CN112730352A - 实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，包括步骤一，转基因材料获得；步骤二，成像观察；步骤三，分析处理；步骤四，计算参数信息；其中在上述步骤一中，首先通过PCR技术扩增出目的基因条带，然后通过同源重组的方法将目的基因连接到真核表达载体pCM2300中；ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜的Airyscan模式下成像具有超高分辨率，可以对植物细胞核内蛋白质的结构进行超高分辨率的成像观察；对细胞的光毒性伤害小，能够在活体状态下、原位观察细胞核蛋白的面积和分布等特征；成像速度快，能够真实地反映植物细胞核内蛋白分子的状态，并在单分子水平上对细胞核蛋白的面积异质性进行分析；重复性高。

Description

实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积 和空间分布的方法。
背景技术
细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，也是遗传信息的储存、复 制和转录的主要场所，在真核细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用。以往 对植物细胞核蛋白的研究，主要是利用遗传和生化等体外分析方法进行研究， 然而这种方法不能真实地反应活体细胞核内分子的结构和分布等特征，因此也 无法在超高时空分辨率的条件下揭示蛋白的异质性信息，进而妨碍了对其功能 机制的深入理解；
采用一种快速超分辨激光共聚焦显微镜ZeissLSM880Airyscan可以在植物 活体样品中对细胞核蛋白进行成像和分析，并且可以通过亚像素的分辨率追踪 单个分子的荧光面积，从而获得荧光粒子分布的信息，其精度可以达到纳米级， 远远超过常规光学显微镜的分辨率，已有研究报道，可利用超分辨技术观察动 物细胞核内单个蛋白质的结构特征，但尚未将该超高分辨率技术扩展到观察植 物细胞核内单个蛋白质的结构和分布特征，原因在于植物细胞存在细胞壁厚、 叶绿体的自发荧光强、以及本身生长形式的限制从而观察困难等问题；针对这 些缺陷，设计实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法是很有 必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布 的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：实时观察植物细胞核 蛋白的结构、面积和空间分布的方法，包括步骤一，转基因材料获得；步骤二， 成像观察；步骤三，分析处理；步骤四，计算参数信息；
其中在上述步骤一中，转基因材料获得包括以下步骤：
1)首先通过PCR技术扩增出目的基因条带，然后通过同源重组的方法 将目的基因连接到真核表达载体pCM2300中；
2)最后通过农杆菌转化的方法侵染到拟南芥植株，并通过抗性筛选得 到转基因植株；
其中在上述步骤二中，成像观察包括以下步骤：
1)用ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜，选取合适 波长的激发光对所得转基因植物样品进行观察；
2)并调整相应的激光强度，对细胞核内的荧光蛋白进行成像观察，观 察结果记录并备份；
其中在上述步骤三中，超分辨激光共聚焦显微镜获取的图像借助 ImageJ1.48和OriginPro8软件进行细胞核内蛋白结构细节和荧光强度的分析；
其中在上述步骤四中，根据超分辨激光共聚焦显微镜所成像的图片信息， 观察荧光分子分布在植物细胞核内的具***置信息，并进一步计算出荧光分子 所占的面积大小，进而得到面积分布等参数信息。
根据上述技术方案，所述步骤一2)中获得转基因材料为在植物细胞核中 大量表达，并具有重要功能的绿色荧光蛋白GFP。
根据上述技术方案，所述步骤二1)中GFP标记的蛋白激发波长分别为 488nm，收集波长为525nm，设定激光强度为80％，EMGain电子增益为800倍， 利用Airyscan模式对样品进行连续超分辨成像。
根据上述技术方案，所述步骤三中所得到的图像选取合适的阈值运用小波 变换算法处理进行背景去除，荧光点的位置可以通过计算其周围3*3个像素的 局部极大值得到亚像素精确值，计算出荧光点的权重重心weighted-centroid 而确定。
根据上述技术方案，所述步骤四中通过连续追踪荧光信号，发现MED18-GFP 在细胞核内呈现高度异质性分布，一些荧光点在细胞核内呈现点状的分布，另 一些荧光点则具有较大的面积呈现团簇状的分布，出现大于2帧的荧光点用作 为细胞核内荧光蛋白进行分析。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
1.ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜的Airyscan模 式下成像具有超高分辨率，在XY轴上可以实现120nm的分辨率，可以对植 物细胞核内蛋白质的结构进行超高分辨率的成像观察；
2.对细胞的光毒性伤害小，能够在活体状态下、原位观察细胞核蛋白 的面积和分布等特征；
3.ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜的成像速度快， 能够真实地反映植物细胞核内蛋白分子的状态，并在单分子水平上对细胞
