结合附图描述本公开。要强调的是，根据行业中的标准实践，各个特征未按比例绘制。实际上，为了讨论的清楚，各个特征的尺寸可以任意增加或减小。
在附图中，相似的部件和/或特征可以具有相同的附图标记。此外，可以通过在附图标记之后加上破折号和第二标记来区分相同类型的各种部件，所述破折号和第二标记在相似部件之间进行区分。如果在说明书中仅使用第一附图标记，则该描述适用于具有相同的第一附图标记的类似部件中的任一个，而与第二附图标记无关。
现在将参考附图更详细地描述本发明，其中：
图1是根据一些实施方案的纳米颗粒的示意图；
图2是根据一些实施方案的形成纳米颗粒的方法的示意图；
图3是发光纳米颗粒的信噪比的坐标图，其中0.1和10mol％的纳米颗粒表面基团含有生物素结合基团；
图4是分散在缓冲溶液中的具有甲氧基封端的表面基团的纳米颗粒的Z-平均直径的百分比变化相对于时间的坐标图；
图5是分散在缓冲溶液中的具有羧基封端的表面基团的纳米颗粒的Z-平均直径的百分比变化相对于时间的坐标图；
图6是以下的染色指数图：根据本公开实施方案的用生物素化的溶解发光聚合物标记物染色的Cyto-Trol细胞，其通过链霉亲和素缀合到抗人类CD4抗体；以及与相同抗体缀合的比较性的发光纳米颗粒；
图7是以下的染色指数图：用图6的链菌亲和素缀合的纳米颗粒染色的Cyto-Trol细胞；与同种型缀合的发光纳米颗粒；以及不与链霉亲和素缀合的发光纳米颗粒；
图8是以下的染色指数图：根据本公开实施方案的用生物素化的纳米颗粒染色的Cyto-Trol细胞，其通过中性亲和素缀合至抗人类CD4抗体；以及与相同抗体缀合的比较性的溶解发光聚合物标记物；
图9是以下的染色指数图：用图8的中性亲和素缀合的纳米颗粒染色的Cyto-Trol细胞；与同种型缀合的发光纳米颗粒；以及不与中性亲和素缀合的发光纳米颗粒；和
图10是以下的染色指数图：根据本公开实施方案的用具有不同量的生物素的生物素化纳米颗粒染色的Cyto-Trol细胞，其通过链霉亲和素缀合至抗人类CD4抗体；以及与相同抗体缀合的比较性的溶解发光聚合物标记物。
发明详述
除非上下文清楚地另外要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等应被解释为包含性意义，而不是排他性或穷举性含义；也就是说，为“包括但不限于”的意义。本文中所使用的术语“连接”、“偶联”或其任何变体是指两个或更多个要素之间的任何连接或偶联，要么直接的要么间接的。另外，当在本申请中使用时，词语“本文”、“上文”，“下文”和类似含义的词语是指本申请整体，而不是本申请的任何特定部分。在上下文允许的情况下，详细描述中的使用单数或复数的词语也可以分别包括复数或单数。涉及两个或更多个项目的列表中的词语“或”涵盖该单词的所有以下解释：列表中的任何项目、列表中的所有项目以及列表中项目的任何组合。
本文提供的技术的教导可以应用于其它***，不一定是下面描述的***。可以将下面描述的各个实施例的要素和动作进行组合以提供该技术的其它实施方式。该技术的一些替代实施方式不仅可以包括下文提到的那些实施方式的额外要素，而且可以包括更少的要素。
可以根据以下详细描述对该技术进行这些和其它改变。尽管说明书描述了该技术的某些实施例，并且描述了所考虑的最佳模式，但是无论该描述有多么详细，该技术都可以按许多方式来实践。该***的细节在其具体实施方式中可能显著变化，而仍被本文公开的技术所涵盖。如上文所述，在描述该技术的某些特征或方面时使用的特定术语不应被认为暗示该术语在本文中被重新定义为限于与该术语相关联的技术的任何具体的特性、特征或方面。通常，不应将以下权利要求书中使用的术语解释为将该技术限制为说明书中公开的具体实例，除非详细描述章节明确定义了这些术语。因此，该技术的实际范围不仅涵盖所公开的实例，而且还包括实践或实施权利要求书下的技术的所有等效方式。
为了减少权利要求的数目，以下以某些权利要求的形式呈现该技术的某些方面，但是申请人以任何数目的权利要求形式设想该技术的各个方面。
在下面的描述中，出于解释的目的，阐述了许多具体细节以便提供对所公开技术的实施方式的透彻理解。然而，本领域技术人员将清楚可以在没有这些具体细节中的一些的情况下实践所公开技术的实施方案。
图1说明了根据本公开的一些实施方案的颗粒100。
发光颗粒100具有包含发光材料或由发光材料组成的芯部101。芯部101可以包括基质材料，任选为无机基质材料，任选为无机氧化物，任选为氧化硅。
如果存在基质材料，则在一些实施方案中，发光材料可以直接或间接地共价结合到基质材料。在一些实施方案中，发光材料可以与基质材料混合(即并不共价结合)。芯部101可以包含氧化硅壳，该氧化硅壳部分或完全覆盖内芯，所述内芯包含发光材料或由发光材料组成，优选发光聚合物。
芯部101可包含与基质材料混合并延伸穿过基质材料的一个或多个发光聚合物链。一个或多个发光聚合物链可以突出由基质材料限定的芯部的表面。
优选地，所述颗粒的数均直径不超过5000nm，更优选地不超过2500nm，1000nm，900nm，800nm，700nm，600nm，500nm或400nm，通过使用Ma lvern Zetasizer Nano ZS的动态光散射(DLS)测量。优选地，颗粒的数均直径在5-5000nm之间，任选地在10-1000nm之间，优选在10-500nm之间，最优选在10-100nm之间，通过Malvern Zetasizer Nano ZS测量。
在一些实施方案中，发光材料是无机的。任选地，无机发光材料是量子点。
在一些实施方案中，发光材料是有机的。在一些实施方案中，有机发光材料是非聚合的。在一些实施方案中，有机发光材料是发光聚合物。
第一表面基团103和第二表面基团105结合至发光颗粒芯部。
在一些实施方案中，第一表面基团103和/或第二表面基团105可以共价结合至发光颗粒芯部的基质材料。第二表面基团105包含生物分子结合基团107。第一表面基团103是惰性的，即它不包含生物分子结合基团。
第一表面基团103包含第一极性基团PG1。该极性基团可以包含能够与水形成范德华键的杂原子，任选地为直链或支化的亚烷基链，其中该亚烷基链的一个或多个C原子被O或NR6替换，其中R6为C1-12烃基，任选为C1-12烷基或C1-4烷基。
