CN112739422B - Cd200r激动剂抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗人CD200R激动剂抗体、及其治疗疾病如特应性皮炎、慢性自发性荨麻疹、***反应、哮喘、硬皮病、IBD、SLE、MS、RA、GvHD、或银屑病的用途。

Description

CD200R激动剂抗体及其用途
本发明属于药物领域。更具体地说，本发明涉及针对CD200受体(CD200R)的激动性抗体、包括这类CD200R激动性抗体的组合物，和使用这类CD200R激动性抗体治疗病症如自身免疫疾病，变应性疾病、哮喘或其他炎性病症的方法。
免疫检查点途径可以调节自身免疫应答和抗癌免疫应答。在自身免疫疾病疗法中，想要促进，即，激动，免疫抑制性途径的作用，从而抑制免疫应答。反过来，在癌疗法中，想要抑制，即，拮抗，免疫抑制性途径的作用，从而阻抑(刺激)免疫应答。
CD200R是Ig超家族成员及负向调节免疫细胞活化的检查点受体家族的一部分。激活CD200R途径导致细胞功能降低(如细胞增殖降低)和抑制炎性细胞因子。CD200R主要表达在先天***的细胞的表面上，尤其单核细胞世系如巨噬细胞、肥大细胞、树突细胞的表面上，还表达在活化的T细胞亚群如T记忆细胞上。CD200R的天然配体是CD200，其更广泛地表达在多个细胞类型上，包括淋巴细胞。CD200R敲除小鼠和CD200敲除小鼠具有正常表型，但更易患诱导型自身免疫疾病(参见，例如，Simelyte等人,Clin Exp Immunol.162:163-8(2010))。反过来，小鼠中CD200过量表达提供同种异体移植抵抗和DSS所致结肠炎(Chen等人,PLoS One.2016；11(2):e0146681.doi:10.1371/journal.pone.0146681)。
因此，增加CD200R介导的信号传导构成一个管理自身免疫病症病症的潜在方案，所述潜在方案可能导致胜过现有免疫调节疗法的深远疾病调节作用和应答持久性连同关键的安全益处。例如，CD200R高度表达于分化的组织定居性细胞中，如巨噬细胞、肥大细胞、树突细胞和先天淋巴样细胞。这些细胞类型促成疾病(如异位性皮炎)的病变，并且因此CD200R激动剂抗体可以减弱这些细胞在疾病如异位性皮炎中的活跃度。
该领域已努力递送治疗有效和安全的CD200R激动性抗体。至少部分地认为难题是生理环境下为实现CD200R激动作所需的复杂细胞相互作用的结果连同安全顾虑最小(例如不诱导细胞因子释放)。
美国专利8,212,008公开了CD200R抗体，如Dx182。Dx182是一种激动CD200R并阻断CD200与CD200R结合的人源化IgG1抗体。然而，Dx182还结合于并激活鼠肥大细胞中表达的的食蟹猴CD200RLa(食蟹猴激活形式)，并且因而借助食蟹猴CD200RLa诱导这些细胞中的肥大细胞脱颗粒应答。WO 2015/057906也公开了CD200R激动剂抗体，如H2RM147。H2RM147可能与人CD200竞争结合于人CD200R1。
因此，需要备选性CD200R抗体，所述抗体1)以对于最佳激动剂活性需要的缔合和解离速率结合人CD200R，2)激动人CD200R，以实现免疫抑制性应答和体内效力，3)作为治疗和/或预防病症如自身免疫病症、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症的单一疗法，显示足够的效力，4)不引起明显的细胞因子释放，5)不阻断结合人CD200和人CD200R，6)不结合CD200RLa或以低亲和力结合CD200RLa和/或7)展示低免疫原性(即，在食蟹猴和/或人中基本上无免疫原性)和对于治疗自身免疫病症、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症时开发和/或使用是可接受的体内稳定性、物理和化学稳定性，包括但不限于热稳定性、溶解度、低自我缔合和药代动力学特征。
因此，本发明提供新的抗人CD200R激动剂抗体。本发明的抗体就至少以下特性而言相对于现有CD200R激动剂抗体是特别有利的：1)合乎需要的缔合和解离速率，2)激动人CD200R以实现免疫抑制性应答和体内效力，3)作为治疗和/或预防自身免疫病症、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症的单一疗法足够地强力，4)无明显的细胞因子释放，5)与现有抗体相比，不阻断人CD200与人CD200R结合及其与不同的表位结合，6)相比与人CD200R结合，缺少食蟹猴CD200RLa结合作用或以低亲和力与之结合、和/或7)低免疫原性(即，在食蟹猴和/或人中基本上无免疫原性)和对于治疗自身免疫病症、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症时开发和/或使用是可接受的体内稳定性、物理和化学稳定性，包括但不限于热稳定性、溶解度、低自我缔合和药代动力学特征。
使用显著工程化的抗人CD200R激动剂抗体，本发明借助免疫检查点刺激，通过提供可用于预防、下调或改善自身免疫性和/或免疫耐受性相关病症、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症的组合物和方法，提供胜过现有技术的进展。本发明的抗人CD200R激动剂抗体，优选地，通过抑制免疫应答先天装备(innate arm of the immune response)、消除抗原特异性免疫过程并且因而直接解决基础性疾病病变，能够改善免疫病变或恢复免疫稳态。临床上，这类抗体的使用可以导致疾病接受治疗的长期持久性。
因此，本发明提供抗体一种结合人CD200R(SEQ ID NO:15)的抗体，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2给出，并且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3给出，LCDR1的氨基酸序列由SEQID NO:4给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5给出，并且LCDR3的氨基酸序列由SEQ IDNO:6给出。
在一个实施方案中，本发明提供一种结合人CD200R的抗体，其包含HCVR和aLCVR，其中HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:7给出并且LCVR的氨基酸序列是由SEQ ID NO:8给出。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:7的位置1处的Xaa是谷氨酰胺。在其他实施方案中，在SEQID NO:7的位置1处的Xaa是焦谷氨酸。
在一个实施方案中，本发明提供一种结合人CD200R的抗体，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出并且LC的氨基酸序列是由SEQ ID NO:10给出。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是谷氨酰胺。在其他实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是焦谷氨酸。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa是甘氨酸。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa不存在。在一个具体实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是谷氨酰胺并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa是甘氨酸。在另一个具体实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是焦谷氨酸并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa是甘氨酸。在一个具体实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是谷氨酰胺并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa不存在。在另一个具体实施方案中，在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是焦谷氨酸并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa不存在。
在一个实施方案中，本发明的抗体不引起明显的细胞因子释放。在另一个实施方案中，抗体是CD200R激动剂抗体。在一个优选的实施方案中，抗体不引起明显的细胞因子释放并且抗体是CD200R激动剂抗体。在一些此类实施方案中，抗体是IgG4亚型，优选地IgG4P。在另一个实施方案中，抗体结合人和食蟹猴CD200R。
