CN112730382A - 一种牛骨胶原蛋白多肽的快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，包括以下步骤：（A）制备Sers技术中AgNPS溶胶；（B）不同分子量胶原蛋白肽指纹图谱的获取与分析；（C）利用步骤（B）中获得的不同分子量胶原蛋白多肽指纹图谱数据库，可同时结合化学计量学方法，实现不同胶原蛋白多肽的快速鉴别。本发明利用牛骨胶原蛋白肽的光谱数据库不仅可以解析拉曼光谱，实现不同胶原蛋白肽的识别，也可分析蛋白的二级结构变化，同时利用大量的拉曼光谱结合化学计量学方法实现不同分子量胶原蛋白多肽的快速识别，可大大缩短不同酶解条件下胶原蛋白肽的识别时间，提高生产效率。

Description

一种牛骨胶原蛋白多肽的快速鉴定方法

技术领域

本发明属于胶原蛋白多肽技术领域，尤其涉及一种牛骨胶原蛋白多肽的快速鉴定方法。

背景技术

随着我国肉牛养殖的集约化和肉类加工业的发展，肉牛屠宰加工副产物也随之增加，尤其是牛骨，据国家***统计2018年肉类总产量约8517万吨，约占世界总产量的1/4，其所产的鲜骨可达2500万吨，“骨头不当肉”，是人类传统的消费观念，我国有许多屠宰业废弃物如骨头可以转化成饲料或食品添加剂等资源，但由于开发力度不够，一般经过简单加工为骨泥后销往肉制品企业作为填充料，或直接销往市场，经济效益差，资源没有得到充分的利用。

畜禽骨骼中富含脂质、蛋白质骨胶原、软骨素和矿物元素等营养成分，可作为一种优质的蛋白质资源和脂质来源，对其开展深度综合利用和高值高效转化对保护环境和资源的可循环利用具有重要的实际意义，尤其是牛骨中含有丰富的胶原蛋白，而胶原蛋白是一种生物性高分子，是维持正常组织构造和性能的必要成分，具有良好的生物化学和生物相容性。将牛骨胶原蛋白经分段酶解，可获得不同分子量小分子蛋白多肽，与胶原蛋白相比食用后利用率更高，易被人体吸收，其功能有很大差别，如，分子量小于10kD的组分对大肠杆菌的抑菌活性很强、小于3kDa的具有较高的自由基清除率、小于1kDa的对人体不用消化可直接吸收，对人体代谢有很大的帮助等。这不仅使得畜禽骨得到高附加值利用，且可带来良好经济效益同时避免了环境污染，实现绿色可持续发展。

经查阅，目前公开的中国发明专利“一种牛骨胶原多肽的生产方法”(CN201910225458.X)、“一种牛骨胶原蛋白肽及制备方法和用途”(CN201811144957.8)以及中国发明专利CN201710823158.2公开了牛骨胶原蛋白肽提取方法等专利主要是针对牛骨胶原蛋白的制备方法，但牛骨胶原蛋白肽提取率不够，小分子活性多肽不足，且传统鉴定胶原蛋白多肽的方式多采用液相色谱，操作繁琐，费时费力，而且成本较高，检测结果往往延迟。激光共聚焦拉曼光谱技术具有物质成分鉴定和分子结构分析方面不可替代的作用。与传统分析检测方法相比，具有快速、精确、无损以及微观分析等特点。同时构建其相应的指纹图谱库，是扩大其应用功能必不可少的步骤。因此，利用激光共聚焦拉曼光谱技术开发一种快速、无损的牛骨胶原蛋白多肽的快速鉴定方法并构建指纹图谱数据库，实现牛骨中不同胶原蛋白多肽快速鉴定，不仅能够提高牛骨的附加值，实现较大经济收入，而且实现废物利用，绿色可持续发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单便捷、快速高效的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，包括以下步骤：

(A)制备Sers技术中AgNPS溶胶；

(B)不同分子量胶原蛋白肽指纹图谱的获取与分析：不同分子量胶原蛋白多肽溶液分别与步骤(A)中AgNPS溶胶震荡混匀，然后取少量混合液通过拉曼光谱仪进行SERS测量，获得不同分子量胶原蛋白多肽的指纹图谱；