PG1可以是直链或支化的极性基团。
优选地，PG1是聚醚链。如本文所用，“聚醚链”是指包含多个醚基的二价链。
优选地，PG1包含式(I)的重复单元或由其组成：
-((CR14R15)bO)c-
(I)
其中R14和R15各自独立地为H或C1-6烷基，并且b为至少1，任选地为1-5，优选为2，并且c为至少2，任选地为2-1000，优选地为10-500、10-200或10-100。
最优选地，PG1包含聚乙二醇链。
第一极性基团在一端直接或间接地结合到颗粒芯部。可以在极性基团和颗粒芯部之间提供结合基团以便将极性基团结合到颗粒芯部。
结合基团可以包含与颗粒芯部的表面上的氧化硅结合的硅氧烷基团以及与极性基团结合的结合基团BG。
任选地，结合基团BG包含选自以下的基团或由选自以下的基团组成：酯、酰胺、脲、硫脲、席夫碱、伯胺(C-N)键、马来酰亚胺-硫醇加合物或通过叠氮基和炔的环加成反应形成的***。
第一极性基团PG1在另一端(在二价链的情况下)或在每个其它端(在支化链、三价链或更高级链的情况下)被端基EG取代。任选地，端基是酸基或其盐或酯，任选地是羧酸、磺酸或膦酸基团或其盐或酯。
第一表面基团是惰性的。“惰性”是指当在25℃的水中与生物分子接触时，第一表面基团不与生物分子结合。
合适地，第一表面基团不结合到蛋白质(特别是蛋白质的胺基)，例如抗体或其他蛋白质。
第一极性基团可以是多分散的。第一极性基团的Mn可以为至少500，任选地至少2000。
第一表面基团可具有多峰重量分布，任选地具有双峰重量分布。
第二表面基团包括能够与生物分子结合的生物分子结合基团107。生物分子结合基团包括但不限于DNA、RNA、肽、碳水化合物、抗体、抗原、酶、蛋白质和激素。优选的生物分子结合基团是生物素。
在一些实施方案中，生物素生物分子结合基团直接结合至靶标分析物。
在一些实施方案中，生物素生物分子结合基团与具有多个生物素结合位点的蛋白质结合，所述蛋白质优选为链霉亲和素、中性亲和素、亲和素或其重组变体或其衍生物。优选地，蛋白质不是发光的。具有第二生物素基团的生物素化生物分子与相同蛋白质结合。可以根据靶标分析物来选择生物素化的生物分子。生物素化的生物分子可以包含抗原结合片段，例如抗体，可以根据靶标抗原选择所述抗原结合片段。
生物分子结合基团107可以通过基团105结合到颗粒芯部。基团105可以是第二极性基团PG2。第二极性基团可以与第一表面基团的第一极性基团PG1相同或不同。基团105可以直接结合到颗粒芯部的表面上，或者可以结合到结合基团BG，该结合基团BG可以与第一表面基团的结合基团BG相同或不同，优选与其相同。
在一些实施方案中，第一表面基团的重均分子量在750至7500道尔顿的范围内，任选地在1000至3000道尔顿的范围内。
图1示出了具有两个不同表面基团的颗粒。在一些实施方案中，颗粒可以具有三个、四个或更多个不同的表面基团。
表面基团形成
图2示出了根据本公开一些实施方案的形成发光标记物颗粒的过程。
根据一些实施方案，具有第一表面基团和第二表面基团的发光标记物颗粒可以由带有多个第一反应性基团RG1的发光颗粒芯部101形成。
任选地，第一反应性基团RG1选自：
胺基，任选地为-NR8 2，其中R8在每次出现时独立地为H或取代基，优选为H或C1-5烷基，更优选为H、-COOH、-OH、-SH、烯烃、炔烃和叠氮基。
通过使包含反应性基团RG1的化合物与颗粒芯部反应，可以将第一反应性基团RG1直接或间接地连接至颗粒芯部。
任选地，颗粒芯部包含氧化硅，并且包含反应性基团RG1的化合物具有式(I)：
(R7O)3Si-(Sp1)x-RG1
(I)
其中R7为H或取代基，优选为C1-10烷基；
Sp1是间隔基团；
x是0或1；和
RG1是第一反应性基团。
优选地，通过式(I)化合物的反应形成的硅烷在颗粒芯部的表面处的氧化硅上形成单层。
任选地，Sp1选自直链或支化的二价亚烷基链，其中一个或多个不相邻的C原子可以被O、S、C(＝O)、C(＝O)O、C(＝O)NR12或NR12替换，其中R12在每次出现时独立地选自H和C1-12烃基，任选地为C1-12烷基。
式(I)的示例性化合物是3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
颗粒与第一和第二反应性化合物混合。表面上的一些RG1基团与第一反应性化合物103'反应，并且一些RG1基团与第二反应性化合物105'反应，分别形成第一表面基团和第二表面基团，或其前体。
第一和第二反应性化合物各自包含能够与反应性基团RG1反应以形成结合基团BG的第二反应性基团RG2，如上所述，所述结合基团BG将第一表面基团103和第二表面基团和105共价结合至颗粒芯部101。
可以根据期望的第一表面基团:第二表面基团的摩尔比来选择第一反应性化合物和第二反应性化合物的摩尔比。对于第一反应性化合物和第二反应性化合物，第二反应性基团RG2可以相同或可以不同。
化合物103’可以是多分散化合物。化合物103’可以具有多峰的重量分布，任选为双峰的重量分布。通过混合具有不同平均分子量的多分散材料可以实现多峰重量分布。
在一些实施方案中，通过以下方式形成化合物103’：使前体化合物转化以形成一个或多个第二反应性基团RG2，例如通过聚(乙二醇)的反应以形成至少一个羧酸基团或其酯。可以通过在形成一个或多个反应性基团RG2之前或之后混合不同平均分子量的材料来形成具有多峰重量分布的化合物103’。
在一些实施方案中，化合物103′包含多于一个的第二反应性基团RG2。根据这些实施方案，化合物103’可以具有式(IIa)：
RG2-PG1-RG2
(IIa)
在一些实施方案中，式(IIa)的每个RG2基团与反应性基团RG1反应以形成在两个结合基团BG之间延伸的第一表面基团。
在一些实施方案中，仅一个式(IIa)的RG2基团与反应性基团RG1反应从而形成具有反应性基团RG2作为端基的第一表面基团。将理解的是，选择反应性基团RG2是因为它与反应性基团RG1的反应性；反应性基团RG2可以选自不与靶标生物分子结合的基团。
RG1和RG2可以选自：
胺，优选-N(R8)2，其中R8在每次出现时为H或取代基，优选为H或C1-5烷基，更优选为H；
羟基；硫醇；和
在RG1和RG2之间的反应中形成羧酸基团或其盐的羧酸或其衍生物，例如酸酐、酰氯或酯。
