CN112739207A

CN112739207A - 包含阿卡伯糖或水苏糖的哺乳动物细胞保存用液

Info

Publication number: CN112739207A
Application number: CN201980060917.1A
Authority: CN
Inventors: 白川智景; 西村益浩; 土居雅子
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2021-04-30
Also published as: WO2020066991A1; KR20210045443A; JPWO2020066991A1; SG11202102876XA; TW202020142A; AU2019345595A1; CA3112902A1; TWI732298B; US20210345602A1; EP3858975A1

Abstract

本发明的课题在于提供能够有效抑制将哺乳动物细胞在液体中保存时产生的细胞存活率降低和细胞凝集、且在哺乳动物的机体内投予时对哺乳动物的生态造成不良影响的可能性低的物质、以及包含这样的物质的哺乳动物细胞保存用液等。将包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐的液体用于保存哺乳动物细胞，则能够有效抑制将哺乳动物细胞在液体中保存时产生的细胞存活率降低和细胞凝集。而且，在上述液体中保存的哺乳动物细胞不用转移到新的移植用液，就能够直接投予到哺乳动物的机体内。

Description

包含阿卡伯糖或水苏糖的哺乳动物细胞保存用液

技术领域

本发明涉及包含阿卡伯糖或其盐(以下，有时称为“阿卡伯糖类”、和/或水苏糖或其盐(以下，有时称为“水苏糖类”)的哺乳动物细胞保存用液(以下，有时称为“本发明哺乳动物细胞保存用液”)、使用本发明哺乳动物细胞保存用液保存哺乳动物细胞的方法。

背景技术

近年来，随着干细胞研究的急速发展，再生医学的势头不断升高，其知识和理解不仅仅是研究者，而且也被一般性地广泛普及。使用干细胞的再生医疗是利用干细胞所具有的自我复制能力和多能性、干细胞所分泌的因子，以使因各种疾病受到损伤的细胞或组织的功能恢复为目的的医疗。如果对白血病或再生障碍性贫血等顽固性血液病的患者进行骨髓移植，则造血系干细胞植入患者体内，能够几乎一生维持造血功能。另外，最近众多研究者以使用造血干细胞以外的干细胞的临床应用为目标，鉴定了中枢神经、末梢神经、骨髓、小肠等中的干细胞，开始了对外伤性疾病或组织变性疾病的组织干细胞的移植治疗实践(非专利文献1～3)。另一方面，癌免疫细胞疗法是将具有攻击癌的作用的免疫细胞取出到体外，将其作用强化后，再次返回到体内的最前沿的细胞医疗，实践了树突状细胞疫苗疗法、α·βT细胞疗法(αβT细胞疗法)、γ·δT细胞疗法(γδT细胞疗法)、CTL疗法、自然杀伤细胞疗法(NK细胞疗法)等使用T细胞的疗法。

在将移植治疗中使用的干细胞或T细胞长期保存的情况下，在液体中的保存时无法良好地确保细胞存活率。例如报道有，如果将人骨髓干细胞在生理盐水中冷藏保存(4℃)，则细胞存活率在48小时后会降低到40％以下，72小时后降低到20％以下(非专利文献4)。因此，在将移植用干细胞或移植用T细胞长期保存的情况下，通常为冻结保存。但是，在冻结保存液中，通常会添加DMSO、甘油等冻结保存剂，因此在将冻结保存的干细胞或T细胞解冻后，在进行移植治疗前需要将移植冻结保存剂除去，存在耗费功夫的问题。另外，即使在冻结保存液中添加冻结保存剂，在冻结时的水的结晶化造成的细胞骨架的损伤也大，冻结融解后的细胞存活率降低也造成问题。因此，开发出简便性优异、且能够抑制细胞存活率的降低的细胞保存液的开发被视为当务之急。

本发明的发明人报道过海藻糖具有抑制将哺乳动物细胞在液体中保存时产生的细胞存活率降低和细胞凝集的作用(专利文献1和2)。然而，目前并不知道阿卡伯糖或水苏糖具有这样的作用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-115253号公报

专利文献2：国际公开第2014/208053号文本

非专利文献

非专利文献1：Gage,F.H.,Science 287:1433-1438(2000)

非专利文献2：Morrison,S.J.et al.,Cell 96:737-749(1999)

非专利文献3：Batle,E.et al.,Cell 111:251-263(2002)

非专利文献4：Lane,T.A.et al.,Transfusion 49:1471-1481(2009)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于提供能够有效地抑制将哺乳动物细胞在液体中保存时产生的细胞存活率降低和细胞凝集、且在投予到哺乳动物的机体内的情况下，对哺乳动物的生态造成不良影响的可能性低的物质、以及包含这样的物质的哺乳动物细胞保存用液等。

用于解决课题的方法

本发明的发明人为了解决上述课题持续进行了深入研究。在其过程中在93种糖类中，作为抑制哺乳动物细胞的存活率降低、且其作用效果高于海藻糖的糖类，发现了阿卡伯糖和水苏糖。进而还确认了这些四糖具有抑制哺乳动物细胞的细胞凝集的作用。本发明是基于这些发现从而完成的。

即，本发明如下所述。

〔1〕一种哺乳动物细胞保存用液，其包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐。

〔2〕如上述〔1〕所述的液体，其中，在等渗液中包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐。

〔3〕如上述〔2〕所述的液体，其中，等渗液中的阿卡伯糖或其盐的浓度至少为40mM。

〔4〕如上述〔2〕或〔3〕所述的液体，其中，等渗液中的水苏糖或其盐的浓度至少为40mM。

〔5〕如上述〔2〕～〔4〕中任一项所述的液体，其中，等渗液为乳酸林格液、乙酸林格液、林格液或生理盐水。

〔6〕如上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的液体，其用于在0～40℃保存哺乳动物细胞。

〔7〕如上述〔1〕～〔6〕中任一项所述的液体，其用于将哺乳动物细胞保存6小时～30天。

〔8〕如上述〔1〕～〔7〕中任一项所述的液体，其用于抑制哺乳动物细胞的存活率降低。

〔9〕如上述〔1〕～〔8〕中任一项所述的液体，其用于抑制哺乳动物细胞的凝集。

〔10〕如上述〔1〕～〔9〕中任一项所述的液体，其用于哺乳动物细胞的移植。

〔11〕如上述〔1〕～〔10〕中任一项所述的液体，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞、哺乳动物淋巴细胞、或哺乳动物肝细胞。

〔12〕如上述〔11〕所述的液体，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物淋巴细胞。

〔13〕一种哺乳动物细胞的保存方法，其包括：在包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐的液体中保存哺乳动物细胞的工序。

〔14〕如上述〔13〕所述的保存方法，其中液体为等渗液。

〔15〕如上述〔14〕所述的保存方法，其中，等渗液中的阿卡伯糖或其盐的浓度至少为40mM。

〔16〕如上述〔14〕或〔15〕所述的保存方法，其中，等渗液中的水苏糖或其盐的浓度至少为40mM。

〔17〕如上述〔14〕～〔16〕中任一项所述的保存方法，其中，等渗液为乳酸林格液、乙酸林格液、林格液或生理盐水。

〔18〕如上述〔13〕～〔17〕中任一项所述的保存方法，其特征在于，将哺乳动物细胞在0～40℃保存。

〔19〕如上述〔13〕～〔18〕中任一项所述的保存方法，其特征在于，保存哺乳动物细胞6小时～30天。

〔20〕如上述〔13〕～〔19〕中任一项所述的保存方法，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞、哺乳动物淋巴细胞或哺乳动物肝细胞。

