CN112708150A - 用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，该水凝胶体系通过以下方法制备得到：1)制备Ti3C2Tx二维材料；2)利用Ti3C2Tx二维材料制备Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液；3)利用Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液和明胶制备水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。本发明的水凝胶体系具备较好的光响应、热稳定性和细胞粘附力，通过对水凝胶膜的表面修饰偶联抗体，能实现对循环肿瘤细胞的特异性捕获；本发明的水凝胶体系在特定波长的激光照射下可快速升温，从而可以实现循环肿瘤细胞的定点释放。

Description

用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系
技术领域
本发明涉及生物水凝胶米材料领域，特别涉及一种用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系。
背景技术
循环稀有细胞对材料研究和临床应用具有重要意义。其中，如循环肿瘤细胞是肿瘤“液体活检”的生物标记物；识别、提取循环胎儿有核红细胞实现无创性产前诊断；其他如循环干细胞、内皮细胞等在临床诊断方面同样具备各自的潜在指标应用。然而，在丰富的血液细胞背景下，表征和分离丰度极低的循环稀有细胞具备一定的挑战性，如何有效捕获和分离循环稀有细胞是目前生物及医学领域的重点研究目标。
近几年来，水凝胶由于其可调节的特性、固有的生物相容性以及与生物组织和细胞环境的相似性等特点使得其在细胞识别捕获领域得到了广泛的研究及应用。其中，光敏水凝胶体系基于光具备时间、空间以及强度可控的特点，提高了该材料体系应用的可能性。光敏水凝胶体系具有应用于循环肿瘤细胞捕获、分离的潜力，但现在缺少可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，该水凝胶体系通过以下方法制备得到：
1)制备Ti3C2Tx二维材料；
2)利用Ti3C2Tx二维材料制备Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液；
3)利用Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液和明胶制备水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。
优选的是，所述步骤1)中通过酸性溶液刻蚀的方法制备Ti3C2Tx材料，具体包括：将氟化锂溶于HCl溶液中，搅拌，再向溶液中加入MAX-Ti3AlC2，加热搅拌，反应得到Ti3C2Tx二维材料。
优选的是，所述步骤2)具体包括：将步骤1)得到的Ti3C2Tx二维材料进行离心清洗，然后干燥，将得到的产物溶于去离子水中，超声分散，得到Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液。
优选的是，所述步骤1)具体包括：将0.666g氟化锂溶于10ml浓度为6M的HCl溶液中，搅拌40分钟，预热至35℃，再向溶液中加入1g MAX-Ti3AlC2，加热搅拌，反应24小时，得到Ti3C2Tx二维材料。
优选的是，所述步骤2)具体包括：将步骤1)得到的Ti3C2Tx二维材料按照乙醇-水-乙醇的顺序进行3次离心清洗，每次10min，3次离心转速均为3500r.p.m；得到的底物置于真空干燥箱中于50℃下干燥6小时，称取10mg干燥得到的产物溶于10ml去离子水中，超声分散1小时，得到Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液。
优选的是，所述步骤3)具体包括：
将ITO导电玻璃进行超声清洗后晾干备用；
将步骤2)得到的Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液搅拌并预热，向其中加入明胶，反应，得到Ti3C2Tx-gelatin溶液；
将晾干后的ITO导电玻璃置于干净的平台表面，吸取Ti3C2Tx-gelatin溶液均匀涂抹于玻璃的一端，到表明平整、厚度均一的水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。
优选的是，所述步骤3)具体包括：
将ITO导电玻璃按照甲苯-丙酮-乙醇-去离子水的顺序进行超声清洗，自然晾干后备用；