优选地，RG1和RG2之一是羧酸或其衍生物，例如酯，优选NHS酯、酰氯或酸酐基团，而RG1和RG2中的另一个是质子基团，例如羟基、硫醇或氨基，优选为氨基，其中RG1和RG2能够反应从而形成酯或酰胺结合基团BG。RG1和RG2之一可以在与RG2反应之前转化为活化形式，例如使用碳化二亚胺(例如EDC)活化羧酸基团。
在一些实施方案中，PG1为式(I)的重复单元，其直接结合到一个或两个反应性基团RG2，如下所述。
在一些实施方案中，PG1是式(I)的重复单元，PG1还具有将式(I)的重复单元连接到所述或每个反应性基团RG2的连接基团。任选地，该连接基团包含酰胺基团或由酰胺基团组成。
任选地，式(IIa)的化合物具有式：
Figure BDA0002983519120000111
其中RG2、R14、R15、b和c如上所述；每个y独立地为0、1、2、3、4或5；每个z独立地为0或1；每个R16独立地为H或C1-6烷基。
第二表面基团105可以包括极性基团PG2，其可以选自上述极性基团PG1，并且其可以与第一表面基团的极性基团PG1相同或不同。
优选地选择生物分子结合基团107，使得其在用于使RG1和RG2反应的反应条件下不与RG1反应，或者使得RG2优先与RG1反应。
优选地，第一表面基团103的数目大于第二表面基团105的数目。任选地，第一表面基团的摩尔数为第二表面基团的摩尔数的至少2倍，优选为3倍，更优选为至少5倍。最优选地，第二表面基团的数目小于第一表面基团和第二表面基团的总摩尔数的10mol％，任选地至多5mol％。
优选地，第二表面基团的数目大于第一表面基团和第二表面基团的总摩尔数的0.1mol％，任选地至少0.5mol％。
纳米颗粒芯部
颗粒芯部可以由一种或多种发光材料组成。
颗粒芯部可以包括一种或多种发光材料和基质材料或由它们组成。基体材料包括但不限于无机基体材料，任选地无机氧化物，任选地氧化硅。
在一些实施方案中，通过斯德博
Figure BDA0002983519120000121
工艺形成氧化硅颗粒，例如WO 2018/060722中所述，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可以通过在发光材料的存在下使氧化硅单体聚合来形成颗粒芯部，例如WO 2018/060722中所述，其内容通过引用并入本文。
任选地，颗粒芯部的总重量的至少0.1重量％由一种或多种发光材料组成。优选地，颗粒芯部的总重量的至少1、10、25重量％由一种或多种发光材料组成。
任选地，颗粒芯部的总重量的至少50重量％由氧化硅组成。优选地，颗粒芯部的总重量的至少60、70、80、90、95、98、99、99.5、99.9重量％由氧化硅组成。
本文所述的颗粒芯部是其上没有任何表面结合基团或表面基团的芯部。
在本发明的一个实施方案中，颗粒芯部的总重量的至少70重量％由一种或多种发光材料和氧化硅组成。优选地，颗粒芯部的总重量的至少80、90、95、98、99、99.5、99.9重量％由一种或多种发光材料和氧化硅组成。更优选地，颗粒芯部基本上由一种或多种发光材料和氧化硅组成。
发光材料
颗粒芯部的发光材料可以发射荧光、磷光或它们的组合。
发光材料可以是非聚合或聚合的发光材料。聚合的发光材料是优选的。
发光聚合物可以是均聚物，或者可以是包含两种或更多种不同重复单元的共聚物。
发光聚合物可以包含处在聚合物主链中、侧挂于聚合物主链或作为聚合物主链的端基的发光基团。在磷光聚合物的情形中，磷光金属络合物(优选磷光铱络合物)可被提供在聚合物主链中、侧挂于聚合物主链或作为聚合物主链的端基。
发光聚合物可以具有非共轭主链或者可以是共轭聚合物。“共轭聚合物”是指在聚合物主链中包含与相邻重复单元直接共轭的重复单元的聚合物。共轭发光聚合物包括但不限于包含沿聚合物主链彼此共轭的亚芳基、杂亚芳基和亚乙烯基中的一种或多种的聚合物。
发光聚合物可具有直链、支化或交联的主链。
发光聚合物可包含被一个或多个取代基取代的聚合物主链中的一个或多个重复单元，所述取代基选自非极性取代基和极性取代基。
优选地，所述发光聚合物包含至少一个极性取代基。所述一个或多个极性取代基可以是所述重复单元的仅有取代基，或者所述重复单元可以进一步取代有一个或多个非极性取代基，任选为一个或多个C1-40烃基。取代有一个或多个极性取代基的重复单元可以是聚合物的仅有重复单元，或者该聚合物可以包含一种或多种其它共聚重复单元，其中所述或每个共聚重复单元是未取代的或取代有非极性取代基，任选为一个或多个C1-40烃基取代基。
本文所述的C1-40烃基取代基包括但不限于C1-20烷基、未取代的苯基和取代有一个或多个C1-20烷基的苯基。
如本文所用的“极性取代基”可以指(单独或与一种或多种其他极性取代基组合)使得发光聚合物在醇溶剂中的溶解度为至少0.01mg/ml的取代基，优选至少00.1、1、5或10mg/ml。任选地，溶解度在0.01-10mg/ml的范围内。在25℃下测量溶解度。优选地，该醇溶剂是C1-10醇，更优选地是甲醇。
极性取代基优选是能够形成氢键或离子基团的取代基。
在一些实施方案中，发光聚合物包含式-O(R3O)t-R4的极性取代基，其中R3在每次出现时是C1-10亚烷基，任选C1-5亚烷基，其中该亚烷基的一个或多个不相邻的非末端C原子可以被O替换，R4是H或C1-5烷基，并且t是至少1，任选1-10。优选地，t为至少2。更优选地，t为2至5。在式-O(R3O)t-R4的所有极性基团中t的值可以相同。在相同聚合物的极性基团之间t的值可以不同。
本文中关于R3使用的“C1-5亚烷基”是指式-(CH2)f-的基团，其中f为1-5。
优选地，发光聚合物包含式-O(CH2CH2O)t-R4的极性取代基，其中t为至少1，任选为1-10，并且R4为C1-5烷基，优选为甲基。t优选为至少2。更优选地，t为2至5，最优选q为3。
在一些实施方案中，发光聚合物包含式-N(R5)2的极性取代基，其中R5是H或C1-12烃基。优选地，每个R5是C1-12烃基。
在一些实施方案中，发光聚合物包含极性取代基，所述极性取代基是离子基团，其可以是阴离子型、阳离子型或两性离子型。优选地，该离子基团是阴离子基团。
示例性的阴离子基团是：-COO-；磺酸根基团；氢氧根；硫酸根；磷酸根；次膦酸根；或膦酸根。