核蛋白的面积异质性进行分析；
4.重复性高。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发 明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的方法流程图；
图2是本发明的MED18-GFP分子的普通共聚焦荧光图像；
图3是本发明的通过ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜 成像的超分辨率图像；
图4-5是本发明的分别是图2和图3中虚框区域1和2进行放大得到的图 像；
图6是本发明的用ImageJ分析图2中确定的MED18-GFP分子的空间分布， 颜色大小表示分子所占的面积大小；
图7是本发明的MED18-GFP分子的面积分布。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-7，本发明提供一种技术方案：
实施例1：
实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，包括步骤一， 转基因材料获得；步骤二，成像观察；步骤三，分析处理；步骤四，计算参数 信息；
其中在上述步骤一中，转基因材料获得包括以下步骤：
1)首先通过PCR技术扩增出目的基因条带，然后通过同源重组的方法 将目的基因连接到真核表达载体pCM2300中；
2)最后通过农杆菌转化的方法侵染到拟南芥植株，并通过抗性筛选得 到转基因植株，获得转基因材料为在植物细胞核中大量表达，并具有重要 功能的绿色荧光蛋白GFP；
其中在上述步骤二中，成像观察包括以下步骤：
1)用ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜，选取合适 波长的激发光对所得转基因植物样品进行观察，GFP标记的蛋白激发波长 分别为488nm，收集波长为525nm，设定激光强度为80％，EMGain电子增益 为800倍，利用Airyscan模式对样品进行连续超分辨成像；
2)并调整相应的激光强度，对细胞核内的荧光蛋白进行成像观察，观 察结果记录并备份；
其中在上述步骤三中，超分辨激光共聚焦显微镜获取的图像借助 ImageJ1.48和OriginPro8软件进行细胞核内蛋白结构细节和荧光强度的分析， 所得到的图像选取合适的阈值运用小波变换算法处理进行背景去除，荧光点的 位置可以通过计算其周围3*3个像素的局部极大值得到亚像素精确值，计算出 荧光点的权重重心weighted-centroid而确定；
其中在上述步骤四中，根据超分辨激光共聚焦显微镜所成像的图片信息， 观察荧光分子分布在植物细胞核内的具***置信息，并进一步计算出荧光分子 所占的面积大小，进而得到面积分布等参数信息，通过连续追踪荧光信号，发 现MED18-GFP在细胞核内呈现高度异质性分布，一些荧光点在细胞核内呈现点 状的分布，另一些荧光点则具有较大的面积呈现团簇状的分布，出现大于2帧 的荧光点用作为细胞核内荧光蛋白进行分析；
实施例2：
实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，包括步骤一， 转基因材料获得；步骤二，成像观察；步骤三，分析处理；步骤四，计算参数 信息；
其中在上述步骤一中，转基因材料获得包括以下步骤：
1)将具有MED18-GFP标记的拟南芥种子置于滤纸上，把消毒水85％乙 醇：30％H2O2＝3：1洒到拟南芥种子上，待种子干后，用无菌牙签将消过毒 的种子播种于含0.1％蔗糖、pH为5.8的1/2MS固体培养基上，点有种子的 平板置于4℃冰箱中进行24-48h春化处理，置于培养箱中进行培养，培养 条件为22℃，16h/8h光暗循环，取生长4-5d的幼苗进行共聚焦显微成像 观察；
2)植物拟南芥样品的制片过程：首先，把整个植物幼苗置于载玻片上， 使叶片近轴面朝上，并将拟南芥根部铺平摆放，滴加约30μL的1/2MS液 体培养基，轻轻盖上盖玻片，需要使用0.17mm左右厚度的盖玻片；
其中在上述步骤二中，用ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦 显微镜对上述拟南芥幼苗样品进行观测，其中物镜需要使用63倍油镜，并采 用488nm激光激发植物样品，收集波长为525nm，仪器参数设置：在共聚焦 模式下设定激光强度为60％，Gain电子增益为600倍；而在Airyscan模式下 设定激光强度为80％，Gain电子增益为800倍，最后，对同一视野下的拟南 芥幼苗下细胞核进行连续拍摄，获得不同模式下的图像，图2为MED18-GFP 分子的普通共聚焦荧光图像，图3为通过ZeissLSM880Airyscan快速超分辨 激光共聚焦显微镜成像的超分辨率图像；
其中在上述步骤三中，分析处理包括以下步骤：
1)利用ImageJ软件对图像进行背景去除分析，首先，启动ImageJ软 件，在ImageJ软件中打开上述所得绿色通道图像File->Open…->选择图 片->打开，运行Image->Adjust->Brightness/Contrast，调整图像的亮度 和对比度，然后将图片另存为TIFF格式File->SaveAs->Tiff…；
