CN112710823B - 一种肠移行性复合运动的离体检测***及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肠移行性复合运动的离体检测***及其应用，所述离体检测***包括样品固定装置、恒温加热器、储液缸、蠕动泵和废液收集缸；所述样品固定装置位于所述恒温加热器上；所述样品固定装置、储液缸和蠕动泵通过管道相连；所述蠕动泵用于将储液缸中的液体通过进液管泵入样品固定装置中，所述样品固定装置中的液体通过出液管流向废液收集缸中。本发明采用循环加热灌注缓冲液的方式让组织在离体状态下保持活性，最大程度模拟肠道在体运动状态，利用视频记录方式实现了肠移行性复合运动的离体检测。
Description
技术领域
本发明属于神经科学技术领域，涉及一种肠移行性复合运动的离体检测***及其应用。
背景技术
众所周知，胃肠道是吸收营养的唯一途径，也是控制机体内环境平衡的重要器官。胃肠道一方面从摄入的食物中吸收能量和营养物质供机体使用，另一方面保护机体免受毒素和病原体等的侵害，而协调这些复杂的基本活动很大程度上是依靠局部神经***来完成的，即肠神经***(Enteric nervous system，ENS)。ENS是最大的外周神经***，是由位于肠道壁内的神经元和胶质细胞组成的网状神经丛结构，主要包括黏膜下神经丛(Submucousplexus)和肌间神经丛(Myenteric plexus)。较大的肌间神经丛围绕在整个消化管周围，含有负责肠道运动和调节临近器官的神经元，主要支配肠道平滑肌；而较小的黏膜下神经丛含有感觉神经元，可以感受肠黏膜表面的化学压力和牵张刺激，主要支配肠黏膜。由于肠神经***可以独立于中枢神经***调控肠道功能，所以也被称作“第二大脑”。
结肠移行性复合运动(CMMCs)是一种自发的、神经源性肠运动模式，通过节律性收缩向肠道远端传播，是离体结肠在无肠道内容物刺激下的最主要运动模式。然而关于调控CMMCs的肠神经环路尚不明了，ENS自主调控肠道运动的特征为体外记录肠道运动以及探索调控肠运动的神经环路提供了研究途径。
自闭症是一类以不同程度的社会交往/交流障碍、重复刻板行为、感知觉异常为主要特征的发育行为障碍性疾病。流行病学数据表明，与正常人群相比，自闭症患儿更易伴发一些其他***并发症，胃肠道疾病尤为显著。与普通人群相比，自闭症患儿胃肠道并发症的发生率在9～70％之间，表现为轻微的胃食管反流、慢性便秘、腹痛和持续性腹泻等症状，便秘约22.2％，腹泻约13％，其他胃肠道症状约46.8％。伴有胃肠道并发症的自闭症患者的住院率是单纯神经源性的四倍，而治疗胃肠道疾病所需的药物剂量通常是正常人群的二倍。总之，大量数据表明自闭症患儿的胃肠道并发症发生率非常高。
尽管自闭症的病因仍不完全明了，但是多数学者认为遗传因素、环境因素在自闭症的发病中起到重要作用。近年来，采用候选基因及全基因组关联研究，发现多个与自闭症有关的致病候选基因，如Shank3、Nlgn3、Nlgn4x等。Shank3是临床发现的一种导致自闭症的高风险基因，位于22号染色体的13.3长臂(22q13.3)，小片段基因缺失或点突变均可导致自闭症发生。Shank3基因编码的SHANK3蛋白主要表达于兴奋性神经元的突触后致密区(PSD)。SHANK3有多个蛋白结构域：ANK、SH3、PDZ(PSD-95/Discs large/Z0-1)、富含脯氨酸结构域和SAM。作为突触后致密复合体的主要支架蛋白，SHANK3与多种突触分子相互作用，参与调节突触发育、谷氨酸能受体信号介导、肌动蛋白聚合、树突棘形成以及神经兴奋-抑制平衡等。
Shank3基因最初被认为与22q13.3缺失综合征(Phelan-McDermid Syndrome，PMS)有关，在超过1000例PMS中有75％以上的患者具有典型的自闭症临床表现。Shank3单倍剂量不足是引起PMS患者神经***突触功能及神经元之间信息传导功能下降的主要原因。SHANK3蛋白除在中枢表达外，在小肠细胞和肠抑制性神经元中也有表达，而且其在Wnt信号通路对ENS发育的调控过程中起重要作用。此外，PMS患者通常表现出反流、周期性呕吐、腹泻和/或便秘等典型胃肠道症状。尽管已有不少关于胃肠道功能障碍的研究，但是直到近几年，探索自闭症与胃肠道疾病之间的关系以及相关胃肠道疾病的发病机制才逐渐引起学术界的关注。因此搭建一套离体观察记录***，在保持小鼠肠组织活性的同时，对肠运动情况进行连续观察记录，将帮助科研工作者探索疾病模型与正常小鼠调控肠功能的神经环路的差异。