示例性的阳离子基团是-N(R5)3 +，其中R5在每次出现时是H或C1-12烃基。优选地，每个R5是C1-12烃基。
包含阳离子或阴离子基团的发光聚合物包含抗衡离子以平衡这些离子基团的电荷。
阴离子基团或阳离子基团和抗衡离子可以具有相同的化合价，其中抗衡离子平衡每个阴离子基团或阳离子基团的电荷。
阴离子基团或阳离子基团可以是单价的或多价的。优选地，阴离子基团和阳离子基团是单价的。
发光聚合物可包含多个阴离子极性取代基或阳离子极性取代基，其中两个或更多个阴离子基团或阳离子基团的电荷被单个抗衡离子平衡。任选地，极性取代基包括含有二价或三价抗衡离子的阴离子基团或阳离子基团。
抗衡离子任选为阳离子，任选金属阳离子，任选Li+、Na+、K+、Cs+，优选Cs+，或者有机阳离子，任选铵，如四烷基铵、乙基甲基咪唑鎓或吡啶鎓。
抗衡离子任选为阴离子，任选为卤离子；磺酸根基团，任选甲磺酸根或甲苯磺酸根；氢氧根；羧酸根；硫酸根；磷酸根；次膦酸根；膦酸根；或硼酸根。
在一些实施方案中，发光聚合物包含选自如下的极性取代基：式-O(R3O)t-R4的基团，式-N(R5)2的基团，式OR4的基团，和/或离子基团。优选地，发光聚合物包含选自如下的极性取代基：式-O(CH2CH2O)tR4的基团，式-N(R5)2的基团，和/或式-COO-的阴离子基团。优选地，极性取代基选自于由如下构成的组：式-O(R3O)t-R4的基团，式-N(R5)2的基团，和/或离子基团。优选地，极性取代基选自于由如下构成的组：式-O(CH2CH2O)tR4的聚乙二醇(PEG)基团，式-N(R5)2的基团，和/或式-COO-的阴离子基团。R3、R4、R5和t如上所述。
任选地，发光聚合物的主链是共轭聚合物。任选地，该共轭发光聚合物的主链包含式(III)的重复单元：
Figure BDA0002983519120000151
其中Ar1是亚芳基或杂亚芳基；Sp是间隔基团；m是0或1；R1在每次出现时独立地为极性取代基；如果m为0则n为1，并且如果m为1则n为至少1，任选为1、2、3或4；R2在每次出现时独立地是非极性取代基；p为0或正整数，任选为1、2、3或4；q为至少0或正整数，任选为1、2、3或4；并且其中Sp、R1和R2在每次出现时可以独立地相同或不同。
优选地，m为1且n为2-4，更优选为4。p优选为0。
式(III)的Ar1任选为C6-20亚芳基或5-20元杂亚芳基。Ar1优选为C6-20亚芳基，任选为亚苯基、芴、苯并芴、菲、萘或蒽，更优选为芴或亚苯基，最优选为芴。
Sp-(R1)n可以是支化基团，任选为树枝状基团，取代有极性基团，任选为-NH2或-OH基团，例如聚乙烯亚胺。
优选地，Sp选自：
-C1-20亚烷基或亚苯基-C1-20亚烷基，其中一个或多个不相邻C原子可以被O、S、N或C＝O替换；
-C6-20亚芳基或5-20元杂亚芳基，更优选亚苯基，除所述一个或多个取代基R1之外，其可以是未取代的或取代有一个或多个非极性取代基，任选一个或多个C1-20烷基。
本文所用的“亚烷基”是指支化或直链的二价烷基链。
本文所用的烷基的“非末端C原子”是指除正烷基末端处的甲基或支化烷基链末端处的甲基以外的C原子。
更优选地，Sp选自：
-C1-20亚烷基，其中一个或多个不相邻C原子可以被O、S或CO替换；和
-C6-20亚芳基或5-20元杂亚芳基，甚至更优选亚苯基，其可以是未取代的或取代有一个或多个非极性取代基。
R1可以是如本文任何地方所述的极性取代基。优选地，R1是：
-式-O(CH2CH2O)tR4的聚乙二醇(PEG)基团，其中t为至少1，任选1-10，并且R4为C1-5烷基，优选甲基；
-式-N(R5)2的基团，其中R5是H或C1-12烃基；或
-式-COO-的阴离子基团。
在n为至少2的情形中，每个R1在每次出现时可以独立地相同或不同。优选地，与给定Sp基团连接的每个R1是不同的。
在p是正整数(任选1、2、3或4)的情形中，基团R2可以选自：
-烷基，任选C1-20烷基；和
-芳基和杂芳基，其可以是未取代的或取代有一个或多个取代基，优选为取代有一个或多个C1-20烷基的苯基；
-芳基或杂芳基基团的直链或支化链，每个所述基团可独立地被取代，例如式-(Ar3)s的基团，其中每个Ar3独立地为芳基或杂芳基且s为至少2，优选为苯基的支化链或直链，每个苯基可以是未取代的或取代有一个或多个C1-20烷基；和
-可交联基团，例如包含双键的基团如乙烯基或丙烯酸酯基团，或苯并环丁烷基团。
优选地，每个R2(当存在时)独立地选自C1-40烃基，并且更优选地选自C1-20烷基；未取代的苯基；取代有一个或多个C1-20烷基的苯基；和苯基的直链或支化链，其中每个苯基可以是未取代的或取代有一个或多个取代基。
本文所述的聚合物可包含仅一种形式的式(III)重复单元或由仅一种形式的式(III)重复单元组成，或者可包含两种或更多种不同的式(III)重复单元或由两种或更多种不同的式(III)重复单元组成。
任选地，包含一种或多种式(III)重复单元的聚合物是包含一种或多种共聚重复单元的共聚物。
如果存在共聚重复单元，则式(III)的重复单元可以形成聚合物重复单元的0.1-99摩尔％，任选50-99摩尔％或80-99摩尔％。优选地，式(I)的重复单元形成聚合物重复单元的至少50摩尔％，更优选至少60、70、80、90、95、98或99摩尔％。最优选地，聚合物的重复单元由一种或多种式(I)的重复单元组成。
可以选择聚合物的所述或每个重复单元以产生聚合物的期望发射颜色。
发光材料可以发射具有在350-1000nm范围内的峰值波长的光。
蓝色发光材料，例如本文所述的复合颗粒的蓝色发光聚合物可具有峰值不大于500nm、优选400-500nm、任选400-490nm的光致发光光谱。
绿色发光材料，例如本文所述的复合颗粒的绿色发光聚合物可具有峰值大于500nm直至580nm、任选大于500nm直至540nm的光致发光光谱。
红色发光材料，本文所述的复合颗粒的红色发光聚合物可具有峰值不大于超过580nm直至630nm、任选585nm直至625nm的光致发光光谱。
该发光材料的吸收光谱可具有在300-900nm范围内的最大值。
该发光材料可以具有在10-850nm范围内的斯托克斯位移。