(C)利用步骤(B)中获得的不同分子量胶原蛋白多肽指纹图谱，可同时结合化学计量学方法，将获得的不同分子量的胶原蛋白多肽的激光共聚焦拉曼光谱进行预处理并构建快速定性识别模型，将数据带入模型经迭代驯化，获得鲁棒性更高的预测模型，然后可扫描不同酶解条件下的胶原蛋白多肽混合物，实现不同胶原蛋白多肽的快速鉴别，同时依据原有拉曼数据库已知的以及未知的胶原蛋白多肽拉曼光谱信息进行信息融合，构建胶原蛋白多肽指纹拉曼数据库。

进一步地，所述步骤(B)中不同分子量胶原蛋白多肽溶液，由以下方法制备得到：

(1)将新鲜牛骨粉碎、清洗，加入纯净水，通过高效热压抽提进行骨素的提取，静置后三相分离，去除骨油和中间混合层，经管式离心机后浓缩获得牛骨素；

(2)将EDTA溶液加入步骤(1)中的牛骨素，脱除牛骨素中钙离子，获得胶原蛋白多肽第一粗产品；

(3)将NaCl溶液加入步骤(2)中的胶原蛋白多肽第一粗产品，通过盐析法进一步提纯，低温离心分离，获得胶原蛋白多肽第二粗产品；

(4)将乙酸溶液加入步骤(3)中的胶原蛋白多肽第二粗产品进行溶解，而后进行分段透析，先用乙酸溶液透析、再用蒸馏水透析，获得胶原蛋白多肽第三粗产品；

(5)选择多梯度酶解对步骤(4)中的胶原蛋白多肽第三粗产品进行酶解，得到胶原蛋白多肽原液。

(6)将步骤(5)中的胶原蛋白多肽原液通过不同分子量半透膜反复透析提纯，获得不同分子量胶原蛋白多肽溶液。

进一步地，所述步骤(5)中多梯度酶解的方法包括：蛋白酶解过程中为避免过多的盐类添加，常以pH的变化趋势来制定双酶分步酶解工艺，即碱性—中性—酸性，通过将蛋白酶的分步加入可使不同蛋白酶的酶活分别达到最高值，且不引起不同蛋白酶互为底物的影响。本发明首先添加碱性蛋白酶，pH值9.0，酶解温度50℃，酶解2h，然后调节酶解液pH值8.0，再添加胰蛋白酶和复合风味蛋白酶，酶解温度40℃，酶解2h；最后90℃，20min灭酶处理。

进一步地，所述步骤(A)中AgNPS溶胶的制备包括：将硝酸银加入去离子水中，加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入柠檬酸钠水溶液，保持沸腾状态反应30min，自然冷却至室温，得到AgNPS溶胶。

进一步地，所述的位置的胶原蛋白多肽的鉴别步骤是：使用高效液相联合高分辨率质谱分析电喷雾得到多电荷信号，然后对信号进行去卷积分析，获得精确分子量数值，可将未知的不同分子量胶原蛋白多肽进行测定，并将其输入已构建的拉曼光谱指纹图谱数据库。

进一步地，所述步骤(B)中胶原蛋白多肽指纹图谱库是依据Visual Foxpro 9.0***构建的胶原蛋白多肽光谱数据库，实现不同酶解条件下不同分子量胶原蛋白肽的快速识别，具体构建过程主要包括:(a)不同分子量多肽指纹图谱子模块和(b)智能查询***，具体的查询***包括中英文名称、化学式或者特征峰位置或强度查询多肽，***支持智能模糊搜索功能，即可快速识别不同分子量胶原蛋白多肽。

进一步地，所述不同分子量多肽指纹图谱子模块的胶原蛋白多肽分子量分布为：

分子量范围	分子量占比
		<1kDa	25％～44％
1kDa-1.5kDa	15～40％
		1.5kDa-2.5kDa	6％～10％
2.5kDa～3kDa	2％～5％
		>3kDa	0.5％～1％

进一步地，所述数据库智能查询***主要包括中英文名称/化学式、特征峰等多种方式进行查询，并且支持模糊查询，依据智能峰强度、位置以及峰半高宽等指标进行自动多次比对，从高到低给出得分序列，给出逼近真实结果。

本发明具有的优点是：

(1)本发明采用的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，表面增强拉曼Sers技术可将不同分子量的小肽的拉曼信号放大约10⁴～10¹³倍，并利用激光共聚焦显微拉曼可在微观下获得不同肽的图像信息和拉曼光谱信息，利用牛骨胶原蛋白肽的光谱数据库不仅可以解析拉曼光谱，实现不同胶原蛋白肽的识别，也可分析蛋白的二级结构变化，同时利用大量的拉曼光谱结合化学计量学方法实现不同分子量胶原蛋白多肽的快速识别，可大大缩短不同酶解条件下胶原蛋白肽的识别时间，提高生产效率。