目前记录肠运动的方式主要包括离体和在体两种方法。在体方法通常将肠道从体外拉出并固定，将试剂直接滴加在肠道浆膜层，利用动物自身的血液循环维持肠道的体温和营养供应，缺点是容易造成试剂流失，长时间暴露可能造成组织受损而不能正常运动；也有采用隔水恒温加热容纳肠道组织的凹槽进行在体试验的方法，缺点是操作不便，小肠在凹槽中的固定长度、高度及位置难以调整，不能有效去除呼吸及心跳对实验的干扰。离体方法是直接将肠道组织取出，在含有氧气和营养液的环境下，采取恒温装置使组织保持运动活力，在这种条件下组织在体外存活3～4小时(甚至更长时间如过夜)，从而得到相对准确的运动波形，该方法避免了呼吸和心跳对实验的干扰，但是准确性仍有待于提高。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种肠移行性复合运动的离体检测***及其应用，所述离体检测***在保持小鼠肠组织活性的同时，对肠运动情况进行连续观察记录，检测结果准确性高，在研究肠移行性复合运动中具有重要的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肠移行性复合运动的离体检测***，所述离体检测***包括样品固定装置、恒温加热器、储液缸、蠕动泵和废液收集缸；
所述样品固定装置位于所述恒温加热器上；
所述样品固定装置、储液缸和蠕动泵通过管道相连；
所述蠕动泵用于将储液缸中的液体通过进液管泵入样品固定装置中，所述样品固定装置中的液体通过出液管流向废液收集缸中。
本发明中，离体检测***中的样品固定装置、储液缸和蠕动泵通过管道连接形成恒温液体循环***，高度模拟体内环境，延长了组织的存活时间，避免了在体检测方法存在的呼吸、心跳干扰，提高了实验结果的准确性，分离的肠组织固定于样品固定装置中，操作简易，提高了实验的可操作性和成功率。
优选地，所述样品固定装置为硅橡胶容器，优选为黑色硅橡胶容器，硅橡胶底可以很好地固定组织，黑色底色作为背景，提高了拍摄画质，有利于灵敏地捕获肠蠕动。
优选地，所述样品固定装置的外侧壁上设有金属外壳，所述金属外壳用于维持样品固定装置的温度、并保持样品固定装置的位置，避免样品固定装置在检测过程中发生移动。
优选地，所述样品固定装置的侧壁上沿径向开设有进液孔和出液孔，所述进液孔插设有进液管，所述出液孔插设有出液管。
优选地，所述进液孔的垂直高度低于所述出液孔的垂直高度，使得进液孔浸没在液体中，出液孔在液体表面，保证液体的流动性。
优选地，所述储液缸置于水浴锅中，所述水浴锅的温度高于所述恒温加热器的温度。
本发明中，考虑到液体在传输过程中温度会降低，因此将水浴锅的温度设置为高于恒温加热器的温度，使得灌注到样品固定装置中的液体温度合适。
优选地，所述离体检测***还包括供氧装置，用于向储液缸中的液体通入氧气和二氧化碳，使得离体条件最大程度模拟体内环境。
优选地，所述离体检测***还包括摄像机，所述摄像机悬挂设置于所述样品固定装置的上方，用于记录样品固定装置中样品的肠移行性复合运动。
优选地，所述样品固定装置上盖有容器盖，所述容器盖的中心设有矩形镂空结构，有利于拍摄画面处于长方形镂空区域中，使捕捉的肠运动画面更加清晰集中，提高了画面的利用率和数据的分析效率。
第二方面，本发明提供了一种肠移行性复合运动的离体检测方法，所述离体检测方法利用第一方面所述的离体检测***，包括以下步骤：
(1)打开水浴锅和供氧装置，所述供氧装置向储液缸中的Krebs缓冲液通入氧气和二氧化碳；
(2)打开蠕动泵，储液缸中的Krebs缓冲液通过进液管从样品固定装置的进液孔泵入样品固定装置中，所述Krebs缓冲液从出液孔通过出液管流向废液收集缸；
(3)将样品置于装有流动的Krebs缓冲液的样品固定装置中，孵育一段时间后，打开摄像机记录样品的肠移行性复合运动。
优选地，所述水浴锅的温度为45～50℃，例如可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，优选为50℃。
本发明中，考虑到液体在传输过程中温度会降低，因此将水浴锅的温度保持在50℃，确保了灌注到样品固定装置中的液体温度在37℃左右。
优选地，所述氧气和二氧化碳的体积比为(90～98):(2～10)，优选为95:5。
优选地，所述Krebs缓冲液包括100～150mM NaCl、5～10mM KCl、1～5mM MgCl2、1～5mM CaCl2、1～5mM NaH2PO4、10～15mM NaHCO3和10～15mM葡萄糖。
优选地，所述Krebs缓冲液包括120.9mM NaCl、5.9mM KCl、1.2mM MgCl2、2.5mMCaCl2、1.2mM NaH2PO4、14.4mM NaHCO3和11.5mM葡萄糖。
优选地，所述Krebs缓冲液的流速为10～20rpm，例如可以是10rpm、11rpm、12rpm、13rpm、14rpm、15rpm、16rpm、17rpm、18rpm、19rpm或20rpm。
优选地，所述样品包括结肠、十二指肠、空肠或回肠中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述样品固定装置的温度为35～37℃，例如可以是35℃、36℃或37℃。