可以使用Hamamatsu提供的装置C9920-02在溶液中测量本文所述的发光聚合物的光致发光光谱。
可以使用Cary 5000UV-vis-IR光谱仪在溶液或悬浮液中测量如本文所述的发光材料的紫外/可见吸收光谱。
聚合物的亚芳基重复单元包括但不限于：芴，优选2,7-连接的芴；亚苯基，优选1,4-连接的亚苯基；萘，蒽，茚并芴，菲和二氢菲重复单元。
本文所述的发光聚合物或氧化硅聚合物的通过凝胶渗透色谱法测量的聚苯乙烯当量数均分子量(Mn)可以在约1×103至1×108的范围内，并且优选在1×104至5×106的范围内。本文所述聚合物的聚苯乙烯当量重均分子量(Mw)可以为1×103至1×108，且优选为1×104至1×107。
如本文所述的聚合物适宜地是无定形聚合物。
胶体
可以以胶体悬浮液的形式提供所述颗粒，所述胶体悬浮液包含悬浮在液体中的颗粒。优选地，液体选自水、C 1-10醇及其混合物。优选地，颗粒在液体中形成均匀的(非聚集的)胶体。
液体可以是包含溶解在其中的盐的溶液，任选地是缓冲溶液。缓冲溶液可以具有在1-14、优选5-8的范围内的pH。缓冲溶液可包含但不限于：磷酸盐，例如磷酸钠，三(羟甲基)氨基甲烷(tris)，乙酸盐，例如乙酸钠，硼酸盐，和/或2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)。
缓冲溶液中的盐浓度可以在约1mmol/L至200mmol/L的范围内。
胶体悬浮液中的颗粒浓度优选在0.1-20mg/mL的范围内，任选在5-20mg/mL的范围内。
在一些实施方案中，可以以胶体悬浮液的形式存储颗粒，任选地，胶体悬浮液的颗粒浓度大于0.1mg/mL，优选至少0.5mg/mL或1mg/mL。
在一些实施方案中，可以冻干或冷冻的形式存储颗粒。
应用
本公开的颗粒可以是荧光的或磷光的。优选地，该颗粒是荧光的。优选地，所述颗粒用作检测生物分子或标记生物分子的荧光探针。在一些实施方案中，所述颗粒可以在免疫测定法如横向流动或固态免疫测定法中用作荧光探针。任选地，所述颗粒用于荧光显微术、流式细胞术、下一代测序、体内成像或其中使配置成与靶标分析物结合的发光标记物与待分析的样品接触的任何其它应用。这些应用可以是医疗、兽医、农业或环境应用，无论是涉及患者(当适用时)还是用于研究目的。
在使用中，颗粒的生物分子结合基团可以结合靶标生物分子，所述靶标生物分子包括但不限于DNA、RNA、肽、碳水化合物、抗体、抗原、酶、蛋白质和激素。将理解的是，可根据靶标生物分子选择生物分子结合基团。
可以使待分析样品与颗粒接触，例如胶体悬浮液中的颗粒。
在一些实施方案中，通过流式细胞术分析与颗粒接触后的样品。在流式细胞术中，用至少一种波长的光、任选地两种或更多种不同的波长的光(例如包括355、405、488、562和640nm中至少一种的一种或多种波长)照射颗粒。颗粒发射的光可被一个或多个检测器收集。检测器可以选自但不限于：光电倍增管和光电二极管。为了提供用于计算染色指数的背景信号，可以对与不结合至颗粒的细胞混合的颗粒进行测量。
在一些实施方案中，例如板测定，可在与颗粒接触的表面上固定靶标生物分子。
实施例1—生物素化的纳米颗粒形成
具有反应性胺基的发光纳米颗粒芯部的形成
通过斯德博
Figure BDA0002983519120000191
工艺形成具有氧化硅和发光聚合物的芯部的纳米颗粒，并使该纳米颗粒芯部与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷反应，如WO 2018/060722的实施例中所述(其内容通过引用并入本文)，从而产生具有80nm的通过动态光散射测定的数均直径以及芯部表面上的胺反应性基团的纳米颗粒。
表面基团附着至氨基修饰的发光纳米颗粒
将上述实施例中形成的氨基改性的纳米颗粒芯部在甲醇中的1mL悬浮液以14000rpm离心2分钟，通过倾析上层清液分离纳米颗粒。将α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧丙基)氨基]乙基}聚乙二醇(SAA-PEG-SAA，如下所示,MW＝2000g/mol)、生物素-PEG-COOH(MW＝2000g/mol)、N-(3-氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺(2.1mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.5mg)在甲醇中的1mL溶液用于通过温柔的超声处理使纳米颗粒球团重新分散，并将所得悬浮液在室温下搅拌1小时。表1中示出了SAA-PEG-SAA和生物素-PEG-COOH的相对量。将悬浮液以14000rpm离心2分钟以便使所得氧化硅-LEP纳米颗粒从含有过量的未反应聚乙二醇化试剂的上层清液分离。通过倾析除去上层清液，并使用温柔的超声处理将分离的纳米颗粒球团重新分散在1mL的新鲜甲醇中。将由离心、倾析和重新分散于甲醇(1mL)中组成的洗涤循环重复另外两次。在最后的离心和倾析之前，将悬浮液等分成四个250μL部分，并在使用前将所得球团储存在-20℃。
Figure BDA0002983519120000201
表1
样品 <u>SAA-PEG-SAA的质量</u> <u>生物素-PEG-COOH的质量</u>
0.1wt％生物素 <u>9.99mg</u> <u>0.01mg</u>
1wt％生物素 <u>9.9mg</u> <u>0.1mg</u>
10wt％生物素 <u>9mg</u> <u>1mg</u>
实施例2-生物素化的纳米颗粒与链霉亲和素的缀合
通过温柔的超声处理，将实施例1的分离的聚乙二醇化纳米颗粒球团之一重新悬浮于1mL磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4，含有1wt％的牛血清白蛋白)中，然后立即添加50μL链霉亲和素在相同缓冲液中的溶液(1mg/mL)。将悬浮液在室温下搅拌1小时，然后将样品以14000rpm离心3分钟，以便将蛋白质缀合的纳米颗粒与上层清液和未缀合的蛋白质分离。通过温柔的超声将球团重新悬浮于100μL的磷酸盐缓冲盐水中以便存储。
实施例3-纳米颗粒的稳定性
