CN112725299B - 改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用。所述的突变***于Taq DNA聚合酶的肽链C端由424‑832个氨基酸构成第二个结构域，所述的第二结构域表达5’‑3’DNA聚合酶活性；所述突变体在SEQ ID No.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸类型：S623N、R704S、A705L。本发明的突变体具有较好的耐受性。

Description

改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶作为DNA生命的最基本的酶促反应，随着生命的进化而进化。所有的DNA聚合酶家族都有一个共同的双二价离子催化中心，诸如Mg2+存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。由此发展起来的核酸分子检测技术已日益成为各种生物检测的关键技术，广泛应用于药物开发、食品安全性检测、病原微生物鉴定、疾病机理和药物靶向治疗等理论研究与检验之中。
Taq DNA聚合酶是一种耐高温的DNA聚合酶，属于DNA聚合酶I类，酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，分子量为94kD，全酶共分为三个结构域，分别是：Taq DNA聚合酶蛋白多肽链N端1-291个氨基酸构成第一个结构域，该结构域表达5’-3’核酸外切酶活性；肽链C端424-832个氨基酸构成第二个结构域，该结构域表达5’-3’聚合酶活性；位于肽链中间的292-423个氨基酸构成第三个结构域，该区域与Taq DNA聚合酶的三维空间结构相关。TaqDNA聚合酶是一种热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键原料。然而常规的Taq DNA聚合酶受扩增模板中的抑制剂的限制，比如，土壤中的腐殖酸、血液中的血红素、血浆血清中的抗凝剂、动植物组织中的蛋白质等，这些限制使得PCR技术不能够更加有效而广泛的应用到更多领域。传统的方法必须先从这些待测样本分离提取核酸，然后用于PCR扩增。然而，基因组DNA的制备步骤通常是非常繁琐的，不但耗时费力、容易造成样品间的交叉污染，而且在一些情况下并不能将PCR反应抑制剂完全去除，从而影响了后续PCR鉴定结果的准确性和可靠性。另外，对于珍贵的痕量样品而言，比如血滴、血斑、指纹、毛发等，是不适合进行基因组提取。
近二十年来，Taq DNA聚合酶作为最先被发现的可用于PCR反应的DNA聚合酶，已经进行了非常密集的改造，并且有很多生物化学和结构数据可供使用。一些突变位点对于酶的保真度很关键(如美国专利US6395524)，也有报告某些突变位点的Taq DNA聚合酶对不同PCR抑制剂具有抗性(Kermekchiev MB,Nucleic Acids Research,2003,31:6139-6147)。中国专利CN104845950B公开了一种对血液中抑制剂具有增加抗性的热稳定性A型DNA聚合酶突变体，解决了血液直接扩增中EDTA和肝素抗凝血出现抑制的问题。但是现在还缺少一种对于更为复杂的样本可以直接扩增的DNA聚合酶及其应用的解决方案。
综上，传统的DNA聚合酶活性低、耐受性低，急需一种能用于耐受性提高的突变体Taq DNA聚合酶提高现有PCR检测或临床诊断的便利性。因此，在本领域对某些氨基酸位点进行突变改造以产生改良的聚合酶活性，包括例如改良的耐受性或扩增能力。本发明，如同本文中所述，满足这些及其它需要。
发明内容
本发明针对上述现有技术中的不足，提供一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用，本发明的突变体具有较好的耐受性。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明第一方面的实施例提供了一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体，所述的突变***于Taq DNA聚合酶的肽链C端由424-832个氨基酸构成第二个结构域，所述的第二结构域表达5’-3’DNA聚合酶活性；所述突变体在SEQ ID No.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸类型：S623N、R704S、A705L。
进一步的，所述突变体是S623N和A705L的组合突变；或所述突变体是S623N和R704S的组合突变；或所述突变体是S623N、R704S、A705L的组合突变。
进一步的，所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示序列具有至少70％同一性的具有Taq DNA聚合酶活性的氨基酸序列。
本发明第二方面的实施例提供了一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，包括如下步骤：
以Taq DNA聚合酶的基因表达序列为扩增模板，并加入点突变引物进行点突变PCR扩增，得到目的基因表达序列；其中，所述目的基因表达序列所编码得到的蛋白质与所述野生型Taq DNA聚合酶相比，具有S623N、R704S、A705L突变；将所述目的基因表达序列转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体。
进一步的，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为：所述反向引物的序列为：