本公开还提供一种能够表达抗人CD200R抗体的哺乳动物细胞，所述抗体包含：1)HCVR，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，和2)LCVR，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，本公开提供一种能够表达抗人CD200R抗体的哺乳动物细胞，所述抗体包含：1)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR。在一些实施方案中，本公开提供一种能够表达抗人CD200R抗体的哺乳动物细胞，所述抗体包含：1)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链；和2)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，本公开提供了：CD200R抗体由各自具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和各自具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体不引起明显的细胞因子释放。在另一个实施方案中，抗体是CD200R激动剂抗体。在一个优选的实施方案中，抗体不引起明显的细胞因子释放并且抗体是CD200R激动剂抗体。在一些此类实施方案中，抗体是IgG4亚型，优选地IgG4P。在另一个实施方案中，抗体结合人和食蟹猴CD200R。
本公开还提供一种产生抗人CD200R抗体的方法，所述方法包括：a)培育能够表达该抗体的哺乳动物细胞，其中抗体包含1)HCVR，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，和2)LCVR，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；和b)回收抗体。在一些实施方案中，本公开提供一种产生CD200R抗体的方法，所述方法包括：a)培育能够表达该抗体的哺乳动物细胞，其中抗体包含：1)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCVR；和2)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCVR；和b)回收抗体。在一些实施方案中，本公开提供一种产生抗人CD200R抗体的方法，所述方法包括：a)培育能够表达该抗体的哺乳动物细胞，其中抗体包含：1)具有SEQID NO:9的氨基酸序列的重链；和2)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链；和b)回收抗体。在一些实施方案中，本公开提供一种产生抗人CD200R抗体的方法，所述方法包括：a)培育能够表达该抗体的哺乳动物细胞，其中抗体由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的两条轻链组成；和b)回收抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体不引起明显的细胞因子释放。在另一个实施方案中，抗体是CD200R激动剂抗体。在一个优选的实施方案中，抗体不引起明显的细胞因子释放并且抗体是CD200R激动剂抗体。在一些此类实施方案中，抗体是IgG4亚型，优选地IgG4P。在另一个实施方案中，抗体结合人和食蟹猴CD200R。
本公开还提供通过前述方法产生的CD200R抗体。本公开还提供一种药物组合物，其包含通过前述方法产生的CD200R抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开还提供一种DNA分子，其包含具有SEQ ID NO:12的序列的多核苷酸。本公开还提供一种DNA分子，其包含具有SEQ ID NO:13的序列的多核苷酸。本公开还提供一种DNA分子，其包含具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列的多核苷酸。本公开还提供一种包含多核苷酸的DNA分子，所述多核苷酸编码其氨基酸序列是SEQ ID NO:9的序列的抗体HC。在一个实施方案中，编码抗体HC的DNA分子由SEQ ID NO:12给出。本公开还提供一种包含多核苷酸的DNA分子，所述多核苷酸编码其氨基酸序列是SEQ ID NO:10的序列的抗体LC。在一个实施方案中，编码抗体LC的DNA分子由SEQ ID NO:13给出。
本公开还提供包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含具有SEQ ID NO:12的序列的多核苷酸。本公开还提供包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含具有SEQID NO:13的序列的多核苷酸。本公开还提供一种包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列的多核苷酸。
本发明还提供包含本发明抗体的药物组合物。
本发明还提供一种治疗患有疾病的患者的方法，其中疾病是自身免疫疾病、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症，包括向有需要的患者施用有效量的本发明抗体。
本发明还提供本发明的抗体用于疗法中。
本发明还提供本发明的抗体，其用于治疗疾病，其中疾病是自身免疫疾病、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症。
本发明还提供本发明抗体制造用于治疗疾病的药物的用途，其中疾病是自身免疫疾病、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症。
在一个实施方案中，疾病是自身免疫疾病。在另一个实施方案中，疾病是变应性疾病。在另一个实施方案中，疾病是哮喘。在一些实施方案中，疾病是慢性特发性荨麻疹(本文也称作慢性自发性荨麻疹(CSU))，乳糜泻(celiac disease)(包括但不限于难治性乳糜泻II型)、***反应、慢性变应性疾病、食物过敏、嗜酸性食管炎(eosinophilicesophagitis)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、哮喘、硬皮病、天疱疮、肠易激综合症(IBD)、***性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)、移植物抗宿主病(GvHD)、银屑病、肥大细胞增多症、炎性皮肤病，或特应性皮炎。在其他实施方案中，疾病是变应性接触性皮炎、季节性过敏、过敏反应治疗与预防、大疱性类天疱疮和其他自身免疫性疱病、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变、特发性肺纤维化、重症肌无力、血管炎和肌炎。在一个具体实施方案中，慢性变应性疾病是花粉症(hay fever)或变应性鼻炎。在一个优选的实施方案中，疾病是特应性皮炎。
本发明提供结合人CD200R的抗体，其中抗体是CD200R激动剂抗体并且其中抗体不引起明显的细胞因子释放。在一个实施方案中，抗体展示出CD200R激动作用及缺少显著的细胞因子释放，与CD200R激动作用类似并且缺少如抗体I-4P所展示的明显细胞因子释放。在一个实施方案中，与野生型(Fc部分中无突变)IgG1抗体(其引起明显的细胞因子释放，尤其IFN-γ释放)相比，CD200R激动剂抗体不引起明显的细胞因子释放。在一个具体实施方案中，本发明提供一种CD200R激动剂抗体，其中相比与CD200R激动剂抗体具有相同CDR的野生型IgG1抗体，抗体不引起显著的细胞因子释放。在一个实施方案中，通过以下方式检测到显著的细胞因子释放：将与抗体温育的血液样品中存在的细胞因子的量同不与抗体温育的血液样品中存在的细胞因子的量比较，并且如果与抗体温育的血液样品中存在的细胞因子的量至少三倍高于无抗体的血液样品中存在的细胞因子的量，则确定存在显著的细胞因子释放。
在一个实施方案中，抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2给出，并且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3给出，LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5给出，并且LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6给出。在一个实施方案中，抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:7给出并且LCVR的氨基酸序列是由SEQ ID NO:8给出。
本发明提供了结合FcγRI、FcγRIIA_131H、FcγRIIA_131R、FcγRIIb和FcγRIIIA_158V中至少一者、至少两者，至少三者、至少四者或全部的本发明抗体。
在一个实施方案中，抗体以约70pM至约500pM的结合亲和力结合FcγRI。在另一个实施方案中，抗体以约2μM至约5μM的结合亲和力结合FcγRIIA_131H。在另一个实施方案中，抗体以约1μM至约5μM的结合亲和力结合FcγRIIA_131R。在另一个实施方案中，抗体以约1μM至约4μM的结合亲和力结合FcγRIIb。在另一个实施方案中，抗体以约1μM至约6μM的结合亲和力结合FcγRIIIA_158V。在另一个实施方案中，抗体进一步以大于9μM的结合亲和力结合FcγRIIIA_158F。
