CN112724217B - 一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种植物生物技术领域的青蒿MYB类转录因子AaMYB108及其应用。所述转录因子AaMYB108的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明转录因子AaMYB108可用于激活青蒿素生物合成途径中关键酶基因CYP71A V1启动子的活性,正调控青蒿素合成关键酶基因的表达,从而促进青蒿素的生物合成,且不会对植物生长发育造成危害与非转基因野生型青蒿相比,生长状态无差别。本发明中AaMYB108转录因子可通过过量表达的方法应用于青蒿素产量的提高,对于青蒿的基因工程育种和青蒿素的规模化生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108及其应用。
背景技术
青蒿素是从中药青蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯化合物,最早由中国科学家屠呦呦于1971年发现,2015年10月屠呦呦因创制新型抗疟药—青蒿素和双氢青蒿素的贡献荣获2015年度诺贝尔生理学或医学奖。目前青蒿素是抗疟疾唯一有效的单体,尤其是对恶性疟疾有速效作用。青蒿素抗疟疾的主要机制是破坏疟原虫膜系结构,首先作用于食物泡膜、表膜、线粒体、内质网,此外对核内染色质也有一定的影响。青蒿素的作用方式主要是干扰表膜-线粒体的功能。青蒿素作用于食物泡膜,从而阻断了营养摄取的最早阶段,使疟原虫较快出现氨基酸饥饿,迅速形成自噬泡,并不断排出虫体外,从而使疟原虫损失大量胞浆而死亡。
青蒿素是青蒿植物中对抗疟疾的最有效成分,然而青蒿素在青蒿中含量极低,只占干重的0.1–1.0%。促进植物中青蒿素的生产有利于提高整个植株的抗疟疾的能力,减少疟原虫对于青蒿素纯品的耐受性。因此对于青蒿素合成途径的研究对于提高青蒿中青蒿素的含量具有重要意义。
MYB转录因子,作为植物中最大的一类转录因子,参与了包括细胞周期、生理代谢平衡及环境应答等在内的许多生命活动。随着植物中发现MYB基因的数量迅速增加,MYB转录因子的调控机制、基因表达谱和靶基因的确定等信息也在不断丰富。MYB转录因子参与类黄酮代谢途径、细胞壁组分合成及硫代葡萄糖苷的生物合成等多种初生和次生代谢反应过程,起到重要的调控作用。
发明内容
为了提高青蒿素的含量,本发明提供一种青蒿AaMYB108基因及其用途,该基因编码青蒿MYB转录因子AaMYB108,该转录因子能够促进青蒿素生物合成途径中关键限速酶基因CYP71AV1启动子的活性,正向调控CYP71AV1的表达,从而促进青蒿素的生物合成;利用基因工程技术将青蒿AaMYB108转录因子在青蒿中过量表达,可以显著提高转基因植株的青蒿素含量,且不会影响植物的正常生长发育,对于青蒿的种质创新和高含量青蒿素品种的选育以及青蒿素的规模化生产具有重要意义。
本发明是通过以下的技术方案实现的:
第一方面,本发明提供一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108,所述转录因子AaMYB108的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述转录因子AaMYB108的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
或者一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108,所述转录因子AaMYB108的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第二方面,本发明公开了一种重组表达载体,所述重组表达载体包含如上所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108的核苷酸序列;或者所述重组表达载体可编码如上所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108的氨基酸序列。
第三方面,本发明公开了一种如上所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108在调控青蒿素生物合成中的应用,所述转录因子AaMYB108可激活青蒿素下游合成途径中的关键限速酶基因CYP71AV1的启动子活性。
进一步地,过表达AaMYB108基因会增加转基因植株青蒿素含量,而反义干扰表达AaMYB108基因可降低青蒿素含量。
进一步地,包括如下步骤:
步骤一,将青蒿MYB类转录因子AaMYB108的核苷酸序列连于植物表达调控序列上,构建含有AaMYB108核苷酸序列的过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-Antisense,转入农杆菌菌株GV3101中;
步骤二,将青蒿中青蒿素生物合成关键酶基因CYP71AV1的启动子ProCYP71AV1载体,构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1;
步骤三,将所述pHB-AaMYB108-YFP植物表达载体和所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1分别转入带有pSoup19辅助质粒的农杆菌菌株GV3101中,获得包含目的载体的农杆菌工程菌株;
步骤四,将包含所述pHB-AaMYB108-YFP植物表达载体的农杆菌工程菌株分别与包含所述pGreenII0800-ProCYP71AV1植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株按1:1比例混合后,通过注射侵染的方式注射到生长4-5周的烟草叶片中,暗培养一天,光下培养一天;