进一步的，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列为：反向引物序列为：/>
本发明第三方面的实施例提供了一种利用改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体制备的直扩扩增试剂盒，包括如下组分：改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体、反应液、PCR增强剂以及dNTP；
所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体为上述的突变体；或由上述的制备方法制得的突变体；
所述反应液为：10-50mmol/L Tris-HCI、1-5mmol/L MgC12、0.1-1％Brij-58、40-200mmol/L(NH4)2SO4,pH 7.5-9.5；
所述的PCR增强剂为甘油、DMSO和甜菜碱中的至少一种。
本发明提供一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及其直接扩增的应用，具有以下优点：
1)本发明通过点突变PCR的方法改变Taq DNA聚合酶的氨基酸序列和Taq DNA聚合酶的构象，提高了Taq DNA聚合酶的耐受能力，使得经过点突变的Taq DNA聚合酶可以更好地应用于血液样本、植物样本等复杂样本的直接PCR扩增和检测。
2)本发明提供的突变体Taq DNA聚合酶的活性配合经改善的反应液以及PCR增强剂、使得该突变体Taq DNA聚合酶在耐受性、对于痕量样本的扩增能力等均有明显的提高。
附图说明
图1是本发明实施例2用突变的Taq DNA聚合酶对不同类型的抗凝血进行PCR扩增后产物的电泳图。
在实施例2中，用突变的Taq DNA聚合酶对不同类型及不同浓度的抗凝血进行PCR扩增后产物的电泳图。M为DNA Marker，1、2、3、4为不同浓度的Na-EDTA抗凝血；5、6、7、8不同浓度的K-EDTA抗凝血；9、10、11、12不同浓度的Na-Heparin抗凝血；其中1、5、9为5％全血，2、6、10为10％全血，3、7、10为20％全血，4、8、12为30％全血。
图2是本发明实施例3分别用突变的Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶进行玉米以及大豆叶片PCR扩增的产物电泳图。
在实施例3中，分别用突变的Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶进行玉米以及大豆叶片PCR扩增的产物电泳图。其中M为DNA Marker，1、2、3、4、5为玉米叶片；6、7、8为大豆叶片。
图3是本发明实施例4用突变的Taq DNA聚合酶直接对番茄及棉花叶片进行PCR扩增后产物的电泳图。
在实施例4中，用突变的Taq DNA聚合酶直接对番茄及棉花叶片进行PCR扩增后产物的电泳图。其中M为DNA Marker，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12为番茄叶片；13、14、15、16为棉花叶片。
图4是本发明实施例5用突变的Taq DNA聚合酶直接土壤微生物16S rRNA进行PCR扩增后产物的电泳图。
在实施例5中，用突变的Taq DNA聚合酶直接土壤微生物16S rRNA进行PCR扩增后产物的电泳图。其中M为DNA Marker，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10为10个不同环境土壤的样本。
图5是本发明实施例6用突变的Taq DNA聚合酶(Mut Taq)与NEB商品化的血液直扩试剂盒Hemo KlenTaq直接对不同浓度及不同类型的抗凝血进行PCR扩增后产物的电泳图。
在实施例6中，用突变的Taq DNA聚合酶(Mut Taq)与NEB商品化的血液直扩试剂盒Hemo KlenTaq直接对不同浓度及不同类型的抗凝血进行PCR扩增后产物的电泳图。其中M为DNA Marker，1、2、3为不同浓度的Na-EDTA抗凝血；4、5、6不同浓度的Na-Heparin抗凝血；其中1、4为10％全血，2、5为20％全血，3、6为20％为30％全血。
具体实施方式
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应当明白，这些实施方式只是以实例的方式提供的。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变更、变化和替换。应当理解，本文描述的本发明实施方式的许多备选方案可用于实践本发明。
在详细描述本教导之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这些可以变化。应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。
应当理解，在本公开中讨论的温度、质量、重量、体积比、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得轻微和非实质性的偏差在本文的教导的范围内。通常，术语“约”表示组合物的组分量的非实质性变化，其对组合物的效果或稳定性没有任何显著影响。而且，“包含”、“含有”、和“包括”的使用不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教导的限制。就通过引用并入的任何材料与本公开的表述内容不一致的程度，则以表述内容为准。