在一个实施方案中，抗体对受体的结合亲和力是针对FcγRI为约70pM至约500pM，针对FcγRIIA_131H为约2μM至约5μM，针对FcγRIIA_131R为约1μM至约5μM，针对FcγRIIb为约1μM至约4μM，针对FcγRIIIA_158V为约1μM至约6μM并且针对FcγRIIIA_158F为大于9μM。在一个更具体的实施方案中，抗体对受体的结合亲和力是针对FcγRI为约400pM，针对FcγRIIA_131H为约4μM，针对FcγRIIA_131R为约2μM，针对FcγRIIb为约2μM，针对FcγRIIIA_158V为约4μM并且针对FcγRIIIA_158F大于10μM。在又一个实施方案中，抗体不结合C1q。在一些实施方案中，在25℃通过表面等离子体共振测定结合亲和力。在其他实施方案中，通过ELISA测定与C1q的结合。
如本文所用，“CD200R”指CD200受体。如本文所用，“hCD200R”或“人CD200R”指野生型人CD200R，并且，优选地指具有SEQ ID NO:15中所述氨基酸序列的野生型人CD200R。
术语“cyno”、“食蟹猴(cynomolgus)”或“食蟹猴(cynomolgus monkey)”在本文中互换地使用。当指称CD200R多肽使用时，除非另外规定，该术语意指野生型食蟹猴CD200R，并且优选地指具有SEQ ID NO:16中所述氨基酸序列的野生型猴CD200R。术语“CD200RLa”或“激活形式”指具有SEQ ID NO:17中所述氨基酸序列的食蟹猴CD200R。CD200RLa是人CD200R的密切同源物，但无相反的(激活)活性。因此，相比与CD200R结合的抗体，优选的CD200R激动剂抗体以显著降低的亲和力结合CD200RLa。
如本文所用，“人CD200R激动剂抗体”或“抗人CD200R激动剂抗体”指与人CD200R结合的抗体，并且当体外或体内施用时，导致实现免疫抑制性应答，如至少一种显著削弱的所需活性如想要的IL-8产生减少。如本文所用，术语“产生”和“分泌”如其涉及细胞因子，则可互换地使用。
如本文所用的术语“抗体”指一种工程化的非天然存在的多肽复合体，其具有两条重链(HC)和两条轻链(LC)，从而重链和轻链通过二硫键互连，其中抗体是IgG同种型抗体。每条重链包含N端HCVR和重链恒定区。每条轻链包含N端LCVR和轻链恒定区。在某些生物***中表达时，抗体在Fc区内糖基化。一般，糖基化出现在抗体的Fc区内高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖一般与天冬酰胺接合。抗体也可以在其他位置糖基化。
本发明的抗体可以是IgG1或IgG4抗体。优选地，本发明的抗体是IgG4抗体。IgG4抗体可以在HC内部具有S228P突变(即，IgG4P)，其中已知所述突变消除对人IgG4亚类常见的半抗体形成。
重链的恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。CH1接续于HCVR之后；CH1和HCVR形成抗原结合(Fab)片段的重链部分，所述抗原结合片段是结合抗原的抗体的部分。CH2接续于铰链区之后及CH3之前。CH3接续于CH2之后并处以重链的羧基末端。轻链的恒定区含有一个结构域CL。CL接续于LCVR之后；CL和LCVR形成Fab的轻链部分。
本发明抗体的HCVR区和LCVR区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布更保守的区域，称为框架区(FR)。每个HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。这里，重链的三个CDR称作“HCDR1、HCDR2和HCDR3”并且轻链的三个CDR称作“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDR含有大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。Kabat CDR定义(Kabat等人,Ann.NYAcad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(有免疫学意义蛋白质的序列),第五版,美国卫生和公众服务部，NIH出版编号91-3242(1991))以抗体序列变异性为基础。Chothia CDR定义(Chothia等人,“Canonicalstructures for the hypervariable regions of immunoglobulins(免疫球蛋白高变区的规范结构)”,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987)；Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins(免疫球蛋白规范结构的标准构象)”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))以抗体的三维结构和CDR环的拓扑学为基础。Chothia CDR定义与Kabat CDR定义相同，例外是HCDR1和HCDR2。North CDR定义(North等人,“A New Clustering of Antibody CDR LoopConformations(抗体CDR环构象的新聚类)”,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))以众多晶体结构的AP聚类(affinity propagation clustering)为基础。出于本发明目的，氨基酸归属于本发明抗体的LCVR区和HCVR区内部的CDR结构域以熟知的Kabat编号惯例和North编号惯例为基础。在本发明抗体的轻链CDR情况下，使用North CDR定义。在重链中，HCDR1和HCDR3均还使用North定义。HCDR2使用North定义和Kabat定义的混合体。North定义用来鉴定起始N端位点，而Kabat用来界定最后位置。
本发明构思，本发明的抗体是人抗体或人源化抗体。在单克隆抗体的语境下，术语“人”和“人源化”是本领域普通技术人员熟知的(Weiner LJ,J.Immunother.2006；29:1-9；Mallbris L等人,J.Clin.Aesthet.Dermatol.2016；9:13-15)。
本发明的DNA分子是这样的DNA分子，其包含非天然存在的编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有本发明抗体中至少一种多肽(例如，重链、轻链、可变重链和可变轻链)的氨基酸序列。
可以通过将编码HCVR的DNA与编码重链恒定区的另一个DNA分子有效连接，使编码HCVR区的分离的DNA转化成全长重链基因。本领域已知人以及其他哺乳动物的重链恒定区基因的序列。例如可以通过标准PCR扩增法获得涵盖这些区域的DNA片段。
可以通过将编码LCVR的DNA与编码轻链恒定区的另一个DNA分子有效连接，使编码LCVR区的分离的DNA转化成全长轻链基因。本领域已知人以及其他哺乳动物的轻链恒定区基因的序列。可以通过标准PCR扩增法获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ恒定区或λ恒定区。优选地，对于本发明的抗体，轻链恒定区是κ恒定区。
本发明的多核苷酸可以在该序列已经与表达控制序列有效连接后表达于宿主细胞中。表达载体一般在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分是可复制的。通常，表达载体将含有选择标记，例如，四环素标记、新霉素标记和二氢叶酸还原酶标记，以允许检测那些用所需DNA序列转化的细胞。
可以在哺乳动物细胞中轻易地产生本发明的抗体，所述哺乳动物细胞的非限制性实例括CHO、NS0、HEK293或COS细胞。使用本领域熟知的技术培养宿主细胞。
可以通过熟知方法将含有目的多核苷酸序列(例如，编码抗体的多肽和表达控制序列的多核苷酸)的载体转移至宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型变动。
多种蛋白质纯化方法可以用来纯化蛋白质，所述方法包括但不限于抗体，并且这类方法是本领域已知的。
可以通过肠胃外途径施用本发明的抗体或包含所述抗体的药物组合物，肠胃外途径施用的非限制性实例是皮下施用和静脉内施用。本发明的抗体可以与可药用载体、稀释剂或赋形剂一起按单剂或多剂施用至患者。本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的方法来制备(例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版(2012),A.Loyd等人,Pharmaceutical Press)并且包含(如本文中公开的)抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
如本文所用，术语“自身免疫疾病”或“自身免疫病症”互换使用并且指因针对自身细胞和/或组织或已移植细胞和/或组织的不适宜或不想要的免疫反应所致的不利病况。术语“自身免疫疾病”或“自身免疫病症”意在包含这类病况，无论它们是否由体液或细胞免疫应答介导。“***反应”(或“变应性疾病”)是辅助T细胞2(TH2)驱动的疾病，其主要从TH2细胞的活性发展而来。构思由本文所述的本发明抗体治疗的示例性疾病包括慢性特发性荨麻疹、乳糜泻(包括但不限于难治性乳糜泻II型)、***反应、慢性变应性疾病(如花粉症或变应性鼻炎)、食物过敏、嗜酸性食管炎、MAS、哮喘、硬皮病，并且还有天疱疮、IBD、SLE、MS、RA、GvHD、银屑病、肥大细胞增多症、炎性皮肤病和特应性皮炎。在其他实施方案中，构思由本文所述的本发明抗体治疗的疾病包括变应性接触性皮炎、季节性过敏、过敏反应治疗与预防、大疱性类天疱疮和其他自身免疫性疱病、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变、特发性肺纤维化、重症肌无力、血管炎和肌炎。