将步骤2)得到的Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液置于单口烧瓶中，搅拌并预热至40℃，向其中加入2g明胶，反应30分钟，得到Ti3C2Tx-gelatin溶液；
将晾干后的ITO导电玻璃置于干净的平台表面，吸取500μl Ti3C2Tx-gelatin溶液均匀涂抹于玻璃的一端，得到表明平整、厚度均一的水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。
优选的是，该水凝胶体系用于循环肿瘤细胞的捕获的方法为：将水凝胶体系与循环肿瘤细胞的目标体系混合，通过水凝胶体系上的EpCAM抗体与循环肿瘤细胞特异性结合从而实现对循环肿瘤细胞的捕获。
优选的是，该水凝胶体系用于循环肿瘤细胞定点释放的方法为：对于已经捕获循环肿瘤细胞的水凝胶体系，采用808nm激光源进行定点照射；水凝胶体系因光热效应而升温，从而释放其捕获的循环肿瘤细胞。
Ti3C2Tx金属碳氮化物作为MXene二维材料家族的一员，具有突出的光热性能，在808nm近红外光的照射下可达到30％的光热转换效率，且具备优异的热稳定性，是构建光热-温敏水凝胶体系的理想光热媒介体。明胶是由胶原蛋白部分水解衍生而来的天然大分子材料，具有良好的生物相容性并在一定程度上保留了胶原蛋白的氨基酸序列，可以促进细胞粘附、增殖及分化，从而在生物领域得到了广泛的应用。
本发明结合了Ti3C2Tx二维材料和明胶的特点，成功构建可实现近红外响应的光敏水凝胶体系，可用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放。本发明提供了一种光热分子-温敏水凝胶构成的光敏水凝胶体系，通过偶联EpCAM抗体，从而可特异性捕获循环肿瘤细胞；通过光热转换分子将光照转换为热量，达到温敏水凝胶的相转变温度，实现相转变，从而可释放捕获的循环肿瘤细胞。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的水凝胶体系具备较好的光响应、热稳定性和细胞粘附力，通过对水凝胶膜的表面修饰偶联抗体，能实现对循环肿瘤细胞的特异性捕获；
(2)本发明的水凝胶体系在特定波长的激光照射下可快速升温，从而可以实现循环肿瘤细胞的定点释放。
附图说明
图1为本发明的实施例中的MXene-Gel水凝胶的扫描电镜照片；
图2为本发明的实施例中的Ti3C2Tx材料的XRD检测结果以及MXene-Gel水凝胶的XPS检测结果；
图3为本发明的实施例中的MXene-Gel水凝胶的紫外可见吸收光谱图；
图4为本发明的实施例中的MXene-Gel水凝胶在808nm近红外光照射下的光热曲线以及光照-冷却循环稳定性结果；
图5为本发明的实施例中的MXene-Gel水凝胶的细胞毒性测试结果；
图6为本发明的实施例中的MXene-Gel水凝胶用于捕获A549细胞及在808nm激光照射后释放细胞的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例的提供一种用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，该水凝胶体系通过以下方法制备得到：
1)制备Ti3C2Tx二维材料
首先配制6M盐酸(HCl)水溶液备用，量取10ml HCl溶液于烧杯中，称取0.666g氟化锂(LiF)溶于HCl溶液中，置于搅拌台搅拌40分钟；将得到的溶液从烧杯中移出倒入单口烧瓶中，置于油浴锅中35℃搅拌预热，称取1g MAX-Ti3AlC2溶于该烧瓶溶液，加热搅拌反应24小时，生成Ti3C2Tx材料。
2)利用Ti3C2Tx二维材料制备Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液
将步骤1)得到的Ti3C2Tx二维材料(黑色溶液)按照乙醇-水-乙醇的顺序进行3次离心清洗，每次10min，3次离心转速均为3500r.p.m；得到的黑色底物置于真空干燥箱中于50℃下干燥6小时，得到黑色粉末产物；称取10mg黑色粉末产物溶于10ml去离子水中，超声分散1小时，得到Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液。
3)利用Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液和明胶制备水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。
选取1*1cm的ITO导电玻璃，按照甲苯-丙酮-乙醇-去离子水的顺序进行超声清洗，自然晾干后备用；