用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)形成如实施例1所述的带有惰性PEG表面基团和生物素取代的PEG表面基团的纳米颗粒的胶体，并使用动态光散射定期测量纳米颗粒的Z平均直径，以确定纳米颗粒的聚集。
参考表1，在较高的纳米颗粒浓度下，特别是高于0.1mg/mL的浓度，聚集令人惊讶地降低。
研究了具有1mol％或10mol％生物素取代的PEG基团的实施例1和2(即具有和不具有链霉亲和素)中所述的纳米颗粒在PBS中的稳定性。
参照表2，对于没有链霉亲和素的1摩尔％和10摩尔％的生物素取代的PEG基团，在较低浓度的PBS中稳定性高得多。在较高浓度的生物素取代的PEG基团下，当附着链霉亲和素时稳定性显著较低。然而，发现这两种纳米颗粒都比其中100％的表面基团带有生物素取代PEG基团的纳米颗粒稳定得多；发现该纳米颗粒在PBS中分散后数分钟内发生聚集。
表2
Figure BDA0002983519120000221
表2的稳定时间是在5℃下储存并且在测量之间没有搅动时通过动态光散射确定的颗粒的Z平均直径超过起始直径的10％所用的时间。
通过使用含链霉亲和素的颗粒来研究通过与不同纳米颗粒的生物素分子结合所致的链霉亲和素引起聚集的可能性，所述含链霉亲和素的颗粒是使用实施例2的方法形成，且具有大量过剩的链霉亲和素以便减少或消除具有游离生物素基团的纳米颗粒的出现。观察到类似的聚集，这表明链霉亲和素并不通过结合至不同的纳米颗粒而促进聚集。
实施例4—聚集对生物测定灵敏度的影响
制备用于生物测定的生物素-BSA改性的载玻片
将用(3-氨基丙基)硅烷的自组装单层官能化的显微镜载玻片浸入含有琥珀酸酐(1g)和三甲胺(1.3mL)在乙腈(50mL)中的溶液持续16小时，然后用新鲜的乙腈(50mL)洗涤三次。干燥后，将Grace-Biolabs Secure Seal成像间隔物附贴到所得羧基官能化的载玻片的表面，以便分离四个圆形区域(直径＝9mm)，用于随后的结合测定。在载玻片的每个分离区域内添加80μL的含有N-(3-氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺(77.0mg)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(33.0mg)的1mL溶液。在室温下放置30分钟之后，除去溶液并将分离的区域用水(80μL)洗涤三次。在除去最后一次洗涤溶液之后，向所述区域中的两个加入80μL的生物素化牛血清白蛋白(50μg/mL)在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中的溶液，并向两个剩余区域加入80μL的封闭缓冲液，该封闭缓冲液在含有0.01重量％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中包含牛血清白蛋白(3重量％)。在室温下1小时之后，从含有生物素化的牛血清白蛋白溶液的两个区域中除去溶液，并在它们的位置中加入80μL上述封闭缓冲液。在室温下再过一小时后，从所有四个区域除去溶液，并用含0.01重量％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)将每个区域洗涤三次。
使用链霉亲和素修饰的纳米颗粒进行生物素结合测定
将含有0.1mol％、1mol％和10mol％的如实施例2中所述的链霉亲和素修饰的生物素化纳米颗粒的胶体(0.1mg/mL，在含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水中)施加到载玻片。在室温下放置30分钟后，将溶液去除并用80μL磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)洗涤3次。在空气中干燥之后，使用基于显微镜的光谱仪，使用汞灯作为激发源(λex＝365nm)和用于检测的光纤光谱仪，测量四个测定区域中的每个区域的荧光强度。通过将用生物素官能化的区域产生的平均积分强度除以仅用BSA(无生物素)封闭的区域的平均强度，即可确定信噪比。
如图3所示，对于1mol％的生物素化纳米颗粒，观察到最强的信噪比。不希望受任何理论束缚，这归因于如下：与0.1mol％的生物素化的纳米颗粒相比而言更高百分比的生物素化基团，以及与10mol％的生物素化纳米颗粒相比而言更少的聚集(这使得结合基团更难以接近)。
实施例5—表面基团分子量的影响
按实施例1所述制备纳米颗粒，不同之处在于使氨基仅与SAA-PEG-SAA(Mw 550、100、2000或5000Da)反应或仅与mPEG-SAA(如下所示，MW 550、100、2000和5000Da)反应，即所得表面基团不包括具有生物分子结合基团的基团。
Figure BDA0002983519120000241
发现所有颗粒均在甲醇中形成分散液，并保持稳定超过1个月。
为了确定颗粒在缓冲溶液中的稳定性，通过DLS测量PEG涂覆的颗粒在甲醇中的1mg/mL分散液以确定颗粒的Z平均直径。
然后通过离心和倾析上层清液从甲醇分散剂中分离出1mg的纳米颗粒，并通过在超声浴中超声处理5分钟，将其重新分散在1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中。
在5、60、300和1440分钟之后(或直到它们聚集的时刻)，测量在PBS中的分散体的DLS测量值，在测量之间将样品于室温下置于密封试样管中。
参考图4，发现通过芯部与mPEG-SAA的反应形成的具有甲氧基PEG封端的表面基团的所有纳米颗粒在PBS中分散的5分钟内均已聚集。
参考图5，通过芯部与SAA-PEG-SAA反应形成的具有羧基封端的表面基团的纳米颗粒稳定长达24小时，这取决于表面基团的Mw。
实施例6-将生物素化的抗体缀合到实施例2中所述的1mg链霉亲和素官能化的纳米颗粒，添加250μL的0.5mg/mL生物素化山羊抗小鼠抗体(克隆Poly4053，购自Biolegend)，然后将混合物在室温下搅拌1小时。重复该步骤四次。在最后一步时，将球团重新悬浮于500μL的BSA/PBS中从而使最终颗粒浓度为2mg/mL。