术语“慢性特发性荨麻疹”和“慢性自发性荨麻疹(CSU)”在本文中互换地使用。
如本文所用，术语“先天免疫”包括与免疫应答适应性装备(adaptive arm of theimmune response)相反，为启动并维持适应性免疫应答(抗体应答和T细胞应答)所需的免疫应答装备(arm of immune response)。
术语“治疗”(以及其各种词性形式)指延缓、中断、中止、缓解、阻止、减少或者逆转现有症状、病症、病况或疾病其进展或严重程度。
“有效量”意指本发明抗人CD200R激动剂抗体的量或包含这种抗体的药物组合物的量，所述量将对组织、***、动物、哺乳动物或人类激发正在为研究者、医学医生或其他临床医生寻求的生物学反应或医学反应或想要的治疗效果。抗体的有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体在个体中激发所需反应的能力而变动。有效量也是这样一种量，其中抗体的治疗有益作用超过任何有毒或有害作用。这种益处包括以下任一者或多者：对已移植器官的免疫耐受性增加；自身免疫疾病或病症稳定化；或自身免疫病症的体征或症状改善等。有效量可以由本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察类似条件下所获得的结果轻易地确定。本发明抗人CD200R激动剂抗体的有效量可以按单剂或按多剂施用。另外，本发明抗体的有效量可以按多剂的剂量施用，所述量将小于若不施用多于一次时的有效量。为患者确定有效量时，主治医疗执业者考虑众多因素，包括但不限于：患者的体格(例如，体重或体质(mass))、体表面积、年龄和总体健康状况；所涉具体疾病或病症；疾病或病症的程度或牵涉面或严重程度；个体患者的反应；施用的具体化合物；施用模式；所施用制备物的生物利用度特征；选择的给药方案；伴同用药使用情况；和医疗执业者已知的其他相关条件。每周、每两周、每月或每季度肠胃外(包括但不限于皮下、肌内和/或静脉内)剂量可以例如是约50mg至约500mg、约75mg至约500mg、约100mg至约500mg、约125mg至约500mg、约250mg至约500mg、约300mg至约500mg、约350mg至约500mg、约400mg至约500mg、约450mg至约500mg、约50mg至约400mg、约75mg至约400mg、约100mg至约400mg、约125mg至约400mg、约250mg至约400mg、约300mg至约400mg、约350mg至约400mg、约50mg至约300mg、约75mg至约300mg、约100mg至约300mg、约125mg至约300mg、约150mg至约300mg、约175mg至约300mg、约200mg至约300mg、约250mg至约300mg、约50mg至约250mg、约75mg至约250mg、约100mg至约250mg、约125mg至约250mg、约150mg至约250mg、约175mg至约250mg、约200mg至约250mg、约75mg至约250mg、约50mg至约200mg、约75mg至约200mg、约100mg至约200mg、约125mg至约200mg、约150mg至约200mg、约175mg至约200mg、约50mg至约175mg、约75mg至约175mg、约100mg至约175mg、约125mg至约175mg、或约150mg至约175mg。每周、每两周、每月或每季度肠胃外的(包括但不限于皮下、肌内和/或静脉内)剂量可以是约0.5mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约4mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约6mg/kg至约10mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg约8mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约8mg/kg、约2mg/kg至约8mg/kg、约3mg/kg至约8mg/kg、约4mg/kg至约8mg/kg、约5mg/kg至约8mg/kg、约6mg/kg至约8mg/kg、约1mg/kg至约6mg/kg、约2mg/kg至约6mg/kg、约3mg/kg至约6mg/kg、约4mg/kg至约6mg/kg、约5mg/kg至约6mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约4mg/kg、约2mg/kg至约4mg/kg、约3mg/kg至约4mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg或约4mg/kg至约5mg/kg。
然而，还构思了在本文中所提到剂量之下或之上的剂量，尤其考虑本领域技术人员已知的和/或本文所述的剂量注意事项。可以通过定期性评估，监测正在接受治疗的患者的进展，并且若需要，据此调节剂量。
如本文所用，术语患者的“有效反应”或患者的“治疗反应性”指当本公开的抗体施用时赋予患者的临床或治疗益处。这种益处包括以下任一者或多者：对已移植器官的免疫耐受性增加；自身免疫疾病或病症稳定化；或自身免疫病症的体征或症状改善等。
如本文所用，“显著的细胞因子释放”指可以通过普通技术人员已知的方法检测到的可测量细胞因子显著增加。例如，可以在人血液样品中通过ELISA检测到显著的细胞因子释放，其中来自未受刺激的血液的细胞因子水平与血液用抗体温育过的细胞因子水平比较。在一些这类研究中，例如，如果与未受刺激的血液中的水平相比，与抗体温育过的血液中IFN-γ水平至少三倍更高，则可以检出显著的细胞因子释放。
本文公开的方法的潜在优点是在患有自身免疫病症、变应性疾病、哮喘或其他炎性病症的患者中，以可接受的安全特征产生明显和/或长期缓解的可能性，所述可接受的安全特征包含可接受的耐受性、毒性和/或不良事件，从而患者总体上从治疗方法获益。可以通过评价多种自身免疫病症治疗时常用的各种终点测量本公开的治疗的有效性，所述终点包括但不限于美国风湿病学会(American College of Rheumatology)(ACR)20、ACR50、ACR70、银屑病皮损面积和严重指数(Psoriasis Area and Severity Index)(PASI)50、PASI75、PASI90、PASI100、***性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI)。可以任选地使用旨在确定本发明任何具体疗法的有效性的多种其他方案，包括例如，免疫细胞活化标志物、炎症量度、细胞周期依赖性生物标记物测量可视化和/或疼痛评估应答的量度。
实施例：抗体表达和纯化
本发明的抗人CD200R激动剂抗体可以基本上如下那样表达和纯化。可以使用预先确定的最佳HC:LC载体比率(如1:3或1:2)或同时编码HC和LC的单个载体***，用分泌抗体的表达***瞬时或稳定转染适宜的宿主细胞，如HEK 293或CHO。使用许多常用技术中任一技术纯化其中已经分泌有抗体的已澄清培养基。例如，可以将培养基便利地施加至用于Fab片段的柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)，所述柱已经用相容性缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡。可以洗涤所述柱以移除非特异性结合的组分。
可以洗脱结合的抗体，例如，借助pH梯度洗脱(如20mM Tris缓冲液pH 7.0至10mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0、或磷酸盐缓冲盐水pH 7.4至100mM甘氨酸缓冲液pH 3.0)。可以检测抗体级分，如通过SDS-PAGE检测，并且随后可以汇集这些级分。取决于预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常见技术，将抗体浓缩和/或无菌过滤。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换、多模式或羟基磷灰石色谱有效地移除可溶性聚集物和多聚体。这些色谱步骤后抗体的纯度在约95％至约99％之间。
值得注意地，可以在翻译后截去抗体I-4P的C端甘氨酸或抗体I-IgG1的C端赖氨酸。另外，抗体I-4P或抗体I-IgG1的N末端谷氨酰胺可以转化成焦谷氨酸。
产物可以保持冷藏、立即冷冻于-70℃或可以冻干。下文在表1中显示例举的本发明人源化抗体的氨基酸SEQ ID NO。
表1.例举的抗人CD200R激动剂抗体的氨基酸序列
实施例：抗体I-4P结合人和食蟹猴CD200R
在37℃进行表面等离子体共振(SPR)，以确定抗体I-4P对人CD200R、食蟹猴CD200R和食蟹猴CD200RLa(本文文也称作食蟹猴“激活形式”)的结合动力学和亲和力。
T100仪(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、Biacore试剂和Scrubber2评价软件(Biologics 2008)用于抗体I-4P结合过程的SPR分析。使用生产商的EDC/NHS胺偶联方法(Biacore P/N BR-1000-50)，制备CM4芯片(Biacore P/N BR-1006-68)。简而言之，通过按10μL/分钟注射1:1的EDC/NHS混合物7分钟，活化全部4个流动小室(FC)的表面。将蛋白A(Calbiochem P/N 539202)在pH 4.5的10mM乙酸盐缓冲液中稀释至100μg/mL并且以流速10μL/分钟注射7分钟，固定化到全部4个流动小室以实现大约400RU。按10μL/分钟注射乙醇胺7分钟封闭未反应的位点。使用2x 10μL甘氨酸pH 1.5注射来移除任何非共价缔合的蛋白质。运行缓冲液是1x HBS EP+(Biacore P/N BR-1006-69)。
