CN112725194A - 一株高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10及其应用，属于生物技术领域。该高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 2020961；保藏日期：2020年12月23日；保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明提供的高效降解纤维素真菌Flavodon sp.x10是在沿海地区分离得到的，在30℃下具有较强的产纤维素酶能力，所产的内切β‑葡聚糖酶、外切β‑葡聚糖酶、β‑葡萄糖苷酶活性高，为处理纤维素提供了一种高效降解的手段，具有良好的工业化应用前景。

Description

一株高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10及其在常温环境下产纤维素酶、高效分解纤维素中的应用。

背景技术

纤维素是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而组成的大分子多糖，为植物细胞壁的重要组成成分，约占植物干重的35％-50％，是自然界中含量最为丰富的碳水化合物。同时，纤维素也是一类十分重要的可再生资源，可作为能源、食品和化工产业的原料，如生产乙醇、乳酸和单细胞蛋白等。然而，由于纤维素含有大量的高能氢键，不易被降解，利用率低，绝大多数的纤维素资源被废弃或直接焚烧，造成了极严重的资源浪费和环境污染问题。因此，纤维素资源的有效开发与利用已经成为当前能源与环境研究的热点之一。

现在国家大力推行秸秆还田，将大量的秸秆粉碎直接施入土地。但是秸秆腐败分解是一个漫长的过程，在这期间滋生的微生物与下一茬作物在水分和营养物质上是竞争关系。在秸秆还田后的田地里施加合适的菌剂有利于促进秸秆分解，减少一部分化肥的使用，使农民种地获得更高的经济效益。

高效分解纤维素真菌无论是在工业生产还是在农业废物处理上都具有广阔的应用前景。纤维素作为世界上存量最大的高分子碳水化合物，如何进行处理利用是现在植物体研究利用领域的热点和难点。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一株高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10；本发明所要解决的第二技术问题在于提供高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10在常温环境下产纤维素酶、高效分解纤维素中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明从江苏东台黄海森林公园腐败落叶及土壤中分离得到一株白腐菌，具体分离方法为：采集江苏东台黄海森林公园腐败落叶及下层腐殖质土壤；将采集的腐败落叶破碎和土壤放入装有无菌水的离心管中充分震荡，取上悬浊液；将悬浊液梯度稀释，制成10^-2至10^-7浓度的溶液；将所述溶液加入至CMC钠培养基平板上进行涂布处理，并放到30℃培养箱中培养，在培养2-3天后进行刚果红染色，挑选透明圈最大的进行纯化培养，保藏，经鉴定为白腐菌Flavodon，命名为Flavodon sp.x10，其ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

Flavodon sp.x10在PDA培养基上菌落为白色，气生菌丝生长茂盛，无孢子。在CMC钠培养基上菌丝透明，生长较为茂盛，无孢子产生。

Flavodon sp.x10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M2020961；保藏日期：2020年12月23日；保藏地址：中国武汉武汉大学。

高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10在产纤维素酶中的应用。

进一步的，真菌Flavodon sp.x10在常温环境下能够生产纤维素酶，纤维素酶包括内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。

本发明Flavodon sp.x10在30℃产生纤维素酶。在该温度条件下，滤纸酶、内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活力，分别达到0.1388U/mL、0.3592U/mL、0.1359U/mL和0.1222U/mL。

含有高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10的发酵液也属于本发明的保护范围。

进一步的，发酵液的制备工艺如下：将Flavodon sp.x10接种在CMC钠液体培养基中，在30℃下摇床震荡5天，得到Flavodon sp.x10的发酵液，摇床震荡的转速为150r/min。

进一步的，CMC钠液体培养基的配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏0.2g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾4g/L、七水硫酸镁0.3g/L，液体培养基的pH为自然，且在121℃高压蒸汽灭菌15min。

一种纤维素酶，由保藏编号CCTCC No：M 2020961的Flavodon sp.x10发酵制备，其制备方法为：将Flavodon sp.x10菌株接入种子培养基中，于30℃，150r/min下培养24h，然后以2％的接种量接种于CMC钠培养基30℃，150r/min下培养5d；过滤菌体取上清液即为粗酶液。

进一步的，种子培养基的配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氢钾4g/L、酵母膏0.2g/L、七水硫酸镁0.3g/L。

由保藏编号CCTCC No：M 2020961的Flavodon sp.x10发酵制备的纤维素酶用于纤维素类生物质的高效降解。

进一步的，纤维素类生物质包括秸秆。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

本发明提供的高效降解纤维素真菌Flavodon sp.x10是在沿海地区分离得到的，在30℃下具有较强的产纤维素酶能力，所产的内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活性高，为处理纤维素提供了一种高效降解的手段，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为Flavodon sp.x10的制备流程图；