将步骤2)得到的Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液置于单口烧瓶中，在油浴锅中40℃下搅拌预热，向其中加入2g明胶(gelatin)，反应30分钟，得到Ti3C2Tx-gelatin溶液；
将晾干后的ITO导电玻璃置于干净的平台表面，吸取500μl Ti3C2Tx-gelatin溶液均匀涂抹于玻璃的一端，快速刮涂，得到表明平整、厚度均一的水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系：MXene-Gel水凝胶。
参照图1为MXene-Gel水凝胶的扫描电镜照片，图1a为表面图像，图1b为断面图像，从图中可以看出，本实施例制得的MXene-Gel水凝胶具备典型的三维网络结构，膜层均匀平整，且厚度大约为20μm。
图2(a)为Ti3AlC2和本实施例制得的的Ti3C2Tx材料的XRD检测结果，图2(b)为实施例制得的的Ti3C2Tx和MXene-Gel水凝胶(即图中的Ti3C2Tx MXene/gelatin)的XPS检测结果；从检测结果可以看出，通过HF刻蚀的方法成功制备得到了Ti3C2Tx，其(002)，(004)，(006)以及(202)晶面分别对应于7.1°,14.4°,28.9°和36.1°处的特征峰，综合XPS表征结果表明在明胶中引入了Ti3C2Tx二维材料。
图3为MXene-Gel水凝胶的紫外可见吸收光谱图，可以看出，MXene-Gel水凝胶的紫外吸收光谱在800nm左右具有吸收峰。
图4(a)为MXene-Gel水凝胶在808nm近红外光照射下的光热曲线，可以看出MXene-Gel水凝胶具有显著的光热效应，对其进行波长为808nm的激光照射，短时间内可快速升温至47℃左右，并在10min内达到稳定；而Gel(明胶)单独存在时无光热效应。图4(b)为MXene-Gel水凝胶的光照-冷却循环稳定性检测结果，采用808nm激光器对MXene-Gel水凝胶进行连续六次的光照-降温-光照的循环测试，从检测结果可以看出，所制得的MXene-Gel水凝胶在连续的光照测试中依旧具备光响应性能，且光热转换致温度升高的效应几乎不变。
本实施例还进行了MXene-Gel水凝胶体系的细胞毒性测试：
配制不同浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/ml)的MXene-Gel溶液，将其与A549细胞共同孵育24h，采用MTT比色法测定细胞活性，表征MXene/Gel的细胞毒性。参照图5为A549细胞在MXene-Gel水凝胶表面共孵育24h后的细胞存活率，结果表面该水凝胶膜用于细胞捕获孵育具备较好的生物安全性，细胞存活率可达到90％。
本发明的MXene-Gel水凝胶体系可用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放，该水凝胶体系在循环肿瘤细胞的检测、分离、分析等方面具有很好的潜在应用前景。
该水凝胶体系用于循环肿瘤细胞的捕获的方法为：将水凝胶体系与循环肿瘤细胞的目标体系混合，通过水凝胶体系上的EpCAM抗体与循环肿瘤细胞特异性结合从而实现对循环肿瘤细胞的捕获。该水凝胶体系用于循环肿瘤细胞定点释放的方法为：对于已经捕获循环肿瘤细胞的水凝胶体系，采用808nm激光源进行定点照射；水凝胶体系因光热效应而升温，使得水凝胶体系发生相转变(凝胶态转变为液态)，从而释放其捕获的循环肿瘤细胞。
本实施例中，MXene-Gel水凝胶体系捕获释放循环肿瘤细胞的具体步骤为：
准备细胞浓度为1×105个的细胞液，吸取1ml细胞液滴在实施例1制备的MXene-Gel水凝胶体系表面，共同孵育1h，随后对细胞进行清洗染色；通过荧光显微镜观察MXene-Gel水凝胶体系表面的细胞捕获情况，并随机选取20个不同的区域进行捕获细胞数计算(结果)。然后，采用808nm激光源进行定点照射，观察分析水凝胶膜表面光热释放细胞的情况。参照图6(a)，为本实施例制得的MXene-Gel水凝胶用于捕获A549细胞的结果，可以看出其实现了A549细胞的有效捕获；图6(a)为捕获了A549细胞的MXene-Gel水凝胶在808nm激光照射后释放细胞的结果(图中的点即为捕获的经荧光标记的A549细胞)，从图中可以看出，808nm激光照射后，MXene-Gel水凝胶捕获的A549细胞基本都被释放了，说明本实施例制得的MXene-Gel水凝胶成功实现了A549细胞的捕获和释放。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (9)