使用IMAC和大小排阻色谱，纯化人、食蟹猴(cyno)和食蟹猴活化性CD200受体。通过因子Xa切割从小鼠中产生的小鼠CD200R Fc融合蛋白，产生小鼠CD200R。小鼠CD200R受体的最终精处理步骤是大小排阻色谱。
对于人和食蟹猴CD200R结合过程，将抗体在运行缓冲液中稀释至2.5μg/mL，并且在流动小室2至4中捕获大约150RU的抗体I-4P(RU捕获)。FC1是参比流动小室；因此，FC1中未捕获抗体。将人和食蟹猴CD200R在运行缓冲液中稀释至500nM并且随后在运行缓冲液中两倍连续稀释至3.9nM。将每个浓度的重复注射物按50μL/分钟注射到全部FC上方，持续250秒，随后是1200秒解离相。通过将15μL 10mM甘氨酸pH 1.5按30μL/分钟注射到全部FC上方两次，进行再生。将扣除参比的数据作为FC2-FC1、FC3-FC1和FC4-FC1采集。在37℃获得量值。使用BIA评估中的“1:1(朗格缪尔)结合”模型，计算亲和力(KD)。
对于食蟹猴激活性CD200R结合过程，将抗体在运行缓冲液中稀释至2.5μg/mL，并且在流动小室2至4中捕获大约150RU的抗体I-4P(RU捕获)。FC1是参比流动小室。将食蟹猴激活性CD200R在运行缓冲液中稀释至8.1μM并且随后在运行缓冲液中2倍连续稀释至63.2nM。将每个浓度的重复注射物按50μL/分钟注射到全部FC上方，持续250秒，随后是1200秒解离相。通过将15μL 10mM甘氨酸pH 1.5按30μL/分钟注射到全部FC上方两次，进行再生。将扣除参比的数据作为FC2 FC1、FC3 FC1和FC4-FC1采集。在37℃获得量值。使用稳态平衡分析连同Scrubber 2评估软件计算亲和力(KD)。
对于小鼠CD200R结合过程，将抗体在运行缓冲液中稀释至2.5μg/mL，并且在流动小室2至4中捕获大约150RU的抗体I-4P(RU捕获)。FC1是参比流动小室。将小鼠CD200R在运行缓冲液中稀释至10μM并且随后在运行缓冲液中2倍连续稀释至78nM。将每个浓度的重复注射物按50μL/分钟注射到全部FC上方，持续250秒，随后是1200秒解离相。通过将15μL10mM甘氨酸pH 1.5按30μL/分钟注射到全部FC上方两次，进行再生。将扣除参比的数据作为FC2 FC1、FC3 FC1和FC4-FC1采集。在37℃获得量值。使用稳态平衡分析连同Scrubber 2评估软件计算亲和力(KD)。
遵循基本上如上文所述的程序，获得以下数据。如表2中所示，抗体I-4P以nM范围的亲和力结合人CD200R和食蟹猴CD200R，并且抗体I-4P以μM范围的亲和力结合CD200RLa激活性受体。抗体I-4P以>10μM的亲和力结合小鼠CD200R。
表2.使用表面等离子体共振(SPR)在37℃测量的抗体I-4P对人、食蟹猴、食蟹猴激 活性和小鼠CD200受体的亲和力
n＝测定进行三次；*n＝测定1次
这些数据显示，相比抗体I-4P对人CD200R和食蟹猴CD200R的亲和力，抗体I-4P以降低的亲和力结合CD200RLa激活性受体和小鼠CD200R。
尽管做了大量工程化以克服与人和食蟹猴CD200R之间缺少交叉反应性、应激条件下异构化(主要受LCDR1(LC D28)中的天冬氨酸残基驱动)及HC CDR1与CDR2之间非天然二硫键相关的突出问题，但抗体I-4P展示出有利的结合特征。例如，使用哺乳动物细胞表达的重链和轻链CDR残基饱和诱变法用来确定弥合人与食蟹猴CD200R之间亲和力差距的CDR变化。这种方法还用来在无损亲和力情况下找出LC D28的残基代替。使用基于噬菌体的方法筛选了第二CDR文库，这导致无损抗原结合亲和力情况下，发现针对非天然二硫键的未预测和非种系代替残基。
实施例：抗体I-4P体外结合于细胞中表达的CD200R
CD200R是“配对受体家族”成员，这意味着存在具有相反的激活活性的密切同源物。尚未在人类中鉴定到这种形式，但已经描述在食蟹猴的全血和睾丸中低水平mRNA转录物(本文称作食蟹猴“激活形式”或“食蟹猴CD200RLa”)。因此，食蟹猴激活形式可能在食蟹猴毒理学研究期间带来安全顾虑。
为了确定抗体I-4P是否与细胞表达的食蟹猴源膜结合性CD200R、人和激活形式食蟹猴CD200RLa结合，使用流式细胞术。CHO细胞经人CD200R(SEQ ID NO:15)、食蟹猴CD200R(SEQ ID NO:16)或食蟹猴激活形式(SEQ ID NO:17)转染并且针对高表达来选择。对于每个细胞系，将细胞(2e5)以1e6/50μL悬浮于PBS中，并且添加FL4染料(Proliferation和Encoder FL4染料)。将FL4染料对表达人和食蟹猴CD200R的细胞1:5000稀释，对表达食蟹猴激活形式的细胞1:700稀释，并且对未转染的细胞1:50稀释。将染料与细胞混合并且将混合物在4℃于黑暗下温育30分钟。将细胞用10mL PBS洗涤两次并且按1200转/分钟离心5分钟。随后将细胞在FACS缓冲液中按8e5细胞/50μL/孔混合。
将细胞在室温与FACS缓冲液中制得的抗体滴定物温育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤一次并且，在黑暗下4℃向每个孔添加按1:1000稀释的100μL PE缀合的抗人-Fc抗体持续15分钟。将细胞洗涤三次并且随后重悬于150μL FACS缓冲液中。添加Sytox蓝(2μL/孔)，将细胞转移至FACS平板，并且在Fortessa LSRII细胞计数仪(BD Biosciences)上运行。使用FlowJo(FlowJo,LLC)软件，分析数据。
遵循基本上如上文所述的程序，获得以下数据。抗体I-4P与食蟹猴CD200R和人CD200R结合。抗体I-4P与食蟹猴激活形式结合，类似于结合未转染的对照细胞。这些数据显示，抗体I-4P不与食蟹猴激活形式结合，因此，食蟹猴毒理学研究期间可能有减少的安全顾虑。
实施例：抗体I-4P是CD200R激动剂
为了展示抗体I-4P的激动剂活性，将人单核细胞细胞系U937(ATCC,CRL1539.2)用人CD200R的cDNA转染。可以通过结合并激活Fcγ受体的免疫复合物(IC)从这些细胞诱导产生细胞因子，包括IL-8。为了进行IC刺激，将人IgG1同种型对照抗体包被至高结合性平板过夜。次日，将4x 105个表达CD200R的U937个细胞/孔与不同浓度的抗体I-4P在冰上温育1小时，之后添加至预包被的IC刺激用平板，并且在37℃温育24小时。24小时后，将细胞离心，移除上清液，并且使用MSD试剂盒(Mesoscale Diagnostics)测量IL-8浓度。
遵循基本上如上文所述的程序，获得以下数据。如表3中所示，与相应浓度的同种型对照相比，作为抑制百分数，抗体I-4P减少IC诱导的IL-8。相对IC50以抑制百分数对浓度的斜率的四参数对数拟合为基础。测定来自3个独立实验的平均IC50为0.2μg/mL±0.02μg/mL。
表3.浓度依赖性抑制表达人CD200R的细胞中免疫复合物诱导的IL-8分泌
这些数据显示，抗体I-4P能够以浓度依赖性方式抑制IC诱导的IL-8产生。
还检查了同种型主链不同的CD200R激动剂抗体激动CD200R并抑制免疫复合物刺激的IL-8自表达人CD200R的U937细胞中释放的能力。为了进行刺激，将人IgG1同种型对照抗体按10μg/ml包被至高结合性平板过夜。次日，将4x 105个表达CD200R的U937细胞/孔与不同浓度的抗体IgG4PAA(已知两个亮氨酸至丙氨酸置换(SLL228PAA)破坏与FcγR的疏水相互作用，以消除残余效应子功能)或抗体I-4P在冰上温育1小时，之后添加至预包被的IC刺激用平板，随后在37℃温育24小时。将细胞离心，移除上清液，并且根据生产商的说明，使用MSD试剂盒(Mesoscale Diagnostics)测量IL-8浓度。将IL-8浓度换算成相对于同种型对照的抑制百分数。将IL-8浓度对抗体浓度作图，并且将4参数对数模型用来使用R统计软件，相对于对数浓度拟合抑制百分数。根据基本上如上文所述的方法，获得以下数据(表4中显示)。
表4.IL-8产生的浓度依赖性减少
*平均标准误
这些数据显示，与抗体I-4P(IC50＝0.07μg/ml)相比，IgG4PAA具有弱的抑制活性(IC50＝1.45μg/ml)。
实施例：Fcγ受体结合为体内激动作用必需
借助Fcγ受体在脂筏中簇集可以增加对炎性细胞的抑制性效力。为了鉴定Fcγ受体相互作用是否借助CD200R有益于激动作用，将两种小鼠CD200R抗体工程化；一种取消任何Fcγ受体结合的抗体(mIgG2aAA)和一种具有功能性Fcγ受体结合作用的抗体(mIgG2a)。在以下两个独立的小鼠诱导型炎性疾病模型中测试两种分子：接触性皮炎和CD40诱导型结肠炎症模型。