图2为Flavodon sp.x10在PDA培养基的菌落形态图(PDA，30℃，3天)；

图3为Flavodon sp.x10在CMC钠培养基的菌落形态图(CMC-Na，30℃，3天)；

图4为Flavodon sp.x10的菌丝结构示意图(20倍物镜)；

图5为Flavodon sp.x10的菌丝结构示意图(100倍物镜)；

图6为Flavodon sp.x10的ITS序列构建的***发育树图；

图7为Flavodon sp.x10的刚果红羧甲基纤维素钠平板水解效果示意图(30℃，3天)；

图8为Flavodon sp.x10的的产纤维素酶与模式菌株里氏木霉对照测定结果图；

图9为Flavodon sp.x10的的产纤维素酶测定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所用的培养基及其配方如下：

PDA培养基的配方为：马铃薯浸粉6g、琼脂20g、葡萄糖20g，水1000mL，pH自然，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

CMC钠培养基的配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏0.2g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾4g/L、七水硫酸镁0.3g/L、琼脂20g/L。培养基在121℃高压蒸汽灭菌20min。

种子培养基的配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氢钾4g/L、酵母膏0.2g/L、七水硫酸镁0.3g/L。

实施例1 Flavodon sp.x10的分离与鉴定

如图1所示，本实施例提供的高效降解纤维素真菌Flavodon sp.x10的制备步骤为：采集江苏东台黄海国家森林公园的腐败叶片与腐殖质土壤；将采集的腐殖质土壤和腐败叶片剪碎放入装有无菌水的离心管中充分震荡，取悬浊液；将所取的悬浊液梯度稀释，制成10^-2至10^-7浓度的梯度稀释液；将梯度稀释液加入至CMC钠培养基平板上进行涂布处理，并放到30℃培养箱中培养，培养2-3天后进行刚果红染色，挑选透明圈较大的菌落进行纯化、低温保藏菌种；选择水解圈最大的菌株命名为x-10。

1、形态学鉴定

将菌株x-10接种到PDA固体培养基和CMC钠固体培养基上，然后将平板倒转，在温度为30℃的条件下培养3天，观察并记录平板上菌落的生长情况。x-10在PDA培养基的菌落形态图见图2，可以看出：菌落生长平缓，四周为白色菌丝，中心部分菌丝较为透明，菌丝极性生长较强，菌落扩散较快。该真菌没有在PDA上没有孢子。然后用无菌镊子夹取适量培养好的x-10菌丝于载玻片***，拨动菌丝使其均匀散开，盖上盖玻片，置于显微镜下，观察菌丝形态。菌株的菌丝结构示意图详见图4。从图4能够看出x-10菌丝较长，分支产生较少，极性生长较强，宏观形态与微观菌丝特性相适应。在CMC钠培养基上进行观察，菌丝生长速度较快，但是菌落菌丝较为稀疏，菌丝更为透明(图3)。在100倍物镜显微镜下观察，发现菌丝在生长过程中出现大量空腔(图5)。

2、ITS序列分析

采用传统方法提取本菌株中的DNA并进行ITS序列分析，30μL的PCR反应体系包括1uL模板引物(ITS1/ITS4)、1uL模板DNA、15uL taq酶预混液、12uL无菌水。反应条件为：在温度为94℃预变性4min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸1min，30个循环，4℃保存。PCR产物由擎科有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。将所得序列在GenBank中进行BLAST相似性比对并运用MEGA7.0软件构建菌株的***发育树。本菌株的发育树图请见图6。综合上述形态学观察及ITS序列分析结果，能够确定本菌株x-10是Flavodon属的成员，将其命名为Flavodon sp.x10。该菌株已于2020年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学；邮政编码：430072)，分类命名为：Flavodonsp.x10，保藏编号为CCTCC NO：M 2020961。

实施例2 Flavodon sp.x10降解纤维素能力测定

图7为Flavodon sp.x10的刚果红羧甲基纤维素钠平板水解效果示意图，图中可以看出，30℃下，接种Flavodon sp.x10的CMC钠平板2天后刚果红染色出现了明显的水解圈，由菌落生长大小和速度还有水解圈可以看出其生产纤维素酶的效率比较高。

实施例3 Flavodon sp.x10产纤维素酶能力测定

1、粗酶液的制备

将本发明实施例1提供的Flavodon sp.x10菌株接入种子培养基中，于30℃，150r/min下培养24h，然后以2％的接种量接种于CMC钠培养基30℃，150r/min下培养5d。过滤菌体取上清液即为粗酶液。

2、葡萄糖标准曲线的制作

取0-1mL(每管差0.2mL)的1mg/mL的葡萄糖标准液于7支刻度试管中，加蒸馏水补足至1mL，再加入DNS 2mL，2mL pH＝10的硼酸缓冲液混匀，沸水浴30min，取出后待冷却至室温，用分光光度计测量OD₅₄₀、OD₅₃₀。以光密度值为横坐标，葡萄糖含量(mg)为纵坐标，作葡萄糖标准曲线。测样品的OD值，通过标准曲线计算葡萄糖的生成量。