〔21〕如上述〔20〕所述的保存方法，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物淋巴细胞。

〔22〕一种粉末制剂，其用于制备上述〔1〕～〔12〕中任一项所述的液体，该粉末制剂包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐。

另外，作为本发明的实施的其他方式，能够列举：

一种哺乳动物细胞的移植方法，其包括：将包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液向需要哺乳动物细胞的移植的对象(例如、外伤性疾病患者、组织变性疾病患者、癌患者)投予的工序；

一种哺乳动物细胞的移植方法，其包括：在包含阿卡伯糖类和/或水苏糖类的液体(优选为等渗液)中加入哺乳动物细胞、或者在包含哺乳动物细胞的液体(优选为等渗液)中加入阿卡伯糖类和/或水苏糖类，由此制备本发明哺乳动物细胞保存用液的工序；在制备好的本发明哺乳动物细胞保存用液中保存哺乳动物细胞的工序；和将包含保存的哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液向需要哺乳动物细胞的移植的对象(例如、外伤性疾病患者、组织变性疾病患者、癌患者)投予的工序；

阿卡伯糖类和/或水苏糖类在制造本发明哺乳动物细胞保存用液中的应用；

阿卡伯糖类和/或水苏糖类在用于抑制液体中的哺乳动物细胞的存活率降低的应用；

阿卡伯糖类和/或水苏糖类在用于抑制液体中的哺乳动物细胞的细胞凝集中的应用；

包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液在用于治疗需要哺乳动物细胞移植治疗的疾病(例如、外伤性疾病、组织变性疾病、癌)中的应用；

一种包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液的制备方法，其包括：在包含阿卡伯糖类和/或水苏糖类的液体(优选为等渗液)中加入哺乳动物细胞、或者在包含哺乳动物细胞的液体(优选为等渗液)中加入阿卡伯糖类和/或水苏糖类，由此制备本发明哺乳动物细胞保存用液的工序；和

包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液。

此外，上述移植方法的保存哺乳动物细胞的工序通常是将包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液在该保存用液以液体的状态存在的温度条件下保存，不包括该保存用液以固体的状态保存的工序(例如冻结保存的工序、冻结干燥保存的工序等的以休眠状态保存哺乳动物细胞的工序)。

发明的效果

根据本发明，通过在液体中加入阿卡伯糖类和/或水苏糖类，能够有效抑制将哺乳动物细胞在液体中保存时产生的细胞存活率降低和细胞凝集。此外，这些阿卡伯糖类和水苏糖类是在投予到哺乳动物的机体内时对哺乳动物的生态造成不良影响的可能性低的四糖类，因此将哺乳动物细胞在本发明哺乳动物细胞保存用液中保存后，能够不换成新的移植用液，而直接投予到哺乳动物的机体内。

附图说明

图1是表示利用台盼蓝染色法解析将来自骨髓的人间充质干细胞(hMSC；HumanMesenchymal Stem Cell)在5种被检测用等渗液(乳酸钠林格注射液(Lactec Injection)[LR]、包含175mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+175A]、包含175mM蔗果四糖的Lactec注射液[LR+175N]、包含175mM麦芽四糖的Lactec注射液[LR+175Ma]、和包含175mM水苏糖的Lactec注射液[LR+175S])中在4℃保存2天后的细胞存活率的结果(n＝3)的图(参照表1)。图中的“Pre”表示在包含4℃保存前的hMSC的磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline；PBS)中的hMSC的细胞存活率(94.7±2.1)。图中的“＊＊”和“＊＊＊”表示进行Dunnett多重比较检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.01和p＜0.001)。

图2是表示利用XTT法解析将hMSC在9种被检测用等渗液(大塚生食注射液[S]、Lactec注射液[LR]、包含88mM海藻糖的Lactec注射液[LR+88T]、包含88mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+88A]、包含88mM葡萄糖的Lactec注射液[LR+88G]、包含175mM海藻糖的Lactec注射液[LR+175T]、包含175mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+175A]、包含175mM葡萄糖的Lactec注射液[LR+175G]、和培养基[M])中以4℃保存3天后的细胞存活率的结果(培养基以外n＝3、培养基n＝2)的图(参照表2)。图中的“＊”、“＊＊”和“＊＊＊”表示进行Dunnett多重比较检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.05、p＜0.01和p＜0.001)。另外，图中的“##”和“###”表示在88mM的3组(LR+88T、LR+88A和LR+88G)之间、以及175mM的3组(LR+175T、LR+175A、和LR+175G)之间进行Tukey type多重比较检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.01和p＜0.001)。

图3是表示利用台盼蓝染色法解析将hMSC在5种被检测用等渗液(Lactec注射液[LR]、包含44mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+44A]、包含88mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+88A]、包含175mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+175A]、和包含350mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+350A])中以4℃保存3天后的细胞存活率的结果(n＝3)的图(参照表3)。图中的“Pre”表示包含以4℃保存前的hMSC的PBS中的hMSC的细胞存活率(95.0％)。图中的“＊＊”和“＊＊＊”表示进行Dunnett多重比较检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.01和p＜0.001)。

图4是表示利用台盼蓝染色法解析将hMSC在5种被检测用等渗液(Lactec注射液[LR]、包含88mM海藻糖的Lactec注射液[LR+88T]、包含44mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+44A]、包含88mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+88A]、和包含175mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+175A])中以4℃保存28天后的细胞存活率的结果(n＝3)的图(参照表4)。图中的“Pre”表示包含以4℃保存前的hMSC的PBS中的hMSC的细胞存活率(94.1％)。图中的“＊＊”和“＊＊＊”表示进行Dunnett多重比较检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.01和p＜0.001)。

图5是表示利用台盼蓝染色法解析将大鼠肝细胞在6种被检测用等渗液(大塚生食注射液[S]、Lactec注射液[LR]、包含175mM海藻糖的Lactec注射液[LR+175T]、包含175mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+175A]、包含175mM葡萄糖的Lactec注射液[LR+175G]、和培养基[M])中以4℃保存24小时后的细胞存活率的结果(n＝6)的图(参照表6)。图中的“Pre”表示包含以4℃保存前的大鼠肝细胞的清洗用培养基中的大鼠肝细胞的细胞存活率(70.8±3.32)。图中的“＊＊＊”表示进行Dunnett多重比较检验，在统计学上存在显著差异(p＜0.001)。另外，图中的“###”表示在175mM的3组(LR+175T、LR+175A和LR+175G)之间进行Tukey type多重比较检验，在统计学上存在显著差异(p＜0.001)。

图6是表示利用台盼蓝染色法解析将hMSC在4种被检测用等渗液(Lactec注射液[LR]、包含175mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+175A]、包含175mM米格列醇(miglitol)的Lactec注射液[LR+175Mi]、和包含175mM伏格列波糖(voglibose)的Lactec注射液[LR+175V])中以4℃保存3天后的细胞存活率的结果(n＝3)的图(参照表7)。图中的“Pre”表示包含以4℃保存前的hMSC的PBS中的hMSC的细胞存活率(98.5±0.6)。图中的“＊＊＊”表示进行Dunnett多重比较检验，在统计学上存在显著差异(p＜0.001)。

图7是表示将hMSC在2种被检测用等渗液(Lactec注射液[LR]、和包含88mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+88A])中以25℃保存48小时后的相位差显微镜图像的图。关于各个被检测用等渗液，拍摄多个不同视野的图像，表示代表性的3个图像。图像中的黑色圈围住的地方表示细胞凝集块。