接触性皮炎模型：可以通过基本上如以下所述那样进行的体内小鼠模型，确定抗人CD200R激动剂抗体治疗接触性皮炎的能力(参见，例如Tolstrup等人,Anti-inflammatory effect of a retrovirus-derived immunosuppressive peptide inmouse models(小鼠模型中逆转录病毒衍生的免疫抑制肽的抗炎效果)，BMC Immunology2013,14:51)。麻醉雄性12周龄C57Bl/6J小鼠，将其腹部剃毛，并将100μL乙醇中的3％噁唑酮(oxazalone)施加至剃毛区域。致敏后七天，将CD200R激动剂抗体IgG2a或IgG2aAA按0.1、1或10mg/kg皮下(SC)施用，或将同种型对照mIgG2a按10mg/kg SC施用，供比较。施用抗体后四小时，使小鼠麻醉，用卡尺测量基线耳厚度，并且在双耳的每侧用10μL乙醇中的2％噁唑酮攻击双耳。攻击后二十四小时，再次测量耳厚度。通过测量攻击后之前和之后24小时耳厚度差异，评估超敏反应。使用带Dunnett’s事后检验(Dunnett’s post post test)的单因素ANOVA(GraphPad Prism)，确定来自同种型对照的统计差异。
CD40诱导型结肠炎症模型：可以通过基本上如以下所述那样进行的体内小鼠模型，确定抗人CD200R激动剂抗体治疗CD40诱导型结肠炎症模型的能力。对雌性14周龄RAG2N12(B6.129S6-Rag2tm1Fwa N12；Taconic)小鼠注射100μg/小鼠抗CD40抗体(BioXcel克隆FGK4.5)，以诱导结肠炎症。诱导疾病一小时后，将CD200R激动剂抗体IgG2a、IgG2aAA或同种型对照抗体按0.1、1或10mg/kg皮下施用。六天后处死动物并且通过测量结肠长度和重量，确定结肠炎症。结肠长度/重量比用来确定结肠炎症。使用带Dunnett’s事后检验(Dunnett’s post post test)的单因素ANOVA(GraphPad Prism)，确定来自同种型对照的统计差异。
遵循基本上如上文所述的程序，获得以下数据。
表5.如接触性皮炎模型中依据耳厚度(mm)的变化所测量的耳炎症
*p<0.05；**p<0.001。n＝5/组
表6.如CD40诱导型结肠炎症模型中依据重量/长度比(mg/cm)测量的结肠炎症
n＝5/组，*p<0.05；**p<0.001。
这些数据显示，与同种型对照相比，具有完整效应子功能的抗体(mIgG2a)在两个模型中均显示出免疫抑制性功能。然而，Fcγ受体无效变体(mIgG2aAA)在接触性皮炎模型中效力小得多并且在结肠炎症模型中具有少许或没有效果。活性差异未归因于表达CD200R的细胞耗尽，因为在独立实验中展示有Fcγ受体能力的IgG2a抗体未耗尽小鼠中表达CD200R的细胞(数据未显示)。
这些数据显示，必需Fcγ受体结合作用以提供针对CD200R最佳激动作用，以介导抗炎信号。
实施例：抗体I与Fcγ受体的结合
为了确定抗体Fc是否影响抗体I-4P对Fcγ受体的结合特征，通过SPR在25℃测量抗体I-4P、抗体I-IgG1和抗体I-4PAA与人FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa受体胞外结构域(ECD)的结合。抗体I-IgG1和抗体I-4PAA具有与抗体I-4P相同的CDR。抗体I-IgG1具有与抗体I-4P相同的HCVR、LCVR、和LC，但抗体I-IgG1具有其氨基酸序列由SEQ ID NO:11给出的HC。抗体I-4PAA因具有HC中的SLL228PAA突变而异于抗体I-4P。
T100仪和/>3000(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、/>试剂及Scrubber2/>评价软件(Biologics 2008)用于抗体结合过程的SPR分析。使用生产商的EDC/NHS胺偶联方法(/>P/N BR-1000-50)，制备CM5芯片(/>P/N BR-1006-68)。简而言之，通过按10μL/分钟注射1:1的EDC/NHS混合物7分钟，活化全部4个FC的表面。将蛋白A(Calbiochem P/N 539202)在pH 4.5的10mM乙酸盐缓冲液中稀释至100μg/mL并且以10μL/分钟流速注射7分钟，固定化到全部4个流动小室以实现大约400RU。按10μL/分钟注射乙醇胺7分钟封闭未反应的位点。使用2x 10μL甘氨酸pH 1.5注射来移除任何非共价缔合的蛋白质。
根据本领域熟知的方法，从稳定的CHO细胞表达中产生并且使用IgG琼脂糖凝胶与大小排阻色谱纯化FcγR ECDs-FcγRI(CD64)、FcγRIIA_131R和FcγRIIA_131H(CD32a)、FcγRIIIA_158V、FcγRIIIA_158F(CD16a)和FcγRIIb(CD32b；抑制性受体)(参见，例如Bruhns等人,Blood.2009Apr 16；113(16):3716-25)。
对于FcγRI结合过程，将抗体在运行缓冲液(1x HBS-EP+(P/N BR-1006-69)中稀释至2.5μg/mL，并且在流动小室2至4中捕获大约150RU的每种抗体(RU捕获)。FC1是参比流动小室，因此，FC1中未捕获抗体。将FcγRI ECD在运行缓冲液中稀释至200nM并且随后在运行缓冲液中两倍连续稀释至0.78nM。将每个浓度的重复注射物按40μL/分钟注射到全部FC上方，持续120秒，随后是1200秒解离相。通过将15μL 10mM甘氨酸pH 1.5按30μL/分钟注射到全部FC上方，进行再生。将扣除参比的数据作为FC2-FC1、FC3-FC1和FC4-FC1采集。在25℃获得量值。使用稳态平衡分析连同Scrubber 2/>评估软件或BIA评估中的“1:1(朗格缪尔)结合”模型计算亲和力(KD)。
对于FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa结合过程，将抗体在运行缓冲液中稀释至5μg/mL，并且在流动小室2至4中捕获大约500RU的每种变体(RU捕获)。FC1是参比流动小室。将Fcγ受体ECD在运行缓冲液中稀释至10μM并且随后在运行缓冲液中2倍连续稀释至39nM。将每个浓度的重复注射物按40μL/分钟注射到全部FC上方，持续60秒，随后是120秒解离相。通过将15μL 10mM甘氨酸pH 1.5按30μL/分钟注射到全部FC上方，进行再生。将扣除参比的数据作为FC2-FC1、FC3-FC1和FC4-FC1采集。在25℃获得量值。使用稳态平衡分析连同Scrubber 2评估软件计算亲和力(KD)。
遵循基本上如上文所述的方法，获得如表7中所示的以下数据。
表7：使用SPR在25℃测量的抗体I-4P、抗体I-IgG1、和抗体I-4PAA对人Fcγ受体 ECD的体外结合参数
样品 人配体 平均KD 标准偏差
IgG1对照抗体 FcγRI 56.1pM 2.2
IgG4 PAA对照抗体 FcγRI 229.0nM 11.5
抗体I-IgG1 FcγRI 48.9pM 2.2
抗体I-4PAA FcγRI 273.3nM 12.6
抗体I-4P FcγRI 369.3pM 9.2
IgG1对照抗体 FcγRIIA_131H 0.5μM 0.0
IgG4 PAA对照抗体 FcγRIIA_131H >10μM
抗体I-IgG1 FcγRIIA_131H 0.5μM 0.0
抗体I-4PAA FcγRIIA_131H >10μM
抗体I-4P FcγRIIA_131H 3.9μM 0.3
IgG1对照抗体 FcγRIIA_131R 0.6μM 0.0
IgG4 PAA对照抗体 FcγRIIA_131R >10μM
抗体I-IgG1 FcγRIIA_131R 0.6μM 0.0
抗体I-4PAA FcγRIIA_131R >10μM
抗体I-4P FcγRIIA_131R 1.7μM 0.1
IgG1对照抗体 FcγRIIb 2.8μM 0.1
IgG4 PAA对照抗体 FcγRIIb >10μM
抗体I-IgG1 FcγRIIb 2.8μM 0.1
抗体I-4PAA FcγRIIb >10μM
抗体I-4P FcγRIIb 2.2μM 0.1
IgG1对照抗体 FcγRIIIA_158V 0.2μM 0.0
IgG4 PAA对照抗体 FcγRIIIA_158V 8.9μM 1.1
抗体I-IgG1 FcγRIIIA_158V 0.2μM 0.0
抗体I-4PAA FcγRIIIA_158V >10μM
抗体I-4P FcγRIIIA_158V 4.3μM 0.4
IgG1对照抗体 FcγRIIIA_158F 1.0μM 0.1
IgG4 PAA对照抗体 FcγRIIIA_158F >10μM
抗体I-IgG1 FcγRIIIA_158F 0.9μM 0.1
抗体I-4PAA FcγRIIIA_158F >10μM
抗体I-4P FcγRIIIA_158F >10μM
独立三次进行测定。
*对于>10μM的量值，不测定标准偏差。
表7总结了如通过SPR所测量的抗体I-IgG1、抗体I-4PAA和抗体I-4P对人FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、和FcγRIIIa受体ECD的亲和力(KD)。抗体I-4P的结合特征显示以基本上介于IgG1对照/抗体I-IgG1与IgG4 PAA对照/抗体I-4PAA的结合亲和力之间的亲和力，结合于Fcγ受体。例如，数据显示，与抗体I-IgG1相比，抗体I-4P具有减少的与FcγRIIIa受体ECD结合作用(这可以归因于全血测定中的细胞因子释放)，但与抗体I-4PAA相比，仍对FcγRI和FcγRIIb受体ECD具有更高的结合亲和力。
认为抗体I-4P对FcγR所展示的结合特征有助于增强体内效力，同时不造成显著的细胞因子释放。
实施例：IgG1 Fc突变体与Fcγ受体的结合
已知IgG1抗体诱导细胞因子释放。为了确定IgG1诱导细胞因子释放的机理，生成IgG1-Fc突变。这些CD200R抗体具有不同于抗体I的CDR。表8中的抗体(IgG1，无突变、P331S、P331S+S267G、A330S+P331S+S267G、A330S+S267G、K322A、K322A+S267G和N325S+L328F+S267G)具有彼此相同的CDR。S267G抗体具有与其他抗体突变体和抗体I-4P不同的CDR。
