CN112691090A - 抗微生物制剂的局部使用 - Google Patents

Abstract

本文描述了一种通过向所述主体的部分局部应用抗微生物制剂，减少在主体的至少一部分上的微生物存在的方法，所述抗微生物制剂包括：a)至少一种抗微生物的分离或合成的源于天然的酚类化合物，所述酚类化合物选自百里香酚和香芹酚；b)至少一种足以形成所述酚类化合物在水性载体中的溶液或分散液的表面活性剂；c)溶解所述酚类化合物的溶剂；以及d)足够的水性载体的量以达到100％(w/w)。

Description

抗微生物制剂的局部使用

本申请是申请日为2014年3月4日，申请号为201480024635.3，发明名称为“抗微生物制剂的局部使用”的中国专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请根据美国法典第35条119(e)款要求2013年3月8日提交的美国专利申请13/790911的优先权，其说明书通过引用被纳入到本文中。

背景技术

(a)领域

公开的主题通常涉及一种通过向主体的部分局部施用足够减少微生物存在的时间的抗微生物制剂来减少活的主体的部分上存在的微生物的方法。

(b)相关现有技术

病原体例如真菌、病毒、细菌和细菌芽胞是人类多血症和动物健康问题，以及食品、生物和环境样品污染形成的主要原因。微生物感染的第一步一般是附着或定殖在皮肤或粘膜上，接下来是感染的微生物的入侵和传播。病原菌的侵入门户主要是皮肤和粘膜。

尽管在现代在卫生和感染预防方面有了改进，但是人类和家畜的健康日益成为公共健康的重要话题。这部分归因于由于旅游和全球互动导致的由细菌、病毒和真菌引起的感染增加的事实。

有效的疾病预防是保持人类健康和动物种群的关键。多年来，疫苗的改进和有效性对大量疾病的预防有很大的帮助。然而，即使已接种疫苗的人类和动物种群在严峻的挑战下也能死亡。而且，由于疫苗不可能用于所有的可被预防的疾病，计划和监控生物安全项目，加上有效的消毒和疫苗接种项目对保持这些群体的健康是必不可少的。

在终端消毒的过程和持续进行的卫生保养方面，抗微生物制剂在任何生物安全体系中都扮演着重要的角色。除了在制剂方面相对较小的变化和改进以外，15到20年来，在人类或家畜抗的微生物制剂以及大面积抗微生物制剂开发方面，很少有创新。

目前很多抗微生物制剂，包括消毒杀菌剂和消毒剂，都含有非天然存在的抗微生物剂。在消毒杀菌剂和消毒剂中使用的典型的抗微生物剂包括化学消毒剂，例如酚类化合物、季胺类化合物、甲醛和含卤素的化合物。这些材料不是天然来源的(即不是在自然界中发现的)，而是通过化学工艺和合成被制备的。许多这些合成的消毒剂对环境和人类健康产生不良的影响。

Benefect的天然洗手液是一种基于百里香油的洗手剂。因此，Benefect的产品能被用施用于人体肌肤来消毒双手。虽然这是一种基于百里香油的用于人类皮肤局部应用的抗微生物药剂，但其不包括与表面活性剂、溶剂以及水性载体结合的抗微生物的、分离的或合成的源于天然的酚类化合物，所述溶剂用于溶解所述酚类化合物。

根据详细的产品材料安全数据表，CleanWell的消毒洗手液含有0.05％的作为一种组分的百里香油以及柠檬酸。虽然这是一种基于百里香油的用于人类皮肤局部应用的抗微生物药剂，但其不包括与表面活性剂、溶剂以及水性载体结合的抗微生物的、分离的或合成的源于天然的酚类化合物，所述溶剂用于溶解所述酚类化合物。

国际申请号WO 2010/010320公开了包括100％的香芹酚、百里香酚和对异丙基苯甲烷的组合物的用途，所述组合物由于具有广谱的抗微生物活性而仅作为治疗剂或消毒剂。然而，该文件没有教导抗微生物的、分离的或合成的源于天然的酚类化合物与表面活性剂、溶剂以及水性载体结合的局部应用，所述溶剂用于溶解酚类化合物。