图8是表示利用台盼蓝染色法解析将扩大培养后的CD8阳性T细胞在3种被检测用等渗液(Lactec注射液[LR]、包含88mM海藻糖的Lactec注射液[LR+88T]、和包含88mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+88A])中以5℃保存前的细胞存活率(图8A)或保存24小时后的细胞存活率(图8B)的结果(n＝3)的图(参照表8)。图中的“＊和“＊＊”表示进行Student的t检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.05和p＜0.01)，图中的“n.s”表示进行Student的t检验，不具有统计学上的显著差异(p≥0.05)。

图9中图9A表示包含以5℃保存前的hMSC的PBS中的hMSC的细胞存活率(93.7±2.0％)。图9B是表示利用台盼蓝染色法解析将该hMSC在5种被检测用等渗液(Lactec注射液[LR]、包含44mM水苏糖的Lactec注射液[LR+44S]、包含88mM水苏糖的Lactec注射液[LR+88S]、包含175mM水苏糖的Lactec注射液[LR+175S]、和包含88mM海藻糖的Lactec注射液[LR+88T])中以5℃保存4天后的细胞存活率的结果(n＝3)的图(参照表9)。图中的“＊＊”和“＊＊＊”表示进行Dunnett多重比较检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.01和p＜0.001)。

图10中，图10A表示包含以5℃保存前的hMSC的PBS中的hMSC的细胞存活率(93.7±3.2％)。图10B和10C是表示利用台盼蓝染色法解析将该hMSC在8种被检测用等渗液(Lactec注射液[LR]、包含88mM阿卡伯糖的Lactec注射液[LR+88A]、大塚生食注射液[S]、包含88mM阿卡伯糖的大塚生食注射液[S+88A]、林格液“Ohtsuka”[R]、包含88mM阿卡伯糖的林格液“Ohtsuka”[R+88A]、Veen F输液[AR]、和包含88mM阿卡伯糖的Veen F输液[AR+88A])中以5℃分别保存3天和9天后的细胞存活率的结果(n＝3)的图(参照表10)。图中的“＊”、“＊＊”、和“＊＊＊”表示进行Student的t检验，分别具有统计学上显著的差异(p＜0.05、p＜0.01、和p＜0.001)，图中的“n.s”表示进行Student的t检验，没有统计学上显著的差异(p≥0.05)。

具体实施方式

本发明的哺乳动物细胞保存用液为“用于保存哺乳动物细胞”这一用途中特定的包含阿卡伯糖类和/或水苏糖类的液体(即、本发明哺乳动物细胞保存用液)。

作为本发明哺乳动物细胞保存用液，只要是能够保存哺乳动物细胞的液体(例如、等渗液、低渗液、高渗液)即可，能够优选例示等渗液。在本说明书中“等渗液”是指具有与体液或细胞液的渗透压基本相同的渗透压的液体，具体而言是指具有250～380mOsm/L的范围内的渗透压的液体。另外，在本说明书中，“低渗液”是指具有比体液或细胞液的渗透压低的渗透压的液体，具体是指具有低于250mOsm/L的渗透压的液体。作为这样的低渗液，优选细胞不破裂程度的低渗液(具体而言为具有大于或等于100且小于250mOsm/L的范围内的渗透压的液体)。另外，在本说明书中，“高渗液”是指具有比体液或细胞液的渗透压高的渗透压的液体，具体是指渗透压超过380mOsm/L(优选在超过380mOsm/L且小于或等于1000mOsm/L的范围内)。

作为上述等渗液，只要是以与体液或细胞液的渗透压基本相同的方式通过钠离子、钾离子、钙离子等调整盐浓度或糖浓度等得到的等渗液即可没有特别限制，具体而言能够列举生理盐水、或具有缓冲效果的生理盐水(例如、PBS、Tris缓冲生理盐水[TrisBuffered Saline；TBS]、HEPES缓冲生理盐水)、林格液、乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氢盐林格液、5％葡萄糖水溶液、动物细胞培养用基础培养基(例如、DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199)、等渗剂(例如、葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、乳糖、氯化钠)等，这些之中，优选乳酸林格液、乙酸林格液、林格液、或生理盐水(生理盐液)。等渗液可以是市售的等渗液，也可以是自己制备的等渗液。作为市售的等渗液，能够列举大塚生食注射液(株式会社大塚制药工场制)(生理盐水)、林格液“Ohtsuka”(株式会社大塚制药工场制)(林格液)、Lactec(注册商标)注射液(株式会社大塚制药工场制)(乳酸林格液)、乳酸林格液“KS”(共立制药株式会社制)(乳酸林格液)、Veen F输液(扶桑药品工业社制)(乙酸林格液)、大塚糖液5％(株式会社大塚制药工场制)(5％葡萄糖水溶液)、BICANATE输液(株式会社大塚制药工场制)(碳酸氢盐林格液)。

上述阿卡伯糖(Acarbose)是指D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖、和(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-三羟基-3-(羟基甲基)-2-环己烯相连的四糖，更具体而言为以下的式所示的物质。阿卡伯糖可以通过化学合成、利用微生物的生产(例如、游动放线菌[Actinoplanes]属的氨基糖产生菌的培养)、利用酶的生产等的任意公知的方法来制造，也可以使用市售品。例如，能够列举阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)、阿卡伯糖(商品名：Glucobay)(BayerYakuhin,Ltd制)等的市售品。

作为上述阿卡伯糖的盐，例如能够列举盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等的酸加成盐；钠盐、钾盐、钙盐等的金属盐；铵盐、烷基铵盐等。此外，这些盐在使用时作为溶液使用，优选其作用与阿卡伯糖同效的盐。这些盐类可以形成水合物或溶剂合物，还可以任意单独使用或适当组合使用2种以上。

在本发明中，作为等渗液中的阿卡伯糖类的浓度，只要是可以发挥阿卡伯糖类带来的细胞存活率降低的抑制效果的浓度即可，例如至少为40mM，优选为至少80mM，更优选为至少150mM，更加优选为至少160mM，进一步优选为至少170mM。另外，从成本效益的方面来看，等渗液中的阿卡伯糖类的浓度例如为1000mM以下，优选为700mM以下，更优选为600mM以下，更加优选为500mM以下，进一步优选为400mM以下。因此，等渗液中的阿卡伯糖类浓度例如为40～1000mM的范围内，优选为80～700mM，更优选为150～600mM，更加优选为160m～500mM，进一步优选为170～400mM。

上述水苏糖(Stachyose)是指D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、和D-半乳糖相连的四糖，更具体而言为以下的式所示的物质。水苏糖可以通过化学合成、利用植物的生产(例如、从大豆等的豆类或葫芦科植物中进行热水提取)、利用酶的生产等的任意公知的方法来制造，也可以使用市售品。例如，能够列举水苏糖n水合物(和光纯药工业株式会社制)、水苏糖水合物(东京化成工业株式会社制)等的市售品。

作为上述水苏糖的盐，能够列举例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等的酸加成盐；钠盐、钾盐、钙盐等的金属盐；铵盐、烷基铵盐等。此外，这些盐在使用时作为溶液使用，优选其作用与水苏糖同效的盐。这些盐类可以形成水合物或溶剂合物，还可以任意单独使用或适当组合使用2种以上。

在本发明中，作为等渗液中的水苏糖类的浓度，只要是可以发挥水苏糖类带来的细胞存活率降低的抑制效果的浓度即可，例如至少为40mM，优选为至少80mM，更优选为至少150mM，更加优选为至少160mM，进一步优选为至少170mM。另外，从成本效益的方面来看，等渗液中的水苏糖类的浓度例如为1000mM以下，优选为700mM以下，更优选为600mM以下，更加优选为500mM以下，进一步优选为400mM以下。因此，等渗液中的水苏糖类浓度例如为40～1000mM的范围内，优选为80～700mM，更优选为150～600mM，更加优选为160m～500mM，进一步优选为170～400mM。