生成S267G突变以减少FcγRIII结合作用(EU编号：参见，例如，Kabat等人,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)；和Shields RL等人,“High resolution mapping of thebinding site on human IgG1 for Fc gamma RI,Fc gamma RII,Fc gamma RIII,andFcRn and design of IgG1 variants with improved binding to Fc gamma R”.2001J.Biol.Chem.276,6591-6604)。
S267G突变还与减少C1q结合作用的突变组合，同时并未显著影响FcγR-结合作用(K322A、A330S和P331S；参见，例如Oganesyan V等人,2008,Structural characterizationof a human Fc fragment engineered for lack of effector functions.ActaCrystallogr.D Biol.Chrystallogr.64,700-704；Idusogie,E等人,2000,Mapping of theC1q Binding Site on Rituxan,a Chimeric Antibody with a Human IgG1 Fc,J.ofImmunology,164(8)4178-4184；及Tao M.H.和Morrison M.L.1993,Structural featuresof human immunoglobulin G that determine isotype-specific differences incomplement activation.J.of Exp.Med.,178(2),661-667)。还生成了减少FcγRIII和C1q结合作用，同时调节与FcγRIIA和FcγRIIB结合的额外突变(N325S+L328F；参见，例如Shang L等人,2014,“Selective antibody intervention of Toll-like receptor4activation through FcγR tethering”.J.Biol.Chem.289,15309-18；Monnet E等人,2017,“Evidence of NI-0101pharmacological activity,an anti-TLR4 antibody,in arandomized phase I dose escalation study in healthy volunteers receivingLPS”.Clin Pharmacol Ther.2017 101,200-208)。
通过测定Fcγ受体结合作用，并且通过基于Mesoscale平台的多重测定法测定IFNγ，二者均如本文所述。通过ELISA测定C1q结合作用。对于ELISA，用稀释于DPBS(Dulbecco’s HyClone)中、浓度范围10μg/mL至0.19μg/mL的100μL/孔每种抗体包被96孔微量平板。在复孔中进行检验。将平板密封并在4℃温育过夜。从每个孔移除包被试剂，并且添加200μL/孔酪蛋白封闭试剂(Thermo)。将平板密封并在室温(RT)温育2小时。将每个孔用洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的1x TBE)洗涤3次。添加稀释于酪蛋白封闭试剂中10μg/mL的人C1q(MS Biomedical)100μL/孔并且在室温温育3小时。随后将平板用洗涤缓冲液洗涤三次，之后添加100μL/孔在酪蛋白封闭剂中1:800倍稀释的羊抗人C1q-HRP(Abcam#ab46191)并且在室温温育1小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤6次，并且添加100μL/孔TMB底物(Pierce)至每个孔并温育7分钟。向每个孔添加100μL的1N HCl以终止反应。使用设定至450nm的比色酶标仪，立即测量光密度。
遵循基本上如上文所述的程序，获得以下数据(N＝1；表8)。
表8.用IgG1突变体的FcγR和C1q结合作用和全血细胞因子释放量值
a全血内部显著高于基线水平的任何细胞因子释放均记录为‘是’，然而，超过基线的确切水平可能变动。
这些数据显示，减少C1q结合作用并改变FcγR结合作用的突变联合导致缺少超过基线的IFNγ释放，这提示当施用至患者时安全特征更合乎需要。例如，减少C1q结合作用和减少与FCγRIII(或FCγRI)的结合导致缺少超过基线的IFNγ释放。
实施例：体外细胞因子释放
临床毒性，包括细胞因子释放综合征(CRS)，已经与抗体的施用相关。CRS，与单克隆抗体相关的最重度不良事件之一，特征在于高水平的免疫细胞活化及促炎细胞因子的快速全身性释放，并且可以潜在地致命。重要地，临床前模型并非充分地预测潜在的CRS风险。因此，开发了使用人血细胞的体外细胞因子释放分析以减轻施用抗体后潜在的CRS风险。抗体、尤其IgG1抗体与Fcγ受体的结合可能造成不想要的细胞因子释放。
为了确定抗体I-4P或抗体I-IgG1是否诱导细胞因子从未刺激的人全血释放，进行了一项体外细胞因子释放研究。将新鲜采集自六个健康人的全血与100μg/ml抗体I-4P、抗体I-IgG1或对照IgG1抗体温育24小时。阳性对照是已知在临床上引起细胞因子释放综合征的Campath-1H(抗CD52)IgG1抗体的同源物。阴性对照是不引起细胞因子释放的hIgG1抗体。使用基于Mesoscale平台的市售多重测定法，在细胞培养上清液中测量十种细胞因子，包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-10和TNF-α。
遵循基本上如上文所述的程序，获得以下数据。如表9中所示，对于大部分捐赠者内所分析的10种细胞因子中的9种，全血与10μg/ml阳性对照抗体的温育导致强的细胞因子产生。全血与抗体I-IgG1温育诱导了明显的IFN-γ释放。全血与100μg/ml抗体I-4P或100μg/ml阴性对照IgG1的温育并不产生所评估细胞因子中任一者的显著水平。
表9.相对于基线(PBS对照样品)的倍数变化；中位数±SEM
这些数据显示，抗体I-4P不引起显著的细胞因子释放，并且提示临床上抗体I-4P给药后细胞因子释放的风险低。
实施例：抗体I不阻断CD200与CD200R结合
CD200和CD200R均是细胞表达的分子并含有两个Ig样结构域。它们通过其与髓样细胞和其他表达CD200的细胞之间发生的免疫突触样相互作用兼容的NH2端结构域相互作用。为了确定抗体I-4P是否在配体存在下结合CD200R，通过流式细胞术对表达CD200R的的人成红细胞瘤细胞系HEL92.7.1细胞进行共结合实验。对于该研究，将2e5个细胞与300nM的CD200Fc(RD Systems；免疫球蛋白1Fc区与CD200的融合蛋白)、抗体I-4P、同种型对照抗体或PBS在室温温育(预处理)一小时。将细胞洗涤3次并且与Fc封闭液(Miltenyi Biotec)在室温温育20分钟。将细胞用多种浓度的AF647标记的抗体I-4P在室温染色一小时，并且随后洗涤细胞并使其悬浮于FACS缓冲液中供流式细胞术分析。
对每个浓度的AF647标记的抗体I-4P测定中位荧光强度(MFI)，并且MFI表示配体存在下的结合量。遵循基本上如上文所述的程序，获得表10中的数据。
表10.在CD200存在下的抗体结合过程
这些数据显示，抗体I-4P不阻断CD200配体结合人CD200R(人CD200-Fc数据与同种型对照和无预处理数据比较)。抗体I-4P预治疗数据充当对照并且表明在抗体I-4P预处理后标记的抗体I-4P结合减少。
确定抗体I-4P的表位接近于CD200R的结构域2上的细胞膜(数据未显示)。
实施例：抗体I-4P抑制人源化小鼠中的接触超敏
为了证明抗体I-4P的抗炎效果，雌性huNOG-EXL小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Tg(SV40/HTLV-IL3,CSF2)10-7Jic/JicTac)以20周龄购自TaconicBiosciences并且允许其适应超过1周。将小鼠按每笼四只小鼠在22℃按12小时白昼:黑暗循环圈养并且给予自由饮食和饮水。在第0天，用5％异氟烷麻醉小鼠，将其腹部剃毛，并将100μL乙醇中的3％噁唑酮施加至剃毛区域。致敏后五天，将抗体I-4P按1或10mg/kg皮下(SC)施用；将IgG4P同种型对照按10mg/kg SC施用，供比较。施用抗体后四小时，用5％异氟烷使小鼠麻醉，用卡尺测量耳厚度，并且在双耳的每侧用10μL乙醇中的2％噁唑酮攻击双耳。在第10天和第14天重复攻击程序。通过测量攻击后之前和之后24小时耳厚度差异，评估超敏反应。
统计学：通过测量每次攻击的攻击之前和之后24小时的耳厚度差异，测定炎症。从设定成0％抑制的同种型对照的平均耳厚度算得抑制百分数。使用带Dunnett’s检验的单因素或两因素ANOVA(若适宜)(GraphPad Prism)，确定来自同种型对照的统计差异。
遵循基本上如上文所述的程序，获得以下数据。如下表中所示，与同种型处理的小鼠相比，首次攻击之前4小时用抗体I-4P按1或10mg/kg SC单次处理显著地减轻第3次攻击后的炎症反应。
表11.