美国专利号8293286公开了一种用于杀灭寄生虫的方法，包括向伴侣动物局部施用包括天然的、非合成的活性组分的组合物的步骤。然而，所公开的组合物包括例如水杨酸甲酯和香草醛的成分。可是，该文件没有教导抗微生物的、分离的或合成的源于天然的酚类化合物与表面活性剂、溶剂以及水性载体结合的局部应用，所述溶剂用于溶解酚类化合物。

美国专利号6884763公开了一种无水洗手液制剂，其包括有机溶剂、一定量的水和表面活性剂，所述表面活性剂存在的目的是形成胶状乳化液。所述胶状乳化液负载具有局部抗微生物活性的天然基础油的总重量百分数的0.1-25％。然而，该文件没有教导抗微生物的分离的或合成的源于天然的酚类化合物与表面活性剂、溶剂以及水性载体结合的局部应用，所述溶剂用于溶解酚类化合物。

美国专利公开号2011/0223114公开了一种抗微生物组合物。其特别涉及一种用于清洁或个人护理的抗微生物组合物。然而，该文件没有教导抗微生物的、分离的或合成的源于天然的酚类化合物与表面活性剂、溶剂以及水性载体结合的局部应用，所述溶剂用于溶解酚类化合物。

美国专利公开号2010/0272818公开了特别适用于治疗植物感染的包括萜烯的组合物、制造该组合物的方法和使用它们的方法。然而，公开的组合物是液态、小球状或药片的形式，并且可包括中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

美国专利公开号2011/0206790公开了一种基于天然基础油的、用作抗微生物物质的发泡组合物，其包括作为抗微生物剂的精油。此外，所述组合物还包括二价铜离子源。

美国专利公开号2009/0258098公开了一种用于局部治疗皮肤寄生虫感染和次级细菌感染的抗真菌组合物和渗透载体***。所述组合物包括赋形剂、渗透促进剂和至少一种抗真菌基础油成分。

另外，美国专利公开号2009/0269394公开了一种用于治疗和完全治愈人类主体中的真菌、酵母和/或霉菌感染的方法，包括向需要的人类主体局部施用抗真菌纳米乳组合物。所述组合物包括液相和约1％-80％的基础油。

因此，仍然需要一种改进的、用于减少在活的主体中局部存在的微生物而对健康无害且没有现有技术缺点的方法。

发明内容

根据一个具体实施方式，提供了一种减少在活的主体的至少一部分上的微生物存在的方法，包括向主体部分局部施用抗微生物制剂足够的时间以减少微生物存在，所述抗微生物制剂包括：

a)一种抗微生物的分离或合成的源于天然的酚类化合物，所述酚类化合物选自百里香酚和香芹酚构成的组；

b)足以形成所述酚类化合物在水性载体中的溶液或分散液的至少一种阴离子、阳离子、两性的、非离子的表面活性剂或其组合；

c)用于溶解所述酚类化合物的溶剂；以及

d)足够的水性载体的量以达到100％(w/w)。

所述制剂可包括约0.05％至约25％(w/w)的酚类化合物。

所述制剂可包括约0.1％至约15％(w/w)的表面活性剂。

所述制剂可包括约0.1％至约40％(w/w)的溶剂。

所述酚类化合物可以是百里香酚。

所述表面活性剂可选自月桂基磺酸钠、硬脂酸己六酯、月桂醇聚醚硫酸酯钠、十二烷基肌酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱(CAPB)、月桂基醚磺酸钠、烷基苯磺酸盐、壬基酚聚氧乙烯醚、脱水山梨糖醇酯和醚乙氧基化物构成的组。