步骤五,用打孔器取烟草叶片注射部位的样品,液氮速冻后研磨成粉末;
步骤六,采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒和GloMax 20/20Luminometer荧光检测仪检测荧光强度,确定转录因子AaMYB108对青蒿素合成关键酶基因CYP71AV1启动子的激活作用;
步骤七,将步骤一所述过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-Antisense转入农杆菌菌株EHA105中,分别得到包含过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-Antisense的根癌农杆菌菌株EHA105用于青蒿转化;
步骤八,将步骤七所述两种农杆菌转入青蒿,经过抗生素潮霉素筛选,获得抗性苗,再提取植株DNA经过PCR进行阳性检测获得转基因青蒿植株;经过青蒿素含量检测,所述过量表达AaMYB108的转基因植株中青蒿素含量显著提高,反义干扰表达AaMYB108转基因青蒿植株中青蒿素含量显著降低,确认AaMYB108对青蒿素含量的正调控作用。
进一步地,步骤一、三、七中,转入具体方法为:采用冻融法进行转入;步骤八中,所述的经PCR进行阳性检测的具体方法为:依据转录因子AaMYB108的核苷酸序列设计测序引物,进行DNA扩增,PCR产物电泳后紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株;通过HPLC-ELSD法测定青蒿素含量。
第四方面,本发明提供一种利用过量AaMYB108表达来提高青蒿中青蒿素含量的应用,包括如下步骤:
步骤一,对青蒿转录组数据库MYB类转录因子进行分析,克隆如权利要求1所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108;
步骤二,把AaMYB108可操作地连于植物过表达载体,形成过量表达载体;
步骤三,将步骤二所述过量表达载体转入农杆菌中,得到包含过量表达载体的根癌农杆菌菌株;
步骤四,将步骤三中所述包含过量表达载体的根癌农杆菌菌株转入青蒿,经抗性筛选得到抗性苗,再经过PCR进行阳性检测后得到转基因青蒿植株;
步骤五,取步骤四所述转基因青蒿植株提取青蒿素,采用HPLC-ELSD法测定青蒿素含量,获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。
进一步地,具体步骤如下:
步骤一,对青蒿转录组数据库MYB类转录因子进行分析,克隆如权利要求1所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108;
步骤二,把AaMYB108可操作地连于植物过表达载体,形成过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP;
步骤三,将步骤二所述过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP转入农杆菌EHA105菌株中,得到包含过量表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105;
步骤四,将步骤三中所述农杆菌转入青蒿,经潮霉素筛选得到抗性苗,再经过PCR进行阳性检测后得到转基因青蒿植株;
步骤五,取步骤四所述转基因青蒿植株提取青蒿素,采用HPLC-ELSD法测定青蒿素含量,获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。
AaMYB108是青蒿中分离得到的一个MYB类转录因子,在青蒿植株中过量表达AaMYB108可以显著提高青蒿素的含量,表明该转录因子能够调控青蒿素的生物合成,故克隆该基因对于青蒿的基因工程育种和青蒿素的规模化生产具有重要意义。经过对现有技术文献的检索,尚未发现有与本发明的AaMYB108基因序列相关的报道。该序列是本发明首次提出。
本发明通过对青蒿转录组数据库中MYB类转录因子进行分析,从青蒿中克隆AaMYB108基因,构建含AaMYB108基因的过量表达载体,用根癌农杆菌EHA105介导,采用叶盘法将AaMYB108基因过量表达载体转化青蒿;PCR检测外源目的基因AaMYB108的整合情况,通过高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量,表明获得的转基因青蒿的青蒿素含量显著提高。
在本发明中,可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体,包括质粒,粘粒等。在生产本发明的青蒿AaMYB108蛋白多肽时,可以将青蒿AaMYB108蛋白编码序列可操作地连于植物表达调控序列,从而形成青蒿AaMYB108蛋白表达载体。
如本文所用,“可操作地连于”指这样一种状况,即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如,如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌,那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录,那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时,那么它是可操作地连于编码序列。一般,“可操作地连于”意味着相邻,而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),菌株分别有GV3101、GV3101(pSoup19)、EHA105,上述菌株均可以从市场上公开购买。