本发明哺乳动物细胞保存用液是用于将哺乳动物细胞在包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液以液体的状态存在的温度条件下保存任意期间的液体。本发明哺乳动物细胞保存用液中所含的阿卡伯糖类和水苏糖类是具有有效地抑制将哺乳动物细胞在液体中保存时产生的细胞存活率降低和细胞凝集的作用，且在哺乳动物的机体内投予的情况下，对哺乳动物的生态造成不良影响的可能性低的物质。因此，本发明哺乳动物细胞保存用液优选进一步被规定为选自“用于抑制哺乳动物细胞的存活率降低”的用途；“用于抑制哺乳动物细胞的细胞凝集”的用途；和“用于移植哺乳动物细胞”的用途中的1或2种以上的用途。

本发明哺乳动物细胞保存用液在阿卡伯糖类和水苏糖类以外，还可以包含具有哺乳动物细胞的存活率降低抑制作用的成分，但即使仅为阿卡伯糖类或水苏糖类，就可发挥哺乳动物细胞的存活率降低抑制效果，所以也可以在阿卡伯糖类和水苏糖类以外，不包含具有哺乳动物细胞的存活率降低抑制作用的成分(例如、海藻糖、羟乙基淀粉[Hydroxyethyl starch；HES]、葡萄糖)。

本发明哺乳动物细胞保存用液可以不包含通常具有抑制将哺乳动物细胞冻结保存或冻结干燥保存时的哺乳动物细胞的存活率降低的作用的成分、例如、二甲基亚砜[Dimethyl sulfoxide；DMSO]、甘油、乙二醇、丙二醇、二甲基乙酰胺、聚乙二醇[PEG]、聚乙烯吡咯烷酮、血清或来自血清的成分(例如、白蛋白)等的冻结保护剂或冻结干燥保护剂。

作为本发明哺乳动物细胞保存用液，在将包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液直接用于移植的情况下，优选适于哺乳动物细胞移植的液体，这样的适于哺乳动物细胞移植的液体优选不含不适于哺乳动物细胞移植的物质例如来自机体的成分(例如血清或来自血清的成分[例如、白蛋白])、和上述的冻结保护剂或冻结干燥保护剂。

作为本发明哺乳动物细胞保存用液，可以是单独包含阿卡伯糖类或水苏糖类的液体，也可以是包含选自阿卡伯糖类和水苏糖类中的2种以上的四糖的液体，或在阿卡伯糖类和/或水苏糖类以外还包含任意成分的液体。

在本说明书中作为“任意成分”，能够列举例如等渗剂(例如、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、乳糖、氯化钠)、螯合剂(例如、EDTA、EGTA、柠檬酸、水杨酸盐)、助溶剂、保存剂、抗氧化剂、氨基酸(例如、脯氨酸、谷氨酰胺)、聚合物(例如、聚醚)、磷脂质(例如、溶血磷脂酸[LPA；Lysophosphatidic acid])。在本说明书中“任意成分”是指可以包含也可以不包含的成分。

另外，本发明中包括一种用于制备本发明哺乳动物细胞保存用液的粉末制剂，其包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐。该粉末制剂中可以包含上述的任意成分。

本发明的哺乳动物细胞的保存方法是包括在包含阿卡伯糖类和/或水苏糖类的液体(即、本发明哺乳动物细胞保存用液)中，将哺乳动物细胞保存任意期间的工序的方法(以下，有时称为“本发明保存方法”)。本发明保存方法通常是将包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液在该保存用液以液体的状态存在的温度条件下保存，不包括在该保存用液以固体的状态存在的温度条件下保存的工序(例如冻结保存的工序、冻结干燥保存的工序等将哺乳动物细胞以休眠状态保存的工序)。另外，本发明哺乳动物细胞保存用液中的哺乳动物细胞的密度在例如10³～10¹⁰个/mL的范围内。

作为本发明保存方法，还可以进一步包括在本发明哺乳动物细胞保存用液中保存哺乳动物细胞之前，在包含阿卡伯糖类和/或水苏糖类的液体(优选为等渗液)中加入哺乳动物细胞，或者在包含哺乳动物细胞的液体(优选为等渗液)中加入阿卡伯糖类和/或水苏糖类，由此制备包含阿卡伯糖类和/或水苏糖类的液体的工序。

在本发明中，作为保存哺乳动物细胞的任意期间，优选将包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液以液体的状态保存时，能够抑制该保存用液中的哺乳动物细胞的细胞存活率降低、提高活细胞的比例的期间，例如为6小时以上、12小时以上、24小时(1天)以上、36小时(1.5天)以上、48小时(2天)以上、3天以上、7天以上、10天以上，另外，由于哺乳动物细胞的保存期间过长的话，存在对细胞的生存造成不良影响的可能性，因此从避免对细胞的存活率的不良影响的观点出发，通常为30天以下，优选为20天以下，更优选为10天以下，更加优选为6天以下。因此，作为上述任意的保存期间，通常为6小时～30天的范围内、12小时～30天的范围内、24小时～30天的范围内、36小时～30天的范围内、48小时～30天的范围内、3～30天的范围内、7～30天的范围内、或10～30天的范围内，优选为6小时～20天、12小时～20天、24小时～20天、36小时～20天、48小时～20天、3～20天、7～20天、或10～20天，更优选为6小时～10天、12小时～10天、24小时～10天、36小时～10天、48小时～10天、3～10天、或7～10天，更加优选为6小时～6天、12小时～6天、24小时～6天、36小时～6天、48小时～6天、或3～6天。

在本发明中，作为“包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液以液体的状态存在的温度”只要是包含哺乳动物细胞的本发明哺乳动物细胞保存用液不冻结而以液体的状态存在且该保存用液中的哺乳动物细胞能够繁殖的温度即可，通常在0～40℃的范围内，优选在0～30℃(室温)的范围内。

作为本发明的哺乳动物细胞，能够例示例如在对需要哺乳动物细胞移植治疗的疾病(癌；I型糖尿病；肝疾病等的脏器疾病等)的再生医疗中，经由血管投予的哺乳动物细胞，具体而言，干细胞；胰岛细胞；肝细胞；白细胞(例如、树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞)等，优选为干细胞、淋巴细胞、或肝细胞。其中，“淋巴细胞”是哺乳动物细胞的免疫***中的白细胞的一种亚型，是指识别抗原、具有免疫能力的细胞。淋巴细胞中具体包括T细胞(例如、α·β[αβ]T细胞、γ·δ[γδ]T细胞、细胞毒性T细胞[cytotoxic Tlymphocyte；CTL]、辅助性T细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞。

上述哺乳动物细胞能够利用公知的通常的方法分离。例如白细胞或、白细胞所包含的淋巴细胞(例如、T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞)能够从溶血处理后的末梢血或脐带血试样中，根据需要在IL-2或抗CD3抗体的存在下扩大培养后，通过使用了对白细胞的细胞表面标志物(CD45)、T细胞的细胞表面标志物(CD3)、辅助性T细胞的细胞表面标志物(CD4)、细胞毒性T细胞(CD8)、γδT细胞的细胞表面标志物(CD39)的抗体的荧光激活细胞分选仪(FACS)、或通过使用了由荧光物质或生物素、亲和素等标记物质标记了的对上述细胞表面标志物的抗体、和对上述标记物质的抗体与MACS珠(磁珠)的复合抗体的自动磁性细胞分选仪(autoMACS)，作为各个标志物为阳性的细胞分离。作为上述荧光物质，能够列举别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(PE)、FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、PE-Texas Red、PE-Cy5、PE-Cy7等。