活的主体的部分可以是皮肤、四肢、头、耳朵、鼻子、手、足、黏膜、蹄或其结合的一部分。

主体可以是哺乳动物或家禽。

减少微生物存在可以用于预防或治疗选自腐蹄病、蹄烫伤、蹄脓肿或其结合的疾病。

可以采用喷雾、足浴、直接施用、涂抹、乳霜、药膏和软膏来进行局部应用。

微生物存在的减少可以用于预防或治疗选自皮肤损伤、附件的疾病、细菌感染和真菌感染的疾病。

细菌感染可以是沙门氏菌感染、大肠杆菌感染、葡萄球菌感染、螺旋体感染、脓疱病、深脓疱病、痈病、毛囊炎、丹毒、气单胞菌感染、非洲蜱咬热、美洲蜱咬热、溶血隐秘杆菌感染、杆菌性血管瘤病、非性病梅毒、类芽生菌脓皮病、水疱性远端指炎、葡萄状菌病、勃秦氏病、布鲁氏菌病、大疱性脓疱病、溃疡、猫抓病、下疳、软下疳、衣原体感染、慢性***炎、慢性复发性丹毒、慢性穿凿性窦道性溃疡、色素杆菌病感染、***、皮肤放线菌病、皮肤炭疽病感染、皮肤白喉感染、B组链球菌皮肤感染、溶血性巴氏杆菌皮肤感染、海豚链球菌皮肤感染、坏疽性皮炎、沙漠疮、蹄炎(digital dermatitis)、坏疽性深脓疱病、伊氏埃立克体感染、慢性链球菌性淋巴水肿、地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒、丹毒、罗森巴赫类丹毒、风湿性环状红疹、红癣、外耳炎、甲沟炎、跳蚤传染的斑点热、弗林德斯岛斑疹热、飞鼠斑疹伤寒、毛囊炎、脚脓肿、富尼埃坏疽、疔疮、气性坏疽、鼻疽、革拉泽氏病、***血症、淋病、革兰氏阴性菌毛囊炎、革兰阴性趾蹼感染、***、***、JK组棒状杆菌败血症、流感嗜血杆菌性蜂窝组织炎、幽门螺杆菌性蜂窝组织炎、医院疔疮、热水浴毛囊炎、人粒细胞无形体病、人粒细胞埃立克体病、触染性脓疱病、感染性脂腺、指间皮炎、腐蹄病、意大利脚腐病、日本斑点热、关节病、钩端螺旋体病、单核细胞增生李斯特菌感染、李斯特菌病、脓性颌下炎、狼疮样须疮、莱姆病、性病淋巴肉芽肿、软化斑、地中海斑疹热、类鼻疽、脑膜炎球菌血症、密苏里莱姆病、支原体感染、坏死性筋膜炎、新生儿中毒性休克样发疹性疾病、诺卡菌病、新生儿坏疽性口炎、北亚蜱传斑疹伤寒、新生儿眼炎、丹毒、奥罗亚热、巴斯德菌病、根尖周脓肿、品他病、窝状角质松解症、瘟疫、蹄皮炎、原发性***性皮炎、假单胞菌脓皮病、假单胞菌热脚综合症、化脓性甲沟炎、多肌炎、Q热、昆士兰斑疹伤寒、鼠咬热、复发性毒素介导的***部红斑、鼻硬结病、埃氏立克次氏体感染(rickettsia aeschlimanniiinfection)、立克次氏体痘、跗骨赘、落基山斑疹热、军刀状胫、鞍鼻、沙门氏菌病、猩红热、***、志贺氏菌病、葡萄球菌皮肤烫伤样综合症、链球菌性间擦疹、超级脚腐病、浅表性脓疱性毛囊炎、寻常性须疮、***、梅毒、蹄叉腐疽、蜱传播***病、中毒性休克综合症、战壕热、热带溃疡、野兔病、秘鲁疣、创伤弧菌感染或雅司病中的一种。