本发明的优点是:发现了正向调控青蒿素生物合成的转录因子AaMYB108,对青蒿素生物合成途径中的关键酶基因CYP71AV1具有显著激活作用,且不会对植物生长发育造成危害与非转基因野生型青蒿相比,生长状态无差别。本发明还通过截取上述转录因子基因的编码区,扩增出与原有基因序列反向互补的序列,构建pHB-AaMYB108-Antisense反义干扰载体,抑制该基因在青蒿中的表达。本发明运用基因工程手段改变青蒿植株中相应基因的表达情况,提高了青蒿素的产量,为代谢调控提高青蒿素产量提供了新的策略。
以下将结合附图对本发明作进一步说明,以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1是烟草瞬时转化AaMYB108显著激活CYP71AV1基因启动子的活性。
图2是AaMYB108转录因子在青蒿中调控青蒿素表达量;其中过量表达株系(AaMYB108OE)示出了显著提高的青蒿素含量,反义干扰表达株系(AaMYB108-Anti)示出了显著降低的青蒿素含量。
上述附图中,*表示与对照有显著差异,**表示与对照有极显著差异。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、青蒿AaMYB108基因的克隆
1.青蒿基因组总RNA的提取
取青蒿叶片组织,置于液氮中研碎,加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中,充分振荡后,按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量,然后在分光光度计上测定RNA浓度。
2.青蒿AaMYB108基因的克隆
以所提取的青蒿总RNA为模板,根据RNA浓度计算用量,在PowerScript反转录酶的作用下得到cDNA;根据AaMYB108基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1),该序列从青蒿基因组测序结果中获得。设计基因特异性引物,通过PCR从总cDNA中扩增AaMYB108基因,PCR产物经过回收纯化后,连接平末端pLB载体(天根生化有限公司产品)并测序,获得pLB-AaMYB108质粒载体,提取质粒后测序。
通过上述步骤,获得了青蒿中AaMYB108转录因子的编码序列(SEQ ID NO:1)并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO:2),其中,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA。
实施例2、含AaMYB108基因的植物表达载体的构建
1.过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP的构建
从测序正确的平末端载体pLB中扩增AaMYB108基因,将其构建在植物表达载体pHB-YFP上,为了方便表达载体的构建,正向引物引入了BamHI的酶切位点,反向引物引入了SpeI的酶切位点,引物序列如下:
正向引物MYB108-YFP-F:TCTCTCTCTAAGCTTGGATCCATGAATAGCAACAACAAC,即SEQ IDNO.3
反向引物MYB108-YFP-R:GCCCTTGCTCACCATACTAGTCATGTCGAATTGTTGTT,即SEQ IDNO.4
2.反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-antisense的构建
将测序正确的AaMYB108核苷酸序列反向互补后,再设计引物,从平末端载体pLB中扩增AaMYB108基因的反向互补序列,并将其构建在植物表达载体pHB上,为了方便表达载体的构建,正向引物引入了SpeI的酶切位点,反向引物引入了BamHI的酶切位点,引物序列如下:
正向引物Anti-MYB108-F:GCTCTAGAATGAATAGCAACAACAAC,即SEQ ID NO.5
反向引物Anti-MYB108-R:CGGGATCCTCACATGTCGAA,即SEQ ID NO.6
实施例3、青蒿素生物合成关键酶基因CYP71AV1启动子双荧光素报告载体的构建
1.PCR扩增青蒿素生物合成关键酶基因CYP71AV1的启动子
根据NCBI数据库中青蒿素生物合成关键酶基因的序列信息,设计CYP71AV1的启动子扩增特异性引物以青蒿基因组DNA为模板进行扩增,在引物上下游分别加入HindIII和PstI酶切位点。
正向引物CYP71AV1-P-F:AAATGGGTCAATTTCGGGTT,即SEQ ID NO.7
反向引物CYP71AV1-P-R:CATTGCTTTTAGTATACTCTTC,即SEQ ID NO.8
2.将启动子片段连入双荧光素报告载体
利用同源重组的方法,将扩增的CYP71AV1的启动子序列通过ClonExpress II OneStep Cloning Kit(诺唯赞,南京)试剂盒构建到pGreenII0800-LUC载体上,获得植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1。
实施例4、烟草瞬时转化检测转录因子AaMYB108对关键酶基因CYP71AV1启动子的
激活作用
1.农杆菌工程菌株的获得
将pHB-YFP空载体和实施例2中含AaMYB108的植物表达载体pHB-AaMYB108-YFP采用冻融法转入根癌农杆菌GV3101,并将实施例3中植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1采用冻融法转入带有pSoup辅助质粒的根癌农杆菌GV3101,分别获得含有空载体、AaMYB108基因和CYP71AV1基因启动子的农杆菌工程菌株。
2.瞬时转化烟草
将上述农杆菌工程菌株的阳性菌株按1:100的比例接种在10ml液体培养基中扩大培养,28℃培养过夜;4500rpm离心10min收集菌体;使用MS液体培养基重悬菌体,并且用MS液体培养基将各个菌液浓度稀释到OD600为0.6;加入终浓度为200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)和10mmol/L的MES(pH 5.7),室温静置3h备用。