3、酶活的测定

(1)内切β-葡聚糖酶活力的测定

将羧甲基纤维素钠加入到pH4.5的柠檬酸缓冲液中配制出1％的底物溶液，取底物溶液2mL加入1mL上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，取1mL反应液加入2mL DNS试剂、2mL pH＝10的硼酸缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在540nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。

(2)外切β-葡聚糖酶活力的测定

将微晶纤维素加入到pH4.5的柠檬酸缓冲液中配制出1％的底物溶液，取底物溶液2mL加入1mL上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，取1mL反应液加入2mL DNS试剂、2mL pH＝10的硼酸缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在540nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。

(3)β-葡萄糖苷酶活力的测定

将水杨素加入到pH4.5的柠檬酸缓冲液中配制出1％的底物溶液，取底物溶液2mL加入1mL上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，取1mL反应液加入2mLDNS试剂、2mL pH＝10的硼酸缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在540nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。

(4)滤纸酶活测定

取1g滤纸剪碎加入到2mL无菌水中，再加入1mL上述制得的粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，取1mL反应液加入2mL DNS试剂、2mL pH＝10的硼酸缓冲液，将各管摇匀，沸水浴30min，取出，待冷却至室温后，在540nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成1μmol的葡萄糖为一个酶活单位。

通过与纤维素产酶模式菌株里氏木霉ACCC30590(中国农业微生物菌种保藏管理中心)做产酶活性对照(图8)，Flavodon sp.x10的的酶活性远远大于里氏木霉，说明Flavodon sp.x10具有较高的应用潜力与发展前景。

本发明提供了高效解纤维素Flavodon sp.x10产纤维素酶包括内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶的测定结果图，结果图请参考图9。从图9中能够看出在30℃下，菌株具有较强的产酶能力，且在发酵培养5天时，滤纸酶、内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶均具有较高的酶活力，分别达到0.1388U/mL、0.3592U/mL、0.1359U/mL和0.1222U/mL，具有良好的工业化应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一株高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> Flavodon sp.x10 ITS序列(artificial)

<400> 1

tgtctcggta agagacgatt ataagcacga actaataaat acttcaacac cacagcgcag 60

ataattatca cactgaaggc gatccgtaag attcacgcta atgcatttca gaggagtcga 120

ctagaagccg acacaacctc caagtccaag cccactaaac ttcattacaa aatttagggg 180

ttgagaattc catgagactc aaacaggcat actcctcgga ataccaagga gtgcaaggtg 240

cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc gcatttcgct 300

gcgttcttca tcgatgcgag agccaagaga tccgttgctg aaagttgtat ataattgtgt 360

tatacacagt aaacattcta aaactgaagc gtttgtagta aacataagaa aggcttatta 420

ccaactaata aatagctggc ttacaccgtt tcttacataa agtgcacaga ggttgagagt 480

ggatgagcca ggcgtgcaca tacctcgtta aaggccagct acaacccgtt caaaactcga 540

taatgatcct tccgc 555

Claims (10)

1.一株高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 2020961；保藏日期：2020年12月23日；保藏地址：中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10在产纤维素酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，真菌Flavodon sp.x10在常温环境下能够生产纤维素酶，所述纤维素酶包括内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。

4.含有权利要求1所述的高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10的发酵液，其特征在于，所述发酵液的制备工艺如下：将Flavodon sp.x10接种在CMC钠液体培养基中，摇床震荡，得到Flavodon sp.x10的发酵液。

5.根据权利要求4所述的含有高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10的发酵液，其特征在于，所述发酵液的制备工艺如下：将Flavodon sp.x10接种在CMC钠液体培养基中，在30℃下摇床震荡5天，得到Flavodon sp.x10的发酵液，所述摇床震荡的转速为150r/min。

6.根据权利要求4所述的含有高产纤维素酶的真菌Flavodon sp.x10的发酵液，其特征在于，所述CMC钠液体培养基的配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏0.2g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾4g/L、七水硫酸镁0.3g/L。

7.一种纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶由保藏编号CCTCC No：M 2020961的Flavodon sp.x10发酵制备得到。

8.制备权利要求7所述的纤维素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：将Flavodonsp.x10菌株接入种子培养基中，于30℃，150r/min下培养24h，然后以2％的接种量接种于CMC钠培养基30℃，150r/min下培养5d；过滤菌体取上清液即为粗酶液。

9.根据权利要求8所述的制备纤维素酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的配方为：羧甲基纤维素钠10g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氢钾4g/L、酵母膏0.2g/L、七水硫酸镁0.3g/L。

10.权利要求7所述的纤维素酶的应用，其特征在于，所述纤维素酶用于纤维素类生物质的高效降解。

Images