2)利用ImageJ软件对超分辨图像进行后期分析，将上述保存的图片 再次导入到ImageJ软件中，设置图片类型，选择Image->Type->32-bit， 选择Image->LookupTables->Fire，再选择Image->Adjust->Size，将其选 择扩大10倍，选择Plugins->MeanShift-设置Color Distance为25.0， 接着选择Process->SubtractBackground-设置Rolling BallRadius为 20Pixels，并勾选Preview，然后将图片再次另存为TIFF格式File->SaveAs->Tiff…；
3)利用ImageJ软件对处理后的超分辨图像进行后期数据分析，首先， 选择Image->Adjust->Threshod-，对图像上荧光粒子的大小进行适当的调 整，接着选择Analyze->AnalyzeParticles-设置Show为OverlayMasks类 型，即可获得标记好的荧光粒子的图片，再次保存图片，并导出数据；
其中在上述步骤四中，将导出的面积数据在OriginPro8软件中进行分析， 右击之后选择Frequency count，间隔设置为500，然后选择FreqsY列的数据 对其进行分析，得到面积分布的柱形图。
基于上述，本发明的优点在于，ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共 聚焦显微镜的Airyscan模式下成像具有超高分辨率，在XY轴上可以实现120nm 的分辨率，可以对植物细胞核内蛋白质的结构进行超高分辨率的成像观察；对 细胞的光毒性伤害小，能够在活体状态下、原位观察细胞核蛋白的面积和分布 等特征；ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜的成像速度快， 能够真实地反映植物细胞核内蛋白分子的状态，并在单分子水平上对细胞核蛋 白的面积异质性进行分析；重复性高。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将 一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些 实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包 含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素 的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的 其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制 本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术 人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其 中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，包括步骤一，转基因材料获得；步骤二，成像观察；步骤三，分析处理；步骤四，计算参数信息；其特征在于：
其中在上述步骤一中，转基因材料获得包括以下步骤：
1)首先通过PCR技术扩增出目的基因条带，然后通过同源重组的方法将目的基因连接到真核表达载体pCM2300中；
2)最后通过农杆菌转化的方法侵染到拟南芥植株，并通过抗性筛选得到转基因植株；
其中在上述步骤二中，成像观察包括以下步骤：
1)用ZeissLSM880Airyscan快速超分辨激光共聚焦显微镜，选取合适波长的激发光对所得转基因植物样品进行观察；
2)并调整相应的激光强度，对细胞核内的荧光蛋白进行成像观察，观察结果记录并备份；
其中在上述步骤三中，超分辨激光共聚焦显微镜获取的图像借助ImageJ1.48和OriginPro8软件进行细胞核内蛋白结构细节和荧光强度的分析；
其中在上述步骤四中，根据超分辨激光共聚焦显微镜所成像的图片信息，观察荧光分子分布在植物细胞核内的具***置信息，并进一步计算出荧光分子所占的面积大小，进而得到面积分布等参数信息。
2.根据权利要求1所述的实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，其特征在于：所述步骤一2)中获得转基因材料为在植物细胞核中大量表达，并具有重要功能的绿色荧光蛋白GFP。
3.根据权利要求1所述的实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，其特征在于：所述步骤二1)中GFP标记的蛋白激发波长分别为488nm，收集波长为525nm，设定激光强度为80％，EMGain电子增益为800倍，利用Airyscan模式对样品进行连续超分辨成像。
4.根据权利要求1所述的实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，其特征在于：所述步骤三中所得到的图像选取合适的阈值运用小波变换算法处理进行背景去除，荧光点的位置可以通过计算其周围3*3个像素的局部极大值得到亚像素精确值，计算出荧光点的权重重心weighted-centroid而确定。
5.根据权利要求1所述的实时观察植物细胞核蛋白的结构、面积和空间分布的方法，其特征在于：所述步骤四中通过连续追踪荧光信号，发现MED18-GFP在细胞核内呈现高度异质性分布，一些荧光点在细胞核内呈现点状的分布，另一些荧光点则具有较大的面积呈现团簇状的分布，出现大于2帧的荧光点用作为细胞核内荧光蛋白进行分析。
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