将包含pHB-AaMYB108-YFP和空载体的农杆菌工程菌株分别与包含pGreenII0800-ProCYP71AV1植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株按1:1比例混合后,通过1mL无针头注射器注射侵染的方式注射到生长4-5周的烟草叶片中,先暗培养一天后光下培养一天。
3.Dual-Luciferase检测
取培养2天的烟草叶片,用液氮速冻后研磨成粉末。使用Promega公司的Dual-Reporter Assay System试剂盒和GloMax 20/20Luminometer荧光检测仪检测荧光强度,按照试剂盒说明书进行操作。结果如图1所示,AaMYB108显著激活CYP71AV1基因启动子的活性。
实施例5、根癌农杆菌介导的AaMYB108过量表达和反义干扰载体遗传转化青蒿获
得转基因青蒿植株
1.含AaMYB108过量表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例2中含AaMYB108的植物过量表达和反义干扰表达载体通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105(市场有公开出售的生物材料,可以从澳大利亚CAMBIA公司购得,菌株编号为Gambar 1),并用实施例2中的引物进行PCR检测验证。阳性结果表明,含AaMYB108的植物过量表达和反义干扰载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
2.根癌农杆菌介导AaMYB108基因转化青蒿
2.1.外植体的预培养
青蒿种子用75%乙醇浸泡1min后离心,无菌水洗2-3次,再用20%NaClO浸泡20min,无菌水冲洗4-5次,接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中,25℃、16h/8h(光培养/暗培养)光照培养,发芽后即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
2.2.农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体,转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中,滴加含活化好的所述含AaMYB108植物过表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
2.3.抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Hyg 5mg/L+Cef 500mg/L)上,于25℃、16h/8h(光培养/暗培养)光照培养,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Hyg抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cef125mg/L)上培养至生根,从而获得Hyg抗性再生青蒿植株。
3.转基因青蒿植株的PCR检测
根据AaMYB108的基因序列和植物pHB-YFP载体序列分别设计正向检测引物和反向检测引物对过表达植株和反义干扰植株进行阳性检测。结果表明,利用所设计的PCR特异检测引物,能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时,没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105,获得用于转化青蒿的含AaMYB108的植物过量表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌菌株,利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿,获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。
实施例6、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量
1.HPLC-ELSD条件及***适用性以及标准溶液的配制
HPLC:采用water alliance 2695***,色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18,5μm,250×4.6mm,Waters),流动相为甲醇:水,甲醇:水的体积比为70:30,柱温30℃,流速1.0mL/min,进样量10μL,灵敏度(AUFS=1.0),理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD:采用water alliance 2420***,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7,载气压力5bar;
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解,得到2mg/mL青蒿素标准品溶液,保存于-20℃备用。
本发明中流动相为甲醇(methanol):水,比例为70%:30%时,青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
2.标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl,4μl,6μl,8μl,10μl记录图谱及色谱参数,分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究,本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为:Y=1.28e+000X+4.71e+000,R=0.979546。