优选地，所述孵育的时间为20～40min，例如可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min或40min。
作为优选技术方案，所述肠移行性复合运动的离体检测方法包括以下步骤：
(1)打开水浴锅保持45～50℃，打开供氧装置向储液缸中的Krebs缓冲液通入90％～98％氧气和2％～10％二氧化碳；
(2)打开蠕动泵，储液缸中的Krebs缓冲液通过进液管从样品固定装置的进液孔泵入样品固定装置中，所述Krebs缓冲液从出液孔通过出液管流向废液收集缸；
(3)将样品置于装有35～37℃、流速为10～20rpm的流动Krebs缓冲液的样品固定装置中，孵育20～40min，打开摄像机记录样品的肠移行性复合运动。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的离体检测***中的样品固定装置、储液缸和蠕动泵通过管道连接形成恒温液体循环***，配合供氧装置，最大程度模拟了体内环境，使离体组织在条件适宜的缓冲液中保持正常的生理活动，延长了组织的存活时间；
(2)本发明的利用所述离体检测***进行肠移行性复合运动的离体检测方法，消除了呼吸和心跳对结果的影响，记录的运动波形更加准确，所述离体检测方法操作简便、成本低廉、成功率高。
附图说明
图1为离体检测***的结构示意图，红色箭头表示进液方向，蓝色箭头表示出液方向；
图2A为样品固定装置的结构示意图，图2B为铝合金外壳的结构示意图，图2C为容器盖的结构示意图，其中，1-黑色硅橡胶容器、2-铝合金外壳、3-进液孔、4-出液孔，5-中心设有矩形镂空结构的容器盖；
图3A为野生型小鼠结肠蠕动15min的状态，图3B为摄像机记录的数据，箭头表示记录到的结肠蠕动波。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1离体检测***的设计与构建
本实施例提供一种肠移行性复合运动的离体检测***，示意图如图1所示，所述离体检测***包括样品固定装置、恒温加热器、储液缸、蠕动泵和废液收集缸；
所述样品固定装置位于所述恒温加热器上；
所述样品固定装置、储液缸和蠕动泵通过管道相连；
所述蠕动泵用于将储液缸中的液体通过进液管泵入样品固定装置中，所述样品固定装置中的液体通过出液管流向废液收集缸中；
如图2A所示，所述样品固定装置为黑色硅橡胶容器；
所述样品固定装置的外侧壁上设有铝合金外壳，铝合金的内环与样品固定装置的尺寸吻合，用于维持样品固定装置的温度；
如图2B所示，所述样品固定装置和铝合金外壳的侧壁上沿径向开设有进液孔和出液孔，所述进液孔插设有进液管，所述出液孔插设有出液管；
所述进液孔的垂直高度低于所述出液孔的垂直高度；
如图2C所示，所述样品固定装置上盖有容器盖，所述容器盖的中心设有矩形镂空结构；
所述储液缸置于水浴锅中，所述水浴锅的温度高于所述恒温加热器的温度；
所述离体检测***还包括供氧装置，用于向储液缸中的液体通入氧气和二氧化碳；
所述离体检测***还包括摄像机，所述摄像机悬挂设置于所述样品固定装置的上方，用于记录样品固定装置中样品的肠移行性复合运动。
实施例2肠移行性复合运动的离体检测
本实施例采用实施例1的离体检测***进行肠移行性复合运动的离体检测，步骤如下：
(1)配制Krebs缓冲液(120.9mM NaCl、5.9mM KCl、1.2mM MgCl2、2.5mM CaCl2、1.2mM NaH2PO4、14.4mM NaHCO3和11.5mM葡萄糖)，装入储液缸后，打开供氧装置向储液缸通95％O2和5％CO2，同时将储液缸置于水浴锅中保持50℃；
(2)将固定组织用的黑色硅橡胶样品固定装置置于恒温加热器上，调节温度为37℃，打开蠕动泵，使储液缸中的Krebs缓冲液通过进液管从样品固定装置的进液孔泵入样品固定装置中，待Krebs缓冲液充满样品固定装置并没过出液孔后，Krebs缓冲液从出液孔通过出液管流向废液收集缸，蠕动泵持续向样品固定装置中注入Krebs缓冲液，形成液体循环回路，Krebs缓冲液的流速为15rpm；
(3)确认小鼠安乐死后，在小鼠腹部偏左侧距离生殖器纵向线约1cm的地方作为开腹起点，从骨盆至胸骨做垂直切口(约3～4cm)暴露盲肠，顺着盲肠向尾端延伸即为结肠，成年小鼠结肠长约6～7cm，分离小鼠结肠组织，沿着肠系膜清除多余的脂肪组织；
(4)将分离的小鼠结肠组织固定在样品固定装置中，使组织完全浸润在温暖的Krebs缓冲液中，再将样品固定装置放回铝合金环内，盖上中心设有矩形镂空结构的容器盖，30min后打开摄像机，校准摄像机高度，设置视频亮度和对比度，确定视频的存储位置和格式，开始实验记录。