(2)本发明提供的不同分子量胶原蛋白多肽溶液的制备方法，牛骨处理使用高效热压抽提和物理浓缩的方式，安全污染；在酶解过程中经过多次优化酶的种类和添加量，尤其是多梯度酶解，使得每一种酶都在最优条件下进行反应，而且不同酶反应后的底物基础上进行下一个酶反应的，不仅提高了酶解效率且获得了更为丰富的小肽产物。

附图说明

图1为基于Sers技术的不同分子量胶原蛋白多肽的拉曼光谱示意图；

图2为本发明实施例中牛骨胶原蛋白不同分子量的二级结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，另外，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明公开了一种牛骨胶原蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：新鲜牛骨粉碎—清洗—热压抽提—脱脂—脱钙—酸溶提取—分离纯化—酶解—超滤分离—牛骨胶原蛋白多肽。

(1)取一定量的新鲜牛骨，粉碎、罐内清洗去除血水，按照1:1加入纯净水，通过135℃，0.3Mpa高压抽提技术进行牛骨素的提取，静置后将牛骨油、混合物以及下层骨汤等三相分离，去除骨油和中间混合层，经管式离心机后浓缩获得牛骨素。

(2)以步骤(1)中热压抽提的牛骨素为底物，加入0.5mol/L EDTA作为脱钙剂，脱除骨素中的钙离子，获得较为纯净的胶原蛋白多肽第一粗产品；

(3)将0.9mol/LNaCl溶液加入步骤(2)中的胶原蛋白多肽第一粗产品，通过盐析法进一步提纯，经4℃，10000rmp离心30min，获得胶原蛋白多肽第二粗产品；

(4)将0.5mol/L乙酸溶液加入步骤(3)中的胶原蛋白多肽第二粗产品进行溶解，而后进行分段透析，先用0.2mol/L乙酸溶液透析、再用蒸馏水反复透析2d，获得胶原蛋白多肽第三粗产品；

(5)选择多梯度酶解对步骤(4)中的胶原蛋白多肽第三粗产品进行酶解，即首先添加3％碱性蛋白酶，pH值9.0，酶解温度50℃，酶解2h，然后调节酶解液pH值8.0，再2％添加胰蛋白酶和3％复合风味蛋白酶，酶解温度40℃，酶解2h；最后90℃，20min灭酶处理，得到胶原蛋白多肽原液。

表1牛骨胶原蛋白多肽的多肽分子量分布

分子量范围	分子量占比
		<1kDa	25％～44％
1kDa-1.5kDa	15～40％
		1.5kDa-2.5kDa	6％～10％
2.5kDa～3kDa	2％～5％
		>3kDa	0.5％～1％

配置不同分子量胶原蛋白多肽的溶液：上述胶原蛋白多肽原液通过不同分子量<1kDa、1～1.5kDa、2kDa，2～3kDa以及>3kDa半透膜反复透析提纯，可获得不同分子量胶原蛋白多肽的溶液A、B、C、D……，结果如图1所示，不同胶原蛋白多肽的拉曼光谱示意图，不同分子量多肽出峰位置、峰强度都有明显差异。基于Sers技术和激光共聚焦拉曼光谱技术的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，包括以下步骤：

(A)制备Sers技术中AgNPS溶胶；具体方法为：将17mg的硝酸银加入100mL去离子水中，加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入26mL质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液，保持沸腾状态反应30min，自然冷却至室温，溶液呈黄绿色。

(B)不同分子量胶原蛋白肽指纹图谱的获取与分析，图2是胶原蛋白在酶解过程中蛋白水解成多肽时二级结构的变化示意图，具体图谱采集步骤为：将不同分子量胶原蛋白多肽溶液A、B、C、D……分别与步骤(A)中AgNPS溶胶震荡混匀，然后取10μL混合液滴在玻璃载玻片上，用氮气吹干后，通过拉曼光谱仪进行SERS测量，获得不同分子量胶原蛋白多肽的指纹图谱，依据Visual Foxpro 9.0***构建的胶原蛋白多肽光谱数据库，实现不同酶解条件下不同分子量胶原蛋白肽的快速识别，通过中英文名称、化学式或者特征峰位置或强度可快速识别不同分子量胶原蛋白多肽。

其中拉曼光谱仪使用前首先使用硅片(Si)在520.7cm^-1处的拉曼峰作为基准峰对仪器进行校正。表面增强拉曼光谱采集时激发光源使用532nm氦氖(He-Ne)激光，激光强度为25mW，物镜使用50倍，积分时间设置为30s，积分次数3次。拉曼光谱扫描范围设置为400-2000cm^-1，分辨率设置为1cm^-1，循环3次。