3.样品的制备和青蒿素含量的测定
在青蒿植株的上,中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片,于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾,磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中,加入2mL甲醇(1mL甲醇萃取2次),用40W超声波处理30min,5000rpm离心10min,取上清用0.22μm滤膜过滤,即得到青蒿素甲醇溶液,用于HPLC-ELSD测定。
采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量,样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg),再除以样品的青蒿叶干重(g),从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量,采用转化AaMYB108过量表达载体的代谢工程策略,发现AaMYB108基因的过量表达可显著提高转基因青蒿植株中青蒿素的含量,为利用该基因进行转录调控研究进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的实验证据。
本发明涉及的青蒿MYB类转录因子AaMYB108能够提高植物中青蒿素含量,将所述转录因子的编码序列连于植物表达调控载体上,构建含所述编码序列的植物表达载体;将表达载体转入农杆菌,将农杆菌转入青蒿;通过抗生素筛选,获得含有所述编码序列再生转基因植株;本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控,结果如图2所示,在非转化的野生型青蒿中青蒿素含量为14.9mg/g DW时,同时期转AaMYB108过量表达载体青蒿中青蒿素的含量平均23mg/g DW,AaMYB108反义干扰表达青蒿中青蒿素含量则平均为10.5mg/g DW。图2中CK表示非转化的野生型青蒿;108OE-8、108OE-14和108OE-33表示转AaMYB108过量表达载体青蒿的不同部位叶片取样;108-Anti26、108-Anti32和108-Anti34表示AaMYB108反义干扰表达青蒿的不同部分叶片取样。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列,为利用该编码序列规模化生产青蒿素打下了坚实的基础。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108及其应用
<130> CN084-20012PICN
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> Artemisia annua L.
<400> 1
atgaatagca acaacaacaa ttgcatggaa attggtggaa gtgaagatga tgagcagatg 60
aacatgatgg aagatcttag aagaggtcct tggactgtcg aagaagattt tactctcatc 120
aattacatcg ctcatcatgg ggaaggtcgt tggaattcgc tagctcgttg cgccggactc 180
aaaagaacag gaaagagttg ccgattaaga tggttgaatt atttacgacc agatgttcgt 240
cgtgggaata ttacgcttga agaacaactt ttgattcttg aacttcattc tcgttggggc 300
aatcggtggt caaaaattgc acaacacttg ccaggaagaa ccgataacga gatcaagaat 360
tattggagaa caagggttca aaaacatgca aaacaattga aatgtgacgt gaatagcaag 420
caatttaagg acacgatgcg ttatctttgg atgccaagac tagtcgaaag aattcaagca 480
gctgcaacaa caacgaccgt aaccgaaggt tcatcttctt ccaccacaac aacctcaacc 540
gcaacgaaca caaacttcta taacccgcta aaccaaacaa acaatatgga taatattgtt 600
actagccaat ttataacgcc tcaacaaagc cataacatgt cttcaaacta tggaaatacc 660
catgttaacc ctagttacac cacggataat tcaagcaata ccgcggtatc gcctgtttct 720
gacatgactg attgttatta tcccacaaac caaaacccta gtcaagattt atatcaaagc 780
agtaatccga ttactaccgg gttttcagac actatgatta gcccgacggg gtactttaat 840
caagggatgg acttccaagc tatggttgat caccaaaaca gccaatggtc cgaaggcgaa 900
aatggtggtg gtgatgcttt ctcagacaat ttgtggaacg tggaggacgt ttggtttctc 960
aaacaacaat tcgacatgtg a 981
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> Artemisia annua L.