序列表
抗体I-4P和抗体I-IgG1的HCDR1(SEQ ID NO:1)
KASGFSFSSGYYMA
抗体I-4P和抗体I-IgG1的HCDR2(SEQ ID NO:2)
LIGVGSGSLWYAQKFQG
抗体I-4P和抗体I-IgG1的HCDR3(SEQ ID NO:3)
ARHFALSDPFNL
抗体I-4P和抗体I-IgG1的LCDR1(SEQ ID NO:4)
QASESIDSYLL
抗体I-4P和抗体I-IgG1的LCDR2(SEQ ID NO:5)
KQASTLAS
抗体I-4P和抗体I-IgG1的LCDR3(SEQ ID NO:6)
QNYYDISSND
抗体I-4P和抗体I-IgG1的抗体HCVR(SEQ ID NO:7)
XVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSFSSGYYMAWVRQAPGQGLEWMGLIGVGSGSLWYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARHFALSDPFNLWGQGTLVTVSS
其中在位置1处的Xaa是谷氨酰胺或焦谷氨酸
抗体I-4P和抗体I-IgG1的抗体LCVR(SEQ ID NO:8)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCQASESIDSYLLWYQQKPDQSPKLLIKQASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQNYYDISSNDFGGGTKVEIK
抗体I-4P的抗体重链(SEQ ID NO:9)
XVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSFSSGYYMAWVRQAPGQGLEWMGLIGVGSGSLWYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARHFALSDPFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLX其中在位置1处的Xaa是谷氨酰胺或焦谷氨酸并且在位置446处的Xaa是甘氨酸或不存在。
抗体I-4P和抗体I-IgG1的抗体轻链(SEQ ID NO:10)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCQASESIDSYLLWYQQKPDQSPKLLIKQASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQNYYDISSNDFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗体I-IgG1的抗体重链(SEQ ID NO:11)
XVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSFSSGYYMAWVRQAPGQGLEWMGLIGVGSGSLWYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARHFALSDPFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX其中在位置1处的Xaa是谷氨酰胺或焦谷氨酸并且在位置450处的Xaa是赖氨酸或不存在。
编码抗体I-4P的重链的DNA(SEQ ID NO:12)
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggattctccttcagtagcggctactacatggcatgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggactgattggtgttggtagtggtagcctatggtacgcgcagaagttccaaggccgggtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacattttgctctgtctgatccctttaacttgtggggccagggcacactcgtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
编码抗体I-4P和抗体I-IgG1的轻链的DNA(SEQ ID NO:13)
gaaattgtgctgactcagtctccagactttcagtctgtgactccaaaggagaaagtcaccatcacctgccaggccagtgagtcgattgatagctatttactgtggtaccagcagaaaccagatcagtctccaaagctcctcatcaagcaggcatccactctggcatctggggtcccctcgaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcaccctcaccatcaatagcctggaagctgaagatgctgcaacgtattactgtcaaaactattatgatattagtagtaatgatttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc
编码抗体I-IgG1的重链的DNA(SEQ ID NO:14)
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggattctccttcagtagcggctactacatggcatgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggactgattggtgttggtagtggtagcctatggtacgcgcagaagttccaaggccgggtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacattttgctctgtctgatccctttaacttgtggggccagggcacactcgtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaag
人CD200R(SEQ ID NO:15)
MLCPWRTANLGLLLILTIFLVAEAEGAAQPNNSLMLQTSKENHALASSSLCMDEKQITQNYSKVLAEVNTSWPVKMATNAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYRKETNETKETNCTDERITWVSRPDQNSDLQIRPVAITHDGYYRCIMVTPDGNFHRGYHLQVLVTPELTLFQNRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPEGDCATKQEYWSNGTVTVKSTCHWEVHNVSTVTCHVSHLTGNKSLYIELLPVPGAKKSAKLYIPYIILTIIILTIVGFIWLLKVNGCRKYKLNKTESTPVVEEDEMQPYASYTEKNNPLYDTTNKVKASQALQSEVDTDLHTL
食蟹猴CD200R(SEQ ID NO:16)
MLCPWRTANLGLLLILAVFLVAEAEGAAQSNNSLMLQTSKENHTLASNSLCMDEKQITQNHSKVLAEVNISWPVQMARNAVLCCPPIEFRNLIVITWEIILRGQPSCTKTYRKDTNETKETNCTDERITWVSTPDQNSDLQIHPVAITHDGYYRCIMATPDGNFHRGYHLQVLVTPEVTLFESRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPAGDCAPTEQEYWGNGTVTVKSTCHWEGHNVSTVTCHVSHLTGNKSLYIELLPVPGAKKSAKLYMPYVILTIIILTIVGFIWLLKISGCRKYNLNKTESTSVVEEDEMQPYASYTEKNNPLYDTTNKVKASQALQSEVGTDLHTL
食蟹猴CD200RLa(SEQ ID NO:17)
MHTLGKMSASRLLISIIIMVSASSSSCMDGKQMTQNYSKMSAEGNISQPVLMDTNAMLCCPPIEFRNLIVIVWEIIIRGQPSCTKAYRKETNETKETNCTDERITWVSTPDQNSDLQIHPVAITHDGYYRCIMATPDGNFHRGYHLQVLVTPEVTLFQSRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPAGDCAPTEHEYWGNGTVTVESMCHWGDHNASTMTCHVSHLTGNKSLYIKLNSGLRTSGSPALDLLIILYVKLSLFVVILVTTGFVFFQRINYVRKSL

Claims (18)

1.一种结合人CD200R的抗体，包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示，并且HCDR3的氨基酸序列由SEQID NO:3所示，LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，包含HCVR和LCVR，其中HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:7所示并且LCVR的氨基酸序列是由SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中在SEQ ID NO:7的位置1处的Xaa是谷氨酰胺。
4.根据权利要求2所述的抗体，其中在SEQ ID NO:7的位置1处的Xaa是焦谷氨酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中抗体是IgG4P。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9所示并且LC的氨基酸序列是由SEQ ID NO:10所示。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是谷氨酰胺并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa是甘氨酸。
8.根据权利要求6所述的抗体，其中在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是焦谷氨酸并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa是甘氨酸。
9.根据权利要求6所述的抗体，其中在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是谷氨酰胺并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa不存在。
10.根据权利要求6所述的抗体，其中在SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa是焦谷氨酸并且在SEQ ID NO:9的位置446处的Xaa不存在。
11.根据权利要求1所述的抗体，其中相比与CD200R激动剂抗体具有相同CDR的野生型IgG1抗体，所述抗体与 和或C1q的结合不引起显著的细胞因子释放。
12.根据权利要求1所述的抗体，其中抗体不结合或C1q。
13.药物组合物，包含根据权利要求1-12中任一项所述的抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
14.DNA分子，包含编码其氨基酸序列由SEQ ID NO:9所示的HC的多核苷酸或编码其氨基酸序列由SEQ ID NO:10所示的LC的多核苷酸。
15.根据权利要求14所述的DNA分子，其中编码HC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:12所示或编码LC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:13所示。
16.根据权利要求14所述的DNA分子，包含1)编码其氨基酸序列由SEQ ID NO:9所示的HC的多核苷酸，和2)编码其氨基酸序列由SEQ ID NO:10所示的LC的多核苷酸。
17.根据权利要求16所述的DNA分子，其中编码HC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:12所示，并且编码LC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:13所示。
18.用权利要求17的DNA分子转化的哺乳动物细胞，其中转化的哺乳动物细胞能够表达包含两个HC和两个LC的抗体，其中每个HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9所示，并且每个LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10所示。
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