如图3A为野生型小鼠结肠蠕动15min的状态，图3B为摄像机记录的数据，箭头表示记录到的结肠蠕动波。
综上所述，本发明的离体检测***形成恒温液体循环***，模拟体内环境，延长了组织的存活时间，最大程度模拟肠道在体运动状态，避免了在体检测方法存在的呼吸、心跳干扰，提高了实验结果的准确性，在研究肠移行性复合运动中具有重要的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (12)
1.一种利用肠移行性复合运动的离体检测***的检测方法，其特征在于，所述离体检测***包括样品固定装置、恒温加热器、储液缸、蠕动泵和废液收集缸；
所述样品固定装置位于所述恒温加热器上；
所述样品固定装置、储液缸和蠕动泵通过管道相连；
所述蠕动泵用于将储液缸中的液体通过进液管泵入样品固定装置中，所述样品固定装置中的液体通过出液管流向废液收集缸中；
所述样品固定装置为黑色硅橡胶容器；
所述样品固定为单侧固定；
所述样品固定装置上盖有容器盖，所述容器盖的中心设有矩形镂空结构；
所述样品固定装置的外侧壁上设有金属外壳，所述金属外壳用于维持样品固定装置的温度；
所述样品固定装置的侧壁上沿径向开设有进液孔和出液孔，所述进液孔插设有进液管，所述出液孔插设有出液管；
所述进液孔的垂直高度低于所述出液孔的垂直高度；
所述检测方法包括以下步骤：
(1)打开水浴锅和供氧装置，所述供氧装置向储液缸中的Krebs缓冲液通入氧气和二氧化碳；
(2)打开蠕动泵，储液缸中的Krebs缓冲液通过进液管从样品固定装置的进液孔泵入样品固定装置中，所述Krebs缓冲液从出液孔通过出液管流向废液收集缸；
(3)将样品置于装有流动的Krebs缓冲液的样品固定装置中，孵育一段时间后，打开摄像机记录样品的肠移行性复合运动；
所述Krebs缓冲液的流速为10～20rpm。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述储液缸置于水浴锅中，所述水浴锅的温度高于所述恒温加热器的温度。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述离体检测***还包括供氧装置，用于向储液缸中的液体通入氧气和二氧化碳。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述离体检测***还包括摄像机，所述摄像机悬挂设置于所述样品固定装置的上方，用于记录样品固定装置中样品的肠移行性复合运动。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水浴锅的温度为45～50℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氧气和二氧化碳的体积比为(90～98):(2～10)。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Krebs缓冲液包括100～150mMNaCl、5～10mM KCl、1～5mM MgCl2、1～5mM CaCl2、1～5mM NaH2PO4、10～15mM NaHCO3和10～15mM葡萄糖。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述Krebs缓冲液包括120.9mM NaCl、5.9mM KCl、1.2mM MgCl2、2.5mM CaCl2、1.2mM NaH2PO4、14.4mM NaHCO3和11.5mM葡萄糖。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品包括结肠、十二指肠、空肠或回肠中的任意一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品固定装置的温度为35～37℃。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的时间为20～40min。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述离体检测方法包括以下步骤：
(1)打开水浴锅保持45～50℃，打开供氧装置向储液缸中的Krebs缓冲液通入90％～98％氧气和2％～10％二氧化碳；
(2)打开蠕动泵，储液缸中的Krebs缓冲液通过进液管从样品固定装置的进液孔泵入样品固定装置中，所述Krebs缓冲液从出液孔通过出液管流向废液收集缸；
(3)将样品置于装有35～37℃、流速为10～20rpm的流动Krebs缓冲液的样品固定装置中，孵育20～40min，打开摄像机记录样品的肠移行性复合运动。
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