<400> 2
Met Asn Ser Asn Asn Asn Asn Cys Met Glu Ile Gly Gly Ser Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Gln Met Asn Met Met Glu Asp Leu Arg Arg Gly Pro Trp Thr
20 25 30
Val Glu Glu Asp Phe Thr Leu Ile Asn Tyr Ile Ala His His Gly Glu
35 40 45
Gly Arg Trp Asn Ser Leu Ala Arg Cys Ala Gly Leu Lys Arg Thr Gly
50 55 60
Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Val Arg
65 70 75 80
Arg Gly Asn Ile Thr Leu Glu Glu Gln Leu Leu Ile Leu Glu Leu His
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Asn Arg Trp Ser Lys Ile Ala Gln His Leu Pro Gly
100 105 110
Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Arg Thr Arg Val Gln Lys
115 120 125
His Ala Lys Gln Leu Lys Cys Asp Val Asn Ser Lys Gln Phe Lys Asp
130 135 140
Thr Met Arg Tyr Leu Trp Met Pro Arg Leu Val Glu Arg Ile Gln Ala
145 150 155 160
Ala Ala Thr Thr Thr Thr Val Thr Glu Gly Ser Ser Ser Ser Thr Thr
165 170 175
Thr Thr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Asn Phe Tyr Asn Pro Leu Asn Gln
180 185 190
Thr Asn Asn Met Asp Asn Ile Val Thr Ser Gln Phe Ile Thr Pro Gln
195 200 205
Gln Ser His Asn Met Ser Ser Asn Tyr Gly Asn Thr His Val Asn Pro
210 215 220
Ser Tyr Thr Thr Asp Asn Ser Ser Asn Thr Ala Val Ser Pro Val Ser
225 230 235 240
Asp Met Thr Asp Cys Tyr Tyr Pro Thr Asn Gln Asn Pro Ser Gln Asp
245 250 255
Leu Tyr Gln Ser Ser Asn Pro Ile Thr Thr Gly Phe Ser Asp Thr Met
260 265 270
Ile Ser Pro Thr Gly Tyr Phe Asn Gln Gly Met Asp Phe Gln Ala Met
275 280 285
Val Asp His Gln Asn Ser Gln Trp Ser Glu Gly Glu Asn Gly Gly Gly
290 295 300
Asp Ala Phe Ser Asp Asn Leu Trp Asn Val Glu Asp Val Trp Phe Leu
305 310 315 320
Lys Gln Gln Phe Asp Met
325
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctctctcta agcttggatc catgaatagc aacaacaac 39
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcccttgctc accatactag tcatgtcgaa ttgttgtt 38
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctctagaat gaatagcaac aacaac 26
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgggatcctc acatgtcgaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaatgggtca atttcgggtt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cattgctttt agtatactct tc 22
Claims (6)
1.一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108在调控青蒿素生物合成中的应用,其特征在于,所述转录因子AaMYB108的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述转录因子AaMYB108可激活青蒿素下游合成途径中的关键限速酶基因CYP71AV1的启动子活性;
所述应用包括如下步骤:
步骤一,对青蒿转录组数据库MYB类转录因子进行分析,克隆所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108;
步骤二,把AaMYB108可操作地连于植物过表达载体,形成过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-antisense;