除非特别指出，否则描述为“包含”各种组分的说明书中的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；描述为“由各种组分组成”的说明书中的实施方式也被认为是“包含”或“基本上由所述组分组成”。
本发明的这个方面的突变体Taq DNA聚合酶比其野生型对应物对用肝素或EDTA处理的血液更具抗性，对于其他抑制剂也可以更具抗性。这些其他抑制剂的实例包括全血(具有或不具有抗凝剂)、全血的级分(例如使用Guthrie卡血点收集的那些)、或血液成分(如血浆、血红蛋白、血红素、免疫球蛋白G、和乳铁蛋白)；细胞裂解物(如含有抑制浓度的多肽的的细胞裂解物)；植物物质(如果胶、木聚糖、和酸性多糖类)；发现于土壤样品中的物质(如腐殖酸、黄腐酸)、和金属离子，包括重金属和重金属离子)；和某些有机溶剂。抑制剂的其他非限制性实例包括尿素、有机和酚类化合物(例如，苯酚)、糖原、脂肪、钙、纤维素、硝酸纤维素、矿物油、花粉、SDS和去污剂。各种其他的抑制剂在本领域是已知的。
定义：
“聚合酶”表示执行模板指导的多核苷酸合成的酶。DNA聚合酶可以仅向新形成的
链的3'末端添加游离核苷酸。这导致新形成的链在5'-3'方向的延伸。没有已知的DNA聚合酶能够(从头)开始新链。DNA聚合酶可以仅向预先存在的3'-OH基团添加核苷酸，且因此需要引物，它可以在所述引物处添加第一个核苷酸。引物可以包含例如RNA和/或DNA碱基以及非天然存在的碱基。新形成的链(子链)的方向性与DNA聚合酶沿着模板链移动的方向相反。聚合酶的非限制性例子包括原核DNA聚合酶(例如Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV和Pol V)、真核DNA聚合酶、端粒末端转移酶、逆转录酶和RNA聚合酶。
“突变”指示这样的蛋白质或核酸，其序列已经相对于野生型序列被改变，从而包括不同于其来源的野生型蛋白质或核酸中的对应残基或核苷酸的氨基酸残基或核苷酸。因此根据本发明的突变体包括定点突变体，其中特定的残基已经被有意地改变，包括一个或多个残基的缺失；一个或多个残基的***；一种DNA聚合酶的一个或多个残基被替换为外源序列如另一种DNA聚合酶的对应序列。在进行一个或极少数残基的替换/取代而产生突变体的情况下，鉴定“突变体所来源(自其衍生)”的DNA聚合酶是轻而易举的。
“样本”或“样品”将被理解意为任何这样的样品：可能包含目标核酸物质的样品，术语“样本”或“样品”或可包括溶液，如水溶液、细胞、组织、活检、粉末、或其中一种或多种的组合。样本可以是生物学样本，如唾液、痰、口腔拭子样品、血清、血浆、血液、血沉棕黄层、咽部、鼻部/鼻咽部或鼻窦拭子或分泌物、喉部拭子或刮出物、尿液、粘液、粪便***物、直肠拭子、呕吐物、胃液、胃肠道液、***、***、尿道拭子和分泌物、脑脊液、哺乳期或经期产物、卵黄、羊水、房水、玻璃体液、宫颈分泌物、***液、分泌物、拭子或刮出物、骨髓样本和抽取物、胸膜液和渗出液、汗液、脓、眼泪、淋巴液、支气管或肺灌洗液或抽取物、细胞培养物和细胞悬浮液、***、上皮、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉组织、胎盘组织、活检、渗出物、器官组织、神经组织、毛发、皮肤、或指甲，其中前述的样本可得自例如脊椎动物，包括哺乳动物。
“核酸”是指包含两个或更多个共价键合的核苷或具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其他键连接在一起，以形成多核苷酸。核酸包括RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“骨架”可以由多种连接组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键中的一种或多种。核酸可以包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是公知的，尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。
本发明的第一方面提供了所述突变体Taq DNA聚合酶的突变位点，所述的突变***于Taq DNA聚合酶的肽链C端由424-832个氨基酸构成第二个结构域，该结构域表达5’-3’DNA聚合酶活性。所述突变体在SEQ ID No.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸类型：S623N、R704S、A705L。
本发明通过筛选Taq DNA聚合酶的多个突变体，发现了几个有比较意义的突变位点，它们分别是：R704S(精氨酸突变成丝氨酸)、A705L(丙氨酸突变成亮氨酸)。我们发现，这几个位点至少需要突变S623N，或者更多，所得到的突变体就可以在血液、植物直扩、土壤直扩中有很好的扩增性能，具体表现为：耐受血液抑制的能力很强、耐受多糖多酚植物的能力强、需要模板量少、扩增产量高信号更强等方面。
优选的，所述突变体可以是S623N和A705L的组合突变。
在本发明的一些实施例中，所述突变体可以是S623N、R704S、A705L的组合突变。
在本发明的一种具体的实施例中，本发明所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与所示序列具有至少70％同一性的具有TaqDNA聚合酶活性的氨基酸序列；优选的具有80％同一性，更为优选的具有至少90％同一性，更为优选的具有至少95％同一性，进一步优选，具有至少99％同一性。
一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，包括如下步骤：