实施例7-流式细胞术测定
在Propel Labs YETI分析仪上进行流式细胞仪分析。
BV421-抗人类CD4(克隆SK3)[BV421-hCD4]和BV421-小鼠IgG1，κ同种型(克隆MOPC-21)[BV421-同种型]购自Biolegend。
CYTO-TROL细胞由Beckman Coulter提供。
1.使用前将CYTO-TROL细胞升至室温，并重新悬浮于制造商提供的缓冲液中。
2.在微量离心管中的BSA/PBS中将抗体标签稀释至所需浓度。
3.将100μL的制备Cyto-Trol添加到每种抗体-NP稀释液中。将制剂充分混合，并在4℃下培养30分钟，避免直射光。
4.培养之后，用细胞染色缓冲液将细胞洗涤两次，在4℃以2000rpm离心3分钟，并将上层清液丢弃。
5.将细胞重新悬浮于200μL细胞染色缓冲液中以备分析。
6.为了进行分析，使用0.5μL/秒的流速。对单个细胞进行数据选通，对于每次测量在该选通中获取10000个事件。
筛选一系列不同的示例性纳米颗粒NP(x)-hCD4(其中NP是如实施例6中所述的纳米颗粒；对于链霉亲和素x＝s；对于中性亲和素x＝n；hCD4＝抗人类CD4抗体)稀释液以确定每种染料的最大染色指数的最佳工作浓度。
使用中性亲和素的抗体缀合如上文关于链霉亲和素所述，不同之处在于，使用50μL的中性亲和素在PBS中的1mg/mL溶液代替链霉亲和素。
染色指数[SI]为：
SI＝(MFI1-MFI2)/2xSD)
其中MFI1是阳性群体的中值荧光强度；MFI2是阴性群体的中值荧光强度，并且SD是阴性信号的标准偏差。
对比较标记物BV421-hCD4进行相同的操作，其中BV421是可从BioLegend获得的溶解的荧光聚合物Brilliant Violet 421TM。
调整电压以确保阴性信号和阳性信号均在刻度上。对于NP(n)-hCD4，不可能找到阴性信号和阳性信号完全在刻度上的电压，因此使用阴性信号完全在刻度上的电压进行分析。
表1
Figure BDA0002983519120000261
每个标签的最佳浓度经确定为：
·BV421-hCD4：250μg/mL
·NP(s)-hCD4：31.3μg/mL
·NP(n)-hCD4：15.6μg/mL
对于每个通道的BV421-hCD4、NP(s)-hCD4和NP(n)-hCD4的最佳电压相同，总结于表2中：
表2
发射通道(激光线nm) 电压/V
FSC 370
SSC 478
420/10(405) 470
460/22(405) 421
525/50(405) 380
615/24(405) 471
525/35(488) 460
593/52(488) 424
692/80(488) 520
750LP(488) 630
按上文所述，对表3的以下标签中的每一种以它们的最佳浓度和最佳电压按一式三份进行测量：
表3
标签类型 标签 对照物
BV421 BV421-hCD4 BV421—同种型
NP(s) NP(s)-hCD4 NP(s)—同种型
NP(n) NP(n)-hCD4 NP(n)—同种型
对实施例1的生物素化的纳米颗粒(即没有链霉亲和素或中性亲和素)和未染色的细胞进行相同的操作。
将未与链霉亲和素或中性亲和素缀合的这些颗粒等分到微量离心管中。将悬浮液以14000rpm离心4分钟；将溶剂倾析，并且使用超声将球团重新悬浮于100μL的BSA/PBS中，从而得到10mg/mL的最终颗粒浓度。
结果：NP(s)-hCD4
在图6和表4中将使用NP(s)-hCD4的Cyto-Trol细胞的染色与使用BV421-hCD4时进行对比。与BV421-hCD4相似，NP(s)-hCD4对阴性细胞的染色可忽略不计。然而，NP(s)-hCD4的阳性信号明显移向更高的消光系数，而相对于BV421-hCD4的阳性信号的标准偏差仅略有增加。MFI1的增加导致NP(s)-hCD4相对于BV421的染色指数增加约2.5倍。
表4
Figure BDA0002983519120000271
在图7和表5中进一步证明了源自NP(s)的颗粒的低阴性染色。未官能化的NP(s)-同种型或NP(s)-hCD4均未显示任何显著的阴性染色，这表明如本文所述的荧光纳米颗粒以及它们的链霉亲和素缀合的衍生物和抗体缀合的衍生物对细胞具有低的非特异性吸收。
表5
Figure BDA0002983519120000272
结果：NP(n)-hCD4
对于NP(s)-hCD4，将用NP(n)-hCD4对Cyto-Trol细胞的染色与图8和表6中的BV421-hCD4进行了比较。正如NP(s)-hCD4，NP(n)-hCD4显示出可忽略不计的阴性染色。NP(n)-hCD4的较明亮的阳性信号给出了相对于BV421-hCD4为5.4倍的染色指数。
表6
Figure BDA0002983519120000281
在图9和表7中进一步证明了NP(n)衍生颗粒的低阴性染色。未官能化的NP(n)-同种型或NP(n)-hCD4均未显示任何明显的阴性染色，这表明荧光NP以及它们的中性亲和素缀合的衍射物和抗体缀合的衍生物对细胞具有低的非特异性吸收。
表7
Figure BDA0002983519120000282
第一生物素基团密度的影响
使用实施例1中所述的纳米颗粒研究了第一生物素基团密度(以及因此前体纳米颗粒表面上的蛋白质结合位点的数目)的影响，区别在于生物素-PEG-COOH占生物素-PEG-COOH+SAA-PEG-SAA总重量的百分比变为0.5重量％、1重量％、5重量％和10重量％。
表8中显示了用于第一表面基团和第二表面基团的不同重量百分比的试剂的体积：
表8
Figure BDA0002983519120000291
使用Biolegend提供的生物素小鼠抗人类CD4抗体(克隆SK3)形成与抗人类CD4[NP(x)-hCD4]缀合的纳米颗粒。
同种型对照颗粒[NP(x)-同种型]使用Biolegend提供的生物素小鼠IgG1，κ同种型(克隆MOPC-21)。
筛选了一系列不同的NP(s)-x％hCD4(其中x＝0.5、1、5或10，代表用于使NP官能化的PEG-生物素的百分比)和BV421-hCD4稀释液，以确定每种染料的最大染色指数的最佳工作浓度。
调节电压以确保阴性信号和阳性信号均在刻度上。