步骤三,将步骤二所述过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-antisense分别转入农杆菌EHA105菌株中,得到包含过量表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105和包含反义干扰表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105;
步骤四,将步骤三中所述农杆菌转入青蒿,经潮霉素筛选得到抗性苗,再经过PCR进行阳性检测后得到转基因青蒿植株。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,过表达AaMYB108基因会增加转基因植株青蒿素含量,而反义干扰表达AaMYB108基因可降低青蒿素含量。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一,将青蒿MYB类转录因子AaMYB108的核苷酸序列连于植物表达调控序列上,构建含有AaMYB108核苷酸序列的过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-Antisense,转入农杆菌菌株GV3101中;
步骤二,将青蒿中青蒿素生物合成关键酶基因CYP71AV1的启动子ProCYP71AV1载体,构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1;
步骤三,将所述pHB-AaMYB108-YFP植物表达载体和所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1分别转入带有pSoup19辅助质粒的农杆菌菌株GV3101中,获得包含目的载体的农杆菌工程菌株;
步骤四,将包含所述pHB-AaMYB108-YFP植物表达载体的农杆菌工程菌株分别与包含所述pGreenII0800-ProCYP71AV1植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株按1:1比例混合后,通过注射侵染的方式注射到生长4-5周的烟草叶片中,暗培养一天,光下培养一天;
步骤五,用打孔器取烟草叶片注射部位的样品,液氮速冻后研磨成粉末;
步骤六,采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒和GloMax 20/20Luminometer荧光检测仪检测荧光强度,确定转录因子AaMYB108对青蒿素合成关键酶基因CYP71AV1启动子的激活作用;
步骤七,将步骤一所述过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-Antisense转入农杆菌菌株EHA105中,分别得到包含过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP和反义干扰表达载体pHB-AaMYB108-Antisense的根癌农杆菌菌株EHA105用于青蒿转化;
步骤八,将步骤七所述两种农杆菌转入青蒿,经过抗生素潮霉素筛选,获得抗性苗,再提取植株DNA经过PCR进行阳性检测获得转基因青蒿植株;经过青蒿素含量检测,所述过量表达AaMYB108的转基因植株中青蒿素含量显著提高,反义干扰表达AaMYB108转基因青蒿植株中青蒿素含量显著降低,确认AaMYB108对青蒿素含量的正调控作用。
4.如权利要求3所述的应用,其中,步骤一、三、七中,转入具体方法为:采用冻融法进行转入;步骤八中,所述的经PCR进行阳性检测的具体方法为:依据转录因子AaMYB108的核苷酸序列设计测序引物,进行DNA扩增,PCR产物电泳后紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株;通过HPLC-ELSD法测定青蒿素含量。
5.一种利用过量AaMYB108表达来提高青蒿中青蒿素含量的应用,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一,对青蒿转录组数据库MYB类转录因子进行分析,克隆如权利要求1中 所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108;
步骤二,把AaMYB108可操作地连于植物过表达载体,形成过量表达载体;
步骤三,将步骤二所述过量表达载体转入农杆菌中,得到包含过量表达载体的根癌农杆菌菌株;
步骤四,将步骤三中所述包含过量表达载体的根癌农杆菌菌株转入青蒿,经抗性筛选得到抗性苗,再经过PCR进行阳性检测后得到转基因青蒿植株;
步骤五,取步骤四所述转基因青蒿植株提取青蒿素,采用HPLC-ELSD法测定青蒿素含量,获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,具体步骤如下:
步骤一,对青蒿转录组数据库MYB类转录因子进行分析,克隆如权利要求1中 所述的青蒿MYB类转录因子AaMYB108;
步骤二,把AaMYB108可操作地连于植物过表达载体,形成过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP;
步骤三,将步骤二所述过量表达载体pHB-AaMYB108-YFP转入农杆菌EHA105菌株中,得到包含过量表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105;
步骤四,将步骤三中所述农杆菌转入青蒿,经潮霉素筛选得到抗性苗,再经过PCR进行阳性检测后得到转基因青蒿植株;
步骤五,取步骤四所述转基因青蒿植株提取青蒿素,采用HPLC-ELSD法测定青蒿素含量,获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。
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