皮肤损伤可以是溃疡、糖尿病性溃疡、疔疮、痈、龟裂、破裂或水肿中的一种。

根据另一个实施方式，提供了一种减少在活的主体的至少一部分上的微生物存在的方法，包括向主体部分局部应用抗微生物制剂足够的时间以减少微生物存在，所述抗微生物制剂由以下组分组成：

a)一种抗微生物的分离或合成的源于天然的酚类化合物，所述酚类化合物选自百里香酚和香芹酚构成的组；

b)足以形成酚类化合物在水性载体中的溶液或分散液的至少一种阴离子、阳离子、两性的、非离子的表面活性剂或其组合；

c)用于溶解酚类化合物的溶剂；以及

d)足够的水性载体的量以达到100％(w/w)，以及

-掩蔽剂、

-基础油和

-芳香剂中的至少一种。

所述制剂可包括约0.01％至约10％(w/w)的掩蔽剂。

所述掩蔽剂可以选自乙二胺四乙酸(EDTA)钠盐、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸、NTA三钠、环氧琥珀酸三钠、磷酸钠和胆酸钠构成的组。

所述精油可以选自牛至油、百里香油和桉叶油构成的组。

所述精油可以为制剂的约0.0001％至约4％(w/w)。

所述制剂可以包括从约0.05％至约25％(w/w)的酚类化合物。

所述制剂可以包括从约0.1％至约15％(w/w)的表面活性剂。

所述制剂可以包括从约0.1％至约40％(w/w)的溶剂。

所述酚类化合物可以是百里香酚。

所述表面活性剂可以选自月桂基磺酸钠、硬脂酸己六酯、月桂醇聚醚硫酸酯钠、十二烷基肌酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱(CAPB)、月桂基醚磺酸钠、烷基苯磺酸盐、壬基酚聚氧乙烯醚、脱水山梨糖醇酯和醚乙氧基化物构成的组。

所述芳香剂可以是柠檬醛。

所述活的主体的部分可以是皮肤、四肢、头、耳朵、鼻子、手、足、黏膜、蹄或其结合中的一种。

所述主体可以是哺乳动物或家禽。

减少微生物存在可以用于预防或治疗选自腐蹄病、蹄烫伤、蹄脓肿或其结合的疾病。

可以采用喷雾、沐浴、足浴、直接使用、涂抹、乳霜、药膏和软膏来进行局部应用。

微生物存在的减少可以用于预防或治疗选自皮肤损伤、附件的疾病、细菌感染和真菌感染的疾病。

细菌感染可以是沙门氏菌感染、大肠杆菌感染、葡萄球菌感染、螺旋体感染、脓疱病、深脓疱病、痈病、毛囊炎、丹毒、气单胞菌感染、非洲蜱咬热、美洲蜱咬热、溶血隐秘杆菌感染、杆菌性血管瘤病、非性病梅毒、类芽生菌脓皮病、水疱性远端指炎、葡萄状菌病、勃秦氏病、布鲁氏菌病、大疱性脓疱病、溃疡、猫抓病、下疳、软下疳、衣原体感染、慢性***炎、慢性复发性丹毒、慢性穿凿性窦道性溃疡、色素杆菌病感染、***、皮肤放线菌病、皮肤炭疽病感染、皮肤白喉感染、B组链球菌皮肤感染、溶血性巴氏杆菌皮肤感染、海豚链球菌皮肤感染、坏疽性皮炎、沙漠疮、蹄炎、坏疽性深脓疱病、伊氏埃立克体感染、慢性链球菌性淋巴水肿、地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒、丹毒、罗森巴赫类丹毒、风湿性环状红疹、红癣、外耳炎、甲沟炎、跳蚤传染的斑点热、弗林德斯岛斑疹热、飞鼠斑疹伤寒、毛囊炎、脚脓肿、富尼埃坏疽、疔疮、气性坏疽、鼻疽、革拉泽氏病、***血症、淋病、革兰氏阴性菌毛囊炎、革兰阴性趾蹼感染、***、***、JK组棒状杆菌败血症、流感嗜血杆菌性蜂窝组织炎、幽门螺杆菌性蜂窝组织炎、医院疖病、热水浴毛囊炎、人粒细胞无形体病、人粒细胞埃立克体病、触染性脓疱病、感染性脂腺、指间皮炎、腐蹄病、意大利脚腐病、日本斑点热、关节病、钩端螺旋体病、单核细胞增生李斯特菌感染、李斯特菌