另外上述“干细胞”是指具有自我复制能力和分化、增殖能力的未成熟的细胞。干细胞根据分化能力不同而包括多能性干细胞(pluripotent stem cell)、多分化潜能性干细胞(multipotent stem cell)、单能性干细胞(unipotent stem cell)等的亚群。多能性干细胞是指其本身不能成为个体，但具有能够分化成构成机体的全部组织和细胞的能力的细胞。多分化潜能性干细胞是指具有分化成虽然不是全部种类，但能够分化成多种组织和细胞的能力的细胞。单能性干细胞是指具有能够分化成特定的组织和细胞的能力的细胞。

作为多能性干细胞，能够列举胚胎干细胞(Embryonic stem cell；ES细胞)、EG细胞(Embryonic germ cell，胚胎生殖细胞)、诱导多能性干细胞(Induced pluripotentstem cell；iPS细胞)等。ES细胞能够通过将内部细胞块在饲养细胞上或包含LIF的培养基中培养来制造。ES细胞的制造方法例如记载于WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等。EG细胞能够通过将原始生殖细胞在包含mSCF、LIF和bFGF的培养基中培养来制造(Ce11,70:841-847,1992)。iPS细胞能够通过在体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞等)中导入Oct3/4、Sox2和Klf4(根据需要还有c-Myc或n-Myc)等重新编程因子来制造(Ce11,126:p.663-676,2006；Nature,448:p.313-317,2007；Nat Biotechno1,26；p,101-106,2008；Cel1 131:p.861-872,2007；Science,318:p.1917-1920,2007；Ce11 StemCells 1:p.55-70,2007；Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007；Nature,448:p.318-324,2007；Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008；Nature 451:p.141-146,2008；Science,318:p.1917-1920,2007)。通过培养将体细胞的细胞核进行核移植所制作的早期胚胎而构建的干细胞也优选作为多能性干细胞(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；Nature Biotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))、Rideout III等(Nature Genetics,24,109(2000))。

作为多分化潜能性干细胞，能够列举能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等的细胞的间充质干细胞、能够分化成白细胞、红细胞、血小板等的血细胞系细胞的造血系干细胞、能够分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等的细胞的神经系干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞等的成体干细胞等。多分化潜能性干细胞优选为间充质干细胞。间充质干细胞是指能够分化成成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞的全部或几种的干细胞。多分化潜能性干细胞能够通过本身公知的方法从机体中分离。例如间充质干细胞能够用公知的通常的方法从哺乳动物的骨髓、脂肪组织、末梢血、脐带血等中采集。例如，能够通过骨髓穿刺后的造血干细胞等的培养、传代，分离人间充质干细胞(Journal ofAutoimmunity，30(2008)163-171)。多分化潜能性干细胞也能够通过将上述多能性干细胞在适当的诱导条件下培养而获得。

作为本发明的哺乳动物，能够例示小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等的啮齿类、兔子等的兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等的有蹄目、狗、猫等的猫目、人、猿猴、恒河猴、食蟹猴、狨猴、红毛猩猩(Orangutan)、黑猩猩(Chimpanzee)等的灵长类等，其中，能够优选例示小鼠、猪、人。

作为本发明的哺乳动物细胞，能够例示附着性(也称为“粘附性”)的细胞。本说明书中“附着性”细胞是指能够通过粘附于支架而进行生存、增殖、物质的生产的支架依赖性的细胞。作为附着性干细胞，例如能够列举多能性干细胞、间充质干细胞、神经系干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞等，能够优选例示间充质干细胞。

本发明的哺乳动物细胞(群)可以从机体内分离得到，也可以在体外传代培养得到，优选分离或纯化。本说明书中，“分离或纯化”是指实施了将目标成分以外的成分除去的操作的意思。被分离或纯化的哺乳动物细胞的纯度(哺乳动物干细胞数等的目标细胞相对于总细胞数的比例)通常为30％以上，优选为50％以上，更优选为70％以上，更加优选为90％以上(例如100％)。

在本发明哺乳动物细胞保存用液中保存的哺乳动物细胞(群)可以是单一细胞(单细胞)的状态。在本说明书中，“单一细胞的状态”是指不与其他细胞聚集形成块(即不凝集的状态)的意思。单一细胞的状态的哺乳动物细胞能够通过将在体外培养的哺乳动物细胞用胰蛋白酶/EDTA等进行酶处理而制备。哺乳动物细胞中所含的单一细胞的状态的哺乳动物细胞的比例例如为70％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，更加优选为99％以上(例如100％)。单一细胞的状态的细胞的比例能够通过将哺乳动物细胞分散在PBS中，将其在显微镜下观察，对随机选择的多个(例如1000个)细胞调查凝集的有无来确定。

本发明哺乳动物细胞保存用液中保存的哺乳动物细胞(群)可以漂浮。在本说明书中，“漂浮”是指哺乳动物细胞不与收纳保存用液的容器的内壁接触而保持在液体中的状态。

本发明哺乳动物细胞保存用液中保存的哺乳动物细胞凝集或沉淀的情况下，优选在移植前通过吹打(Pipetting)或轻敲(tapping)等的该技术领域中公知的方法使哺乳动物细胞悬浮。

以下，通过实施例更具体地说明本发明，本发明的技术范围不限于这些例示。

实施例

实施例1：阿卡伯糖和水苏糖的筛选

本发明的发明人目前为止报道了在包含哺乳动物细胞的液体中添加海藻糖，则能够抑制以溶液的状态保存时的细胞存活率降低(日本特开2012-115253号公报、国际公开第2014/208053号小册子)。因此，在本实施例中，从海藻糖以外的糖类中探索显示细胞存活率降低的抑制效果的物质。

1-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

选择93种糖类，对分子量明确的糖类，以成为87.5mM的浓度的方式，分别添加、溶解到作为乳酸林格液的Lactec(注册商标)注射液(株式会社大塚制药工场制)中来制备，另外，对分子量不明的糖类，以成为4～5％的浓度的方式，分别添加、溶解到Lactec注射液中，制备包含93种糖类的等渗液。另外，将海藻糖(株式会社林原公司制)添加、溶解到Lactec注射液中制备，制备包含88mM海藻糖的等渗液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用来自骨髓的人间充质干细胞(Lonza Walkersville公司制)(以下，称为“hMSC”)。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照以下的步骤〔1〕～〔8〕制备。

〔1〕将4×10⁵个hMSC加到75cm²烧瓶中，在培养基存在下以37℃、5％CO₂培养箱进行培养。在显微镜下观察细胞的状态，进行培养直到达到约80％左右铺满。

〔2〕去除培养基，用8mL的PBS(-)冲洗hMSC。

〔3〕去除PBS(-)，加入3.75mL的胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司制)，在室温静置5分钟。

〔4〕一边在显微镜下观察直到hMSC发生90％左右剥离，一边缓慢摇动。

〔5〕加入3.75mL的培养基，使胰蛋白酶反应停止，利用移液器将hMSC回收，转移至50mL离心管。

〔6〕以600×g、5分钟、22℃进行离心分离。

〔7〕去除上清(培养基)，加入1.5mL的PBS(-)，使沉淀(hMSC)悬浮。

〔8〕测量细胞数，用PBS(-)调整以达到5×10⁵cells/mL，制备包含hMSC的PBS。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

各种被检测用等渗液中的hMSC的保存按照以下的步骤〔1〕～〔2〕进行。

〔1〕将制备的包含hMSC的PBS在各试管中分注各0.5mL，进行离心分离(600×g、5分钟)。

〔2〕除去上清(PBS)，用0.5mL的各种被检测用等渗液使沉淀(hMSC)悬浮，在4℃保存3天。

[通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析]