(C)利用步骤(B)中获得的不同分子量胶原蛋白多肽指纹图谱数据库，可同时结合化学计量学方法(K-最邻近法、支持向量机以及BP神经网络等)，将获得的不同分子量的胶原蛋白多肽的拉曼光谱进行预处理并构建快速定性识别模型，将数据带入模型经迭代驯化，获得鲁棒性更高的预测模型，然后可扫描不同酶解条件下的胶原蛋白多肽混合物，实现不同胶原蛋白多肽的快速鉴别。

Claims (7)

1.一种牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)制备Sers技术中AgNPS溶胶；

(B)不同分子量胶原蛋白肽指纹图谱的获取与分析：不同分子量胶原蛋白多肽溶液分别与步骤(A)中AgNPS溶胶震荡混匀，然后取少量混合液通过拉曼光谱仪进行SERS测量，获得不同分子量胶原蛋白多肽的指纹图谱；

(C)利用步骤(B)中获得的不同分子量胶原蛋白多肽指纹图谱，可同时结合化学计量学方法，将获得的不同分子量的胶原蛋白多肽的激光共聚焦拉曼光谱进行预处理并构建快速定性识别模型，将数据带入模型经迭代驯化，获得鲁棒性更高的预测模型，然后可扫描不同酶解条件下的胶原蛋白多肽混合物，实现不同胶原蛋白多肽的快速鉴别。

2.根据权利要求1所述的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤(B)中不同分子量胶原蛋白多肽的指纹图谱可依据原有拉曼数据库的胶原蛋白多肽拉曼光谱信息进行信息融合，构建胶原蛋白多肽指纹拉曼数据库。

3.根据权利要求1所述的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤(B)中不同分子量胶原蛋白多肽溶液，由以下方法制备得到：

(1)将新鲜牛骨粉碎、清洗，加入纯净水，通过高效热压抽提进行骨素的提取，静置后三相分离，去除骨油和中间混合层，经管式离心机后浓缩获得牛骨素；

(2)将EDTA溶液加入步骤(1)中的牛骨素，脱除牛骨素中钙离子，获得胶原蛋白多肽第一粗产品；

(3)将NaCl溶液加入步骤(2)中的胶原蛋白多肽第一粗产品，通过盐析法进一步提纯，低温离心分离，获得胶原蛋白多肽第二粗产品；

(4)将乙酸溶液加入步骤(3)中的胶原蛋白多肽第二粗产品进行溶解，而后进行分段透析，先用乙酸溶液透析、再用蒸馏水透析，获得胶原蛋白多肽第三粗产品；

(5)选择多梯度酶解对步骤(4)中的胶原蛋白多肽第三粗产品进行酶解，得到胶原蛋白多肽原液。

(6)将步骤(5)中的胶原蛋白多肽原液通过不同分子量半透膜反复透析提纯，获得不同分子量胶原蛋白多肽溶液。

4.根据权利要求2所述的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤(5)中多梯度酶解的方法包括：首先添加碱性蛋白酶，pH值9.0，酶解温度50℃，酶解2h，然后调节酶解液pH值8.0，再添加胰蛋白酶和复合风味蛋白酶，酶解温度40℃，酶解2h；最后90℃，20min灭酶处理。

5.根据权利要求1所述的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤(A)中AgNPS溶胶的制备包括：将硝酸银加入去离子水中，加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入柠檬酸钠水溶液，保持沸腾状态反应30min，自然冷却至室温，得到AgNPS溶胶。

6.根据权利要求2所述的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，其特征在于，所述胶原蛋白多肽指纹图谱库是依据Visual Foxpro 9.0***构建的胶原蛋白多肽光谱数据库，具体构建过程包括:(a)不同分子量多肽指纹图谱子模块和(b)智能查询***，所述智能查询***包括中英文名称、化学式或者特征峰位置或强度查询多肽，***支持智能模糊搜索功能，即可快速识别不同分子量胶原蛋白多肽。

7.根据权利要求1-6任一项所述的牛骨胶原蛋白多肽快速鉴定方法，其特征在于，所述胶原蛋白多肽的多肽分子量分布为：

分子量范围 分子量占比 <1kDa 25％～44％ 1kDa-1.5kDa 15～40％ 1.5kDa-2.5kDa 6％～10％ 2.5kDa～3kDa 2％～5％ >3kDa 0.5％～1％

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