表9
Figure BDA0002983519120000292
每个标签的最佳浓度经确定为：
·BV421-hCD4：250μg/mL
·NP(s)-0.5％hCD4：62.5μg/mL
·NP(s)-1％hCD4：250μg/mL
·NP(s)-5％hCD4：125μg/mL
·NP(s)-10％hCD4：62.5μg/mL
对于每个通道的BV421-hCD4和NP(s)-x％hCD4的最佳电压相同，汇总在表10中：
表10
发射通道(激光线) 电压/V
FSC 370
SSC 478
420/10(405) 470
460/22(405) 421
525/50(405) 380
615/24(405) 471
525/35(488) 460
593/52(488) 424
692/80(488) 520
750LP(488) 630
以如上所述的最佳浓度和最佳电压对表11的标签按一式三份进行测量：
表11
标签类型 标签 对照物
BV421 BV421-hCD4 BV421-同种型
NP(s)-0.5％ NP(s)-0.5％hCD4 NP(s)-0.5％同种型
NP(s)-1％ NP(s)-1％hCD4 NP(s)-1％同种型
NP(s)-5％ NP(s)-5％hCD4 NP(s)-5％同种型
NP(s)-10％ NP(s)-10％hCD4 NP(s)-10％同种型
还测量了未染色的细胞。
图10和表12中示出了改变表面生物素基团的百分比对Cyto-Trol细胞染色的影响。对于所有的生物素浓度，阴性群体显示出可忽略不计的背景染色，相对于未染色细胞而言；除了1％生物素，这归因于与其他标签相比非常高的最佳染色浓度(250μg/mL)。从上述的链霉亲和素/中性亲和素比较实验中使用的NP(s)-1％hCD4可以看出这种高染色浓度的效果，该实验显示，在31.3μg/mL的低得多的最佳染色浓度下，阴性群体的染色可忽略不计。
因此，可以得出结论，表面生物素浓度在0.5-10％之间变化不会增加所得标签与Cyto-Trol细胞的非特异性结合。
表12
Figure BDA0002983519120000311
这些数据证明，更多的表面生物素导致所得抗体缀合物的更高的染色指数，其中10wt％的生物素标签显示出比0.5wt％的生物素标签高1.9倍的染色指数。即使在0.5wt％生物素下，染色指数也超过了BV421-hCD4。

Claims (21)

1.一种发光标记物颗粒，其包含：发光颗粒芯部，结合至该发光颗粒芯部的第一表面基团和结合至该发光颗粒芯部的第二表面基团，其中：所述发光芯部包含发光材料；所述第一表面基团包括极性基团；所述第一表面基团是惰性的；所述第二表面基团包括生物分子结合基团；并且第二表面基团的摩尔数小于第一表面基团和第二表面基团的总摩尔数的10％。
2.根据权利要求1所述的发光标记物纳米颗粒，其中所述极性基团包含聚醚链。
3.根据权利要求2所述的发光标记物纳米颗粒，其中所述极性基团是式(I)的基团：
-((CR14R15)bO)c-
(I)
其中R14和R15各自独立地为H或C1-6烷基，并且b为至少1，任选地为1-5，优选为2，并且c为至少2，任选地为2-1000，优选地为10-500、10-200，10-100或20-50。
4.根据前述权利要求中任一项所述的发光标记物颗粒，其中所述生物分子结合基团选自：DNA、RNA、肽、碳水化合物、抗体、抗原、酶、蛋白质和激素。
5.根据前述权利要求中任一项所述的发光标记物颗粒，其中所述第二表面基团包括在所述纳米颗粒芯部与所述生物分子结合基团之间的极性基团。
6.根据前述权利要求中任一项所述的发光标记物颗粒，其中所述发光材料是发光聚合物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的发光标记物颗粒，其中所述纳米颗粒芯部包含无机基质。
8.根据权利要求7所述的发光标记物颗粒，其中所述无机基质是无机氧化物。
9.根据权利要求8所述的发光标记物颗粒，其中所述无机氧化物是氧化硅。
10.形成根据前述权利要求中任一项所述的发光标记物颗粒的方法，包括：
提供发光颗粒芯部，该发光颗粒芯部具有结合到其表面的多个第一反应性基团；
形成第一表面基团，其中第一表面基团的形成包括使一部分第一反应性基团与第一化合物反应；和
形成第二表面基团，其中第二表面基团的形成包括使一部分第一反应性基团与第二化合物反应。
11.根据权利要求10的方法，其中所述第一反应性基团与所述第一化合物和第二化合物中的至少一者反应以形成将所述第一表面基团或第二表面基团结合到所述发光颗粒芯部的酰胺结合基团。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中通过使式(I)的化合物与发光颗粒芯部的表面处的氧化硅反应来在其表面上形成第一反应性基团：
(R7O)3Si-(Sp1)x-RG1
(I)
其中R7为H或取代基；
Sp1是间隔基团；
x是0或1；和
RG1是第一反应性基团。
13.一种胶体，其包含悬浮在液体中的根据权利要求1-10中任一项所述的发光标记物颗粒。
14.根据权利要求13所述的胶体，其中所述液体包括水。
15.根据权利要求13或14所述的胶体，其中所述液体是缓冲溶液。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的胶体，其中所述发光标记物纳米颗粒的浓度大于0.1mg/mL。
17.一种标记生物分子的方法，所述方法包括将所述生物分子与根据权利要求1-9中任一项所述的颗粒结合的步骤。
18.一种用于靶标分析物的测定方法，包括使样品与根据权利要求1-9中任一项所述的发光标记物颗粒接触，以及确定所述靶标分析物与所述发光标记物的任何结合。
19.根据权利要求18所述的测定方法，其中通过流式细胞术来分析与发光标记物颗粒接触的样品。
20.根据权利要求19所述的测定方法，其中确定结合到所述发光标记物颗粒的靶标分析物的量。
21.根据权利要求20所述的测定方法，其中所述样品包含细胞的混合物，并且对结合到发光标记物的一种或多种不同类型的靶标细胞进行鉴定和/或量化。
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