以Taq DNA聚合酶的基因表达序列为扩增模板，并加入点突变引物进行点突变PCR扩增，得到目的基因表达序列；其中，所述目的基因表达序列所编码得到的蛋白质与所述野生型Taq DNA聚合酶相比，具有S623N、R704S、A705L突变。将所述目的基因表达序列转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体。
在本发明的一些实施例中，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为：
(以下简称SEQ3)，
所述反向引物的序列为：
(以下简称SEQ4)。
在本发明的一些实施例中，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，正向引物序列为：
(以下简称SEQ5)，
反向引物序列为：
(以下简称SEQ6)。
本发明的第三方面提供了利用这种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体制备的直扩扩增试剂盒，包括如下组分：改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体、反应液、PCR增强剂以及dNTP。
所述反应液为：10-50mmol/L Tris-HCI、1-5mmol/L MgC12、0.1-1％Brij-58、40-200mmol/L(NH4)2SO4,pH7.5-9.5。
在本发明的一些实施例中，所述的反应液为20-40mmol/L Tris-HCI、2-4mmol/LMgC12、0.2-0.5％Brij-58、50-150mmol/L(NH4)2SO4，pH8.2-9.2。
在本发明的一些实施例中，所述的反应液为30mmol/L Tris-HCI、3mmol/L MgC12、0.25％Brij-58、65mmol/L(NH4)2SO4、pH8.5。
实施例
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：构建Taq DNA聚合酶突变体的表达载体及其表达纯化。具体过程如下：
以大肠杆菌来源的含有Taq酶基因的质粒作为模板，首先用合成的扩增引物SEQ3和SEQ4进行PCR扩增，扩增后利用Dpn I酶消化原来的母板，将PCR扩增的产物，即含有突变后的酶基因的质粒转化到感受态细胞DH5α中。挑选克隆经测序验证即可得到含突变位点S623N的质粒。再以该质粒为模板，用合成的扩增引物SEQ5和SEQ6进行PCR扩增，扩增后利用Dpn I酶消化原来的母板，将PCR扩增的产物，即含有突变后的酶基因的质粒转化到感受态细胞DH5α中。挑克隆经测序验证即可得到含突变位点S623N、R704S、A705L的质粒。
将表达载体pET28a和突变质粒同时用HindIII和SalI进行双酶切，酶切产物纯化后进行连接反应，经转化挑选克隆就可得到***突变Taq序列的表达载体质粒。将测序验证无误的载体质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含质粒对应抗性抗生素的LB平板上，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆。经液体培养基培养、诱导表达后，纯化得到改善TaqDNA聚合酶耐受性的突变体纯蛋白。所述改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体命名为MutTaq。
实施例2：全血耐受性PCR直扩
将新鲜采集的且为不同类型的抗凝血加入到PCR反应体系中，将纯化获得的MutTaq DNA聚合酶对不同类型及不同含量的抗凝血进行PCR扩增反应，示例性反应体系如下：
30mM Tris-HCI、3mM MgCl2、0.25％Brij-58、65mM(NH4)2SO4，pH8.5,0.5μMPrimer、0.2mM dNTP、0.1U/μL Mut Taq、和不同浓度及不同类型的抗凝血直接作为反应的模板。
示例性反应程序如下：
从图1可以看到Mut Taq DNA聚合酶可以对5％、10％、20％、30％的Na-EDTA抗凝血、K-EDTA及Na-Heparin很好的完成扩增。
实施例3：植物直扩耐受性测试：
本发明用常见的植物物种玉米及大豆叶片组织来测试Mut Taq的直扩能力，将纯化获得的Mut Taq DNA聚合酶对不同植物的叶片直接进行PCR扩增反应，并用野生型的Taq酶作为对照，示例性反应体系如下：
30mM Tris-HCI、2.2mM MgCl2、0.25％Brij-58、65mM(NH4)2SO4，pH8.5,0.5μMPrimer、0.2mM dNTP、0.05U/μL Mut Taq或Wt Taq、直接在反应体系中加入植物叶片作为反应的模板。
示例性反应程序如下：
从图2可以看到Mut Taq DNA聚合酶可以直接对玉米及大豆的叶片完成扩增反应，而对照野生型Taq DNA聚合酶基本不能完成扩增。
实施例4：富含多糖多酚类植物PCR直扩耐受性测试
采用多糖多酚含量高的植物物种如番茄及棉花叶片进行多糖多酚的耐受性PCR扩增测试，将纯化获得的Mut Taq DNA聚合酶对番茄及棉花含有多糖多酚的叶片直接进行PCR扩增反应，示例性反应体系如下：
30mM Tris-HCI、2.2mM MgCl2、0.25％Brij-58、65mM(NH4)2SO4，pH8.5，0.5μMPrimer、0.2mM dNTP、0.05U/μL Mut Taq，0.1M Betaine、5％DMSO、直接在反应体系中加入植物叶片作为反应的模板。
示例性反应程序如下：
从图3可以看到Mut Taq DNA聚合酶可以直接对番茄、棉花等含有多糖多酚的叶片完成扩增反应，并且在反应中加入增强剂Betaine及DMSO有助于反应的进行。