通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析按照以下的步骤〔1〕～〔2〕进行。

〔1〕从包含以4℃保存3天后的hMSC的各种被检测用等渗液中分别采集20μL(相当于1×10⁴cells)，转移到试管后，混合台盼蓝染色液(Gibco公司制)20μL。此外，作为比较对照，从包含悬浮在各种被检测用等渗液中之前(在4℃保存前)的hMSC的PBS中分别采集20μL(相当于1×10⁴cells)，转移到试管后，混合台盼蓝染色液20μL。

〔2〕在显微镜下使用单细胞计数器(Biomedical science公司制)，进行总细胞数和台盼蓝阳性细胞(死细胞)数的测定，计算台盼蓝阴性细胞相对于总细胞数的比例即、细胞存活率。

1-2.结果

93种糖类中，作为细胞存活率降低的抑制效果比海藻糖高的糖类，得到了阿卡伯糖和水苏糖。

而关于D-乳糖酸、(-)-2，3-O-异亚丙基-D-苏糖醇、D-半乳糖醛酸、和D-甘露糖胺，相比于在乳酸林格液中保存hMSC的情况，细胞存活率降低。

实施例2：通过阿卡伯糖和水苏糖的细胞存活率降低抑制效果的确认

阿卡伯糖和水苏糖共同均为四糖类。因此，为了确认阿卡伯糖和水苏糖以外的四糖类是否也具有细胞存活率降低抑制效果，使用2种四糖(蔗果四糖和麦芽四糖)进行了研究。

2-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM阿卡伯糖的等渗液。

另外，将水苏糖n水合物(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM水苏糖的等渗液。另外，将蔗果四糖三水合物(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM蔗果四糖的等渗液。另外，将麦芽四糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM麦芽四糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了Lactec注射液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用了实施例1中使用的hMSC。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

将hMSC按照实施例1中记载的方法在各种被检测用等渗液中以4℃保持2天。

[通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析]

通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析按照实施例1中记载的方法进行。

2-2.结果

如果将hMSC保存在包含阿卡伯糖或水苏糖的Lactec注射液中，则与保存在Lactec注射液中的情况相比，确认到细胞存活率上升，而相对于此，即使将hMSC保存在包含蔗果四糖或麦芽四糖的Lactec注射液中，也确认不到这样的细胞存活率的上升(参照表1和图1)。

该结果表明通过阿卡伯糖和水苏糖带来的细胞存活率降低抑制效果在四糖类中并不是共通的，而是阿卡伯糖和水苏糖特异性的。

表1

实施例3：通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果的确认1

比较研究了通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果、和通过海藻糖或葡萄糖的细胞存活率降低抑制效果。

3-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含88mM阿卡伯糖的等渗液、和包含175mM阿卡伯糖的等渗液。另外，将海藻糖(株式会社林原公司制)添加、溶解于Lactec注射液进行制备，制备包含88mM海藻糖的等渗液和包含175mM海藻糖的等渗液。另外，将葡萄糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含88mM葡萄糖的等渗液和包含175mM葡萄糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了作为生理盐水的大塚生食注射液(株式会社大塚制药工场制)、Lactec注射液、和人间充质干细胞专用培养基试剂盒(MSCGM BulletKit、以下称为“培养基”)(Lonza Walkersville公司制、PT-3001)。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用了实施例1中使用的hMSC。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

将hMSC按照实施例1中记载的方法，在各种被检测用等渗液中以4℃保存3天。

[通过XTT法的hMSC的细胞存活率的解析]

通过XTT(sodium3'-[1(-phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)benze ne sulfonic acid hydrate，3'-[1(-苯氨基羰基)-3,4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物)法的细胞存活率的解析按照以下的步骤〔1〕～〔3〕进行。

〔1〕从包含以4℃保存3天后的hMSC的各种被检测用等渗液分别采集100μL(相当于5×10⁴cells)，转移到试管后，以600×g、5分钟、22℃进行离心分离。

〔2〕去除上清(各种被检测用等渗液)，加入100μL的培养基，使沉淀(hMSC)悬浮后，转移至96孔板。

〔3〕将细胞增殖试剂盒II(Cat.No.1465015、Roche公司制)的XTT混合试剂(将XTT试剂与电子偶联液以50：1的比率混合得到的混合液)向各孔各加入50μL。

〔4〕在24分钟后使用读板器(Viento XS[KC junior]、大日本制药株式会社制)，测定被活细胞代谢所产生的甲臜色素的吸光度即480nm的吸光度(A₄₈₀)与对照波长的吸光度即650nm的吸光度(A₆₅₀)，算出用A₆₅₀校正后的A₄₈₀的吸光度(A₄₈₀-A₆₅₀)。

3-2.结果

如果将hMSC保存于包含88mM或175mM的阿卡伯糖的Lactec注射液中，则比在Lactec注射液中保存时，作为活细胞的指标的“A₄₈₀-A₆₅₀”值高(参照表2和图2)。另外，如果将hMSC保存于包含88mM或175mM的海藻糖或葡萄糖的Lactec注射液中，则比在Lactec注射液中保存时，“A₄₈₀-A₆₅₀”值高，但是在包含相同浓度的阿卡伯糖的Lactec注射液中保存hMSC时，该值显著更高(参照表2和图2)。

其结果表明如果在等渗液中添加阿卡伯糖来保存哺乳动物细胞，则相比于在不添加阿卡伯糖的等渗液、或添加了海藻糖或葡萄糖的等渗液中保存哺乳动物细胞的情况，有效抑制该液中的哺乳动物细胞的细胞死亡，能够提高活细胞的比例。

表2

实施例4：阿卡伯糖的最优浓度的研究

使用包含44～350mM阿卡伯糖的等渗液，研究了由阿卡伯糖带来的细胞存活率降低抑制效果的最优浓度。

4-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含44mM阿卡伯糖的等渗液、包含88mM阿卡伯糖的等渗液、包含175mM阿卡伯糖的等渗液、和包含350mM阿卡伯糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了Lactec注射液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用在实施例1中使用的hMSC。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

[通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析]

通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析按照实施例1记载的方法进行。

4-2.结果

如果将hMSC在包含44～175mM的阿卡伯糖的Lactec注射液中保存，则细胞存活率以与阿卡伯糖的浓度呈依赖性的方式上升，相对于此，如果将hMSC在包含175～350mM的阿卡伯糖的Lactec注射液中保存，则细胞存活率基本不变(参照表3和图3)。

其结果表明在等渗液中添加至少44mM左右(优选为至少175mM左右)的阿卡伯糖来保存哺乳动物细胞，则能够有效抑制该液体中的哺乳动物细胞的细胞死亡。

表3

实施例5：长时间保存哺乳动物细胞时的通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果的确认

为了确认通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果在长时间保存哺乳动物细胞时是否可以确认到，将hMSC在包含阿卡伯糖的等渗液中以4℃保存28天，解析细胞存活率。

5-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含44mM阿卡伯糖的等渗液、包含88mM阿卡伯糖的等渗液、和包含175mM阿卡伯糖的等渗液。另外，将海藻糖(株式会社林原公司制)添加、溶解于Lactec注射液进行制备，制备包含88mM海藻糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了Lactec注射液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用了实施例1中使用的hMSC。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

将hMSC按照实施例1中记载的方法，在各种被检测用等渗液中以4℃保存28天。

[通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析]