1.一种用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，该水凝胶体系通过以下方法制备得到：
1)制备Ti3C2Tx二维材料；
2)利用Ti3C2Tx二维材料制备Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液；
3)利用Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液和明胶制备水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。
2.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，所述步骤1)中通过酸性溶液刻蚀的方法制备Ti3C2Tx材料，具体包括：将氟化锂溶于HCl溶液中，搅拌，再向溶液中加入MAX-Ti3AlC2，加热搅拌，反应得到Ti3C2Tx二维材料。
3.根据权利要求2所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，所述步骤2)具体包括：将步骤1)得到的Ti3C2Tx二维材料进行离心清洗，然后干燥，将得到的产物溶于去离子水中，超声分散，得到Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液。
4.根据权利要求3所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，所述步骤1)具体包括：将0.666g氟化锂溶于10ml浓度为6M的HCl溶液中，搅拌40分钟，预热至35℃，再向溶液中加入1g MAX-Ti3AlC2，加热搅拌，反应24小时，得到Ti3C2Tx二维材料。
5.根据权利要求4所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，所述步骤2)具体包括：将步骤1)得到的Ti3C2Tx二维材料按照乙醇-水-乙醇的顺序进行3次离心清洗，每次10min，3次离心转速均为3500r.p.m；得到的底物置于真空干燥箱中于50℃下干燥6小时，称取10mg干燥得到的产物溶于10ml去离子水中，超声分散1小时，得到Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液。
6.根据权利要求5所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，所述步骤3)具体包括：
将ITO导电玻璃进行超声清洗后晾干备用；
将步骤2)得到的Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液搅拌并预热，向其中加入明胶，反应，得到Ti3C2Tx-gelatin溶液；
将晾干后的ITO导电玻璃置于干净的平台表面，吸取Ti3C2Tx-gelatin溶液均匀涂抹于玻璃的一端，到表明平整、厚度均一的水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。
7.根据权利要求6所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，所述步骤3)具体包括：
将ITO导电玻璃按照甲苯-丙酮-乙醇-去离子水的顺序进行超声清洗，自然晾干后备用；
将步骤2)得到的Ti3C2Tx单层纳米片悬浮液置于单口烧瓶中，搅拌并预热至40℃，向其中加入2g明胶，反应30分钟，得到Ti3C2Tx-gelatin溶液；
将晾干后的ITO导电玻璃置于干净的平台表面，吸取500μl Ti3C2Tx-gelatin溶液均匀涂抹于玻璃的一端，得到表明平整、厚度均一的水凝胶膜，再对水凝胶膜进行表面羧基化修饰，偶联EpCAM抗体后获得所述水凝胶体系。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，该水凝胶体系用于循环肿瘤细胞的捕获的方法为：将水凝胶体系与循环肿瘤细胞的目标体系混合，通过水凝胶体系上的EpCAM抗体与循环肿瘤细胞特异性结合从而实现对循环肿瘤细胞的捕获。
9.根据权利要求8所述的用于循环肿瘤细胞的捕获及定点释放的水凝胶体系，其特征在于，该水凝胶体系用于循环肿瘤细胞定点释放的方法为：对于已经捕获循环肿瘤细胞的水凝胶体系，采用808nm激光源进行定点照射；水凝胶体系因光热效应而升温，从而释放其捕获的循环肿瘤细胞。
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