实施例5：土壤微生物直扩PCR耐受性测试
用不同环境采集到的土壤测试Mut Taq的性能，将纯化获得的Mut Taq DNA聚合酶对土壤微生物16S rRNA进行PCR扩增反应，首先将拿到的土壤加入适量无菌水(每g加入30ul无菌水)，涡旋混匀后65℃加热30min后，经离心后上清直接作为模板进行使用，示例性反应体系如下：
30mM Tris-HCI、2.2mM MgCl2、0.25％Brij-58、65mM(NH4)2SO4，pH8.5,0.5μMPrimer、0.2mM dNTP、0.05U/μL Mut Taq，0.5mg/mL BSA、土壤微生物粗提液作为模板。
示例性反应程序如下：
从图4可以看到Mut Taq DNA聚合酶可以对土壤微生物粗提液完成扩增反应。
实施例6：与市场上商品化试剂盒进行比较进行血液的直扩
为验证Mut Taq的直扩性能，将纯化获得的Mut Taq DNA聚合酶与市场上在售的商品化试剂盒Hemo KlenTaq(NEB，M0332S)进行比较，直接对不同类型及不同含量的抗凝血进行PCR扩增反应，示例性反应体系如下：
30mM Tris-HCI、2.2mM MgCl2、0.25％Brij-58、65mM(NH4)2SO4，pH8.5,0.5μMPrimer、0.2mM dNTP、0.1U/μL Mut Taq或Hemo KlenTaq、不同浓度及不同类型的抗凝血直接作为反应的模板。
示例性反应程序如下：
从图5可以看到Mut Taq DNA聚合酶比市场上在售的商品化试剂盒拥有更卓越的性能，能够耐受更高含量的血液，对较宽范围的血液含量完成扩增反应。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州白垩纪生物科技有限公司
<120> 改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用
<130> GY20100887
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
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610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
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645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
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820 825 830

Claims (5)

1.一种改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体，其特征在于，所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以Taq DNA聚合酶的基因表达序列为扩增模板，并加入点突变引物进行点突变PCR扩增，得到目的基因表达序列；其中，所述目的基因表达序列所编码得到的蛋白质与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型Taq DNA聚合酶相比，仅存在S623N、R704S、A705L突变；将所述目的基因表达序列转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体。
3.根据权利要求2所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，其特征在于，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为：5’-CTCGCCCACCTCAATGGCGATGAAAAT-3’，所述反向引物的序列为：5’-ATTTTCATCGCCATTGAGGTGGGCGAG-3’。
4.根据权利要求2所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体的制备方法，其特征在于，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列为：5’-TCTTTCCCGAAGGTTT CTCTCTGGATCGAAAAAACG-3’，反向引物序列为：5’-CGTTTTTTCGATCCAGAGAGAAACCTTCGGGAAAGA-3’。
5.一种利用改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体制备的直扩扩增试剂盒，其特征在于，包括如下组分：改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体、反应液、PCR增强剂以及dNTP；
所述的改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体为权利要求1所述的突变体；或由权利要求2-4任一项所述的制备方法制得的突变体；
所述反应液为：10-50 mmol/L Tris-HCI、1-5 mmol/L MgC12、0.1-1% Brij-58、40-200mmol/L(NH4)2SO4, pH7.5-9.5；
所述的PCR增强剂为甘油、DMSO和甜菜碱中的至少一种。
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