5-2.结果

如果将hMSC在Lactec注射液中保存28天，则细胞存活率为0％，相对于此，如果将hMSC在包含88mM的阿卡伯糖的Lactec注射液中保存28天，则细胞存活率上升至15.9±5.90％(参照表4和图4)。另外，在包含海藻糖的Lactec注射液中将hMSC保存28天的情况下，虽然细胞存活率上升，但在包含阿卡伯糖的Lactec注射液中将hMSC保存28天时其比例更高(参照表4和图4)。此外，如果在包含175mM的阿卡伯糖的Lactec注射液中保存hMSC，则与在包含88mM的阿卡伯糖的Lactec注射液中保存hMSC的情况相比，显示出细胞存活率进一步上升(参照表4和图4)。

这些结果表明在等渗液中添加阿卡伯糖来将哺乳动物细胞长时间(以4℃28天)保存的情况下，相比于在等渗液中添加海藻糖将哺乳动物细胞长时间保存的情况，也能够更有效抑制哺乳动物细胞的存活率降低。

表4

实施例6：通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果的确认2

利用hMSC以外的哺乳动物细胞(大鼠肝细胞)确认了通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果。

6-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM阿卡伯糖的等渗液。另外，将海藻糖(株式会社林原制)添加、溶解于Lactec注射液进行制备，制备包含175mM海藻糖的等渗液。另外，将葡萄糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM葡萄糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了大塚生食注射液、Lactec注射液、和培养基。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用了以下的表5所示的大鼠肝细胞。

表5

[包含大鼠肝细胞的清洗用培养基的制备]

按照以下的步骤〔1〕～〔6〕制备包含大鼠肝细胞的清洗用培养基。

〔1〕将大鼠肝细胞的保存管从液氮罐中取出，在37℃恒温槽中融化。

〔2〕融化后，立即在冰上静置，转移至50mL离心管。

〔3〕滴加25mL冰冷的肝细胞清洗用培养基(Hepatocyte Wash Medium、以下称为“清洗用培养基”)(GIBCO公司制)。

〔4〕以50×g、3分钟、4℃进行离心分离。

〔5〕去除上清(清洗用培养基)，加入6mL的清洗用培养基，使沉淀(大鼠肝细胞)通过2～3次吹打而悬浮。

〔6〕测量细胞数，以成为5×10⁵cells/mL的方式用清洗用培养基调整，制备包含大鼠肝细胞的清洗用培养基。

[各种被检测用等渗液中的大鼠肝细胞的保存方法]

各种被检测用等渗液中的大鼠肝细胞的保存按照以下的步骤〔1〕～〔2〕进行。

〔1〕将制备的包含大鼠肝细胞的清洗用培养基在各试管中各分注0.5mL，进行离心分离(50×g、3分钟、4℃)。

〔2〕去除上清(清洗用培养基)，将沉淀(大鼠肝细胞)用0.5mL的各种被检测用等渗液悬浮，在4℃保存24小时。

[通过台盼蓝染色法的大鼠肝细胞的细胞存活率的解析]

通过台盼蓝染色法的大鼠肝细胞的细胞存活率的解析在实施例1记载的方法中，将hMSC替换成大鼠肝细胞来进行。

6-2.结果

如果将大鼠肝细胞保存在包含阿卡伯糖的Lactec注射液中，则与在Lactec注射液中保存的情况、或在包含海藻糖或葡萄糖的Lactec注射液中保存的情况相比，细胞存活率显著上升(参照表6和图5)。根据该结果，通过阿卡伯糖的细胞死亡抑制效果不限于间充质干细胞(hMSC)，在肝细胞也被确认到，因此可以认为是在所有哺乳动物细胞中都可以被确认到的效果。

表6

实施例7：通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果的确认3

阿卡伯糖与α葡萄糖苷酶的活性部位结合，具有抑制糖的水解的作用。因此，为了确认通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果是否是哺乳动物细胞中的α葡萄糖苷酶活性被抑制的结果而产生的，使用阿卡伯糖以外的作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的2种物质(米格列醇和伏格列波糖)进行了研究。

7-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM阿卡伯糖的等渗液。另外，将米格列醇(东京化成工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM米格列醇的等渗液。另外，将伏格列波糖(东京化成工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含175mM伏格列波糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了Lactec注射液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用了实施例1中使用的hMSC。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

[通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析]

7-2.结果

将hMSC在包含阿卡伯糖的Lactec注射液中保存的情况，与在Lactec注射液中保存的情况相比，确认到细胞存活率上升，相对于此，将hMSC在包含米格列醇或伏格列波糖的Lactec注射液中保存的情况，与在Lactec注射液中保存的情况相比，细胞存活率基本不变(参照表7和图6)。

其结果表明通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果不是哺乳动物细胞中的α葡萄糖苷酶活性被抑制的效果所产生的效果。

表7

实施例8：通过阿卡伯糖的细胞凝集抑制效果

为了确认阿卡伯糖是否具有细胞凝集抑制效果，在包含阿卡伯糖的等渗液中保存hMSC，解析细胞凝集水平。

8-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含88mM阿卡伯糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了Lactec注射液。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

将hMSC按照实施例1中记载的方法，在各种被检测用等渗液中以25℃保存48小时。

[细胞凝集水平的解析方法]

采集一部分包含保存后的hMSC的各种被检测用等渗液，在相位差显微镜下观察3个以上的细胞聚集而成的细胞凝集块的有无。

8-2.结果

如果将hMSC保存在Lactec注射液中，则确认到多个细胞凝集块的形成(参照图7的上段、用黑色圈围住的地方)。而如果将hMSC保存在包含阿卡伯糖的Lactec注射液中，则基本确认不到细胞凝集块的形成(参照图7的下段)。

其结果表明如果在等渗液中添加阿卡伯糖来保存哺乳动物细胞，则能够有效抑制该液中的哺乳动物细胞的细胞凝集。

实施例9：hMSC以外的哺乳动物细胞的研究

为了确认通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果在保存hMSC以外的哺乳动物细胞时也可以确认到，利用作为淋巴细胞之一的CD8阳性T细胞进行了研究。

9-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含88mM阿卡伯糖的等渗液。另外，作为比较对照，将海藻糖(株式会社林原公司制)添加、溶解于Lactec注射液来制备，制备包含88mM海藻糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用了Lactec注射液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用了CD8阳性T细胞(VERITAS公司制)。

[CD8阳性T细胞的放大培养法]

CD8阳性T细胞的放大培养按照以下的步骤〔1〕～〔3〕进行。

〔1〕将冻结保存的CD8阳性T细胞融化后，用淋巴细胞培养培养基(LGM3、Lonza公司制)清洗，在该培养基中孵育约1小时(37℃、5％CO₂)。

〔2〕分离采集包含CD8阳性T细胞的培养基，进行离心分离(300×g、10分钟、室温)。

〔3〕去除上清，使其漂浮于TLY CULTURE试剂盒25(GCLYMPHOTEC公司制)，将CD8阳性T细胞在37℃、5％CO₂条件下放大培养7天。

[放大培养后的CD8阳性T细胞的保存和细胞存活率的测定]

放大培养后的CD8阳性T细胞的保存和细胞存活率的测定按照以下的步骤〔1〕～〔3〕进行。

〔1〕将放大培养7天的CD8阳性T细胞(细胞浓度为约1.1×10⁶细胞/5mL)用包含88mM海藻糖的Lactec注射液清洗，分注于Stemfull试管(住友电木株式会社制)后，进行离心分离(300×g、10分钟、室温)。

〔2〕去除上清，将沉淀(CD8阳性T细胞)用3种被检测用等渗液(包含88mM阿卡伯糖的Lactec注射液、包含88mM海藻糖的Lactec注射液、和Lactec注射液)悬浮后，在5℃保存24小时。此外，为了测定保存前的细胞存活率，在刚悬浮后，立即从各Stemfull试管中将CD8阳性T细胞悬浮液回收一部分(20μL)，与台盼蓝染色液20μL混合后，在显微镜下使用单细胞计数器(Biomedical science公司制)，测量1处的细胞计数部的四角的细胞计数室的区域的合计细胞数和台盼蓝阳性细胞(死细胞)数，算出台盼蓝阴性细胞相对于总细胞数的比例(细胞存活率)。

〔3〕保存24小时后，根据上述〔2〕所述的方法，测量细胞存活率。

9-2.结果

如果将CD8阳性T细胞保存于包含阿卡伯糖的Lactec注射液中，则与保存在Lactec注射液中的情况相比，细胞存活率显著上升(参照表8和图8)。另外，在包含海藻糖的Lactec注射液中保存CD8阳性T细胞的情况下，虽然细胞存活率也上升，但在包含阿卡伯糖的Lactec注射液中保存CD8阳性T细胞的情况，其比例明显更高(参照表8和图8)。

其结果表明通过阿卡伯糖的存活率降低的抑制效果在保存CD8阳性T细胞等的淋巴细胞的情况下也会发挥，并且该效果高于海藻糖。

表8

实施例10：水苏糖的最佳浓度的研究

使用包含44～150mM水苏糖的等渗液，研究通过水苏糖的细胞存活率降低抑制效果的最佳浓度。

10-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将水苏糖n水合物(和光纯药工业株式会社制)添加、溶解于Lactec注射液，制备包含44mM水苏糖的等渗液、包含88mM水苏糖的等渗液、和包含175mM水苏糖的等渗液。另外，作为比较对照，将海藻糖(株式会社林原制)添加、溶解于Lactec注射液进行制备，制备包含88mM海藻糖的等渗液。此外，作为比较对照，使用Lactec注射液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用实施例1中使用的hMSC。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

将hMSC按照实施例1中记载的方法，在各种被检测用等渗液中以5℃保存4天。

[通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析]

10-2.结果

如果将hMSC保存在包含水苏糖的Lactec注射液中，则与在Lactec注射液中保存的情况相比，在任何浓度的水苏糖下细胞存活率都显著上升，或细胞存活率显示与水苏糖的浓度呈依赖性地上升(参照表9和图9)。另外，将hMSC保存在包含海藻糖的Lactec注射液中的情况下，虽然细胞存活率上升，但在包含水苏糖的Lactec注射液中保存hMSC的情况，其比例更高(参照表9和图9)。

其结果表明通过水苏糖的细胞存活率降低的抑制效果在等渗液中的水苏糖浓度至少为44mM左右发挥，还表明该效果高于海藻糖。

表9

实施例11：等渗液的研究

作为等渗液对Lactec注射液以外的等渗液也进行了研究。

11-1.材料和方法

[被检测用等渗液的制备]

将阿卡伯糖(和光纯药工业株式会社制)分别添加、溶解于4种等渗液(Lactec注射液、作为生理盐水的大塚生食注射液[株式会社大塚制药工场制]、林格液“Ohtsuka”[株式会社大塚制药工场制]、作为乙酸林格液的Veen F输液[扶桑药品工业株式会社制])，制备包含88mM阿卡伯糖的上述4种等渗液。另外，作为比较对照，使用上述4种等渗液。

[哺乳动物细胞]

哺乳动物细胞使用实施例1中使用的hMSC。

[包含hMSC的PBS的制备]

包含hMSC的PBS按照实施例1中记载的方法制备。

[各种被检测用等渗液中的hMSC的保存方法]

将hMSC按照实施例1中记载的方法，在各种被检测用等渗液中以5℃保存3天(参照图10B)或9天(参照图10C)。

[通过台盼蓝染色法的hMSC的细胞存活率的解析]

11-2.结果

如果将hMSC在包含阿卡伯糖的4种等渗液(Lactec注射液、大塚生食注射液、林格液“Ohtsuka”、Veen F输液)中保存3天，则与在这4种等渗液中保存3天的情况相比，细胞存活率上升，特别是在使用Lactec注射液和Veen F输液的情况下，细胞存活率显示显著上升(参照表10和图10B)。另外，如果将hMSC在包含阿卡伯糖的上述4种等渗液中保存9天，则与在这4种等渗液中保存9天的情况相比，细胞存活率显示显著上升(参照表10和图10C)。

其结果表明通过阿卡伯糖的细胞存活率降低抑制效果不限于Lactec注射液(即、乳酸林格液)，在大塚生食注射液(即、生理盐水)、林格液“Ohtsuka”(即、林格液)、Veen F输液(即、乙酸林格液)等的所有等渗液中都可以发挥。

表10

产业上的可利用性

根据本发明，通过在液体中加入阿卡伯糖类和/或水苏糖类，能够有效抑制将哺乳动物细胞在液体中保存时产生的细胞存活率降低和细胞凝集。此外，这些阿卡伯糖类和水苏糖类是在投予到哺乳动物的机体内时对哺乳动物的生态造成不良影响的可能性低的四糖类，因此将哺乳动物细胞在本发明哺乳动物细胞保存用液中保存后，不用替换成新的移植用液，能够直接向哺乳动物的机体内投予。

Claims

1.一种哺乳动物细胞保存用液，其包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐。

2.如权利要求1所述的哺乳动物细胞保存用液，其中，在等渗液中包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐。

3.如权利要求2所述的哺乳动物细胞保存用液，其中，等渗液中的阿卡伯糖或其盐的浓度至少为40mM。

4.如权利要求2或3所述的哺乳动物细胞保存用液，其中，等渗液中的水苏糖或其盐的浓度至少为40mM。

5.如权利要求2～4中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，其中，等渗液为乳酸林格液、乙酸林格液、林格液或生理盐水。

6.如权利要求1～5中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，其用于在0～40℃保存哺乳动物细胞。

7.如权利要求1～6中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，其用于将哺乳动物细胞保存6小时～30天。

8.如权利要求1～7中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，其用于抑制哺乳动物细胞的存活率降低。

9.如权利要求1～8中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，其用于抑制哺乳动物细胞的凝集。

10.如权利要求1～9中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，其用于哺乳动物细胞的移植。

11.如权利要求1～10中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞、哺乳动物淋巴细胞或哺乳动物肝细胞。

12.如权利要求11所述的哺乳动物细胞保存用液，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物淋巴细胞。

13.一种哺乳动物细胞的保存方法，其包括：在包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐的液体中保存哺乳动物细胞的工序。

14.如权利要求13所述的保存方法，其中，液体为等渗液。

15.如权利要求14所述的保存方法，其中，等渗液中的阿卡伯糖或其盐的浓度至少为40mM。

16.如权利要求14或15所述的保存方法，其中，等渗液中的水苏糖或其盐的浓度至少为40mM。

17.如权利要求14～16中任一项所述的保存方法，其中，等渗液为乳酸林格液、乙酸林格液、林格液或生理盐水。

18.如权利要求13～17中任一项所述的保存方法，其特征在于，将哺乳动物细胞在0～40℃保存。

19.如权利要求13～18中任一项所述的保存方法，其特征在于，将哺乳动物细胞保存6小时～30天。

20.如权利要求13～19中任一项所述的保存方法，其中，哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞、哺乳动物淋巴细胞或哺乳动物肝细胞。

21.如权利要求20所述的保存方法，其中，哺乳动物干细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物淋巴细胞。

22.一种粉末制剂，其用于制备权利要求1～12中任一项所述的哺乳动物细胞保存用液，该粉末制剂包含阿卡伯糖或其盐、和/或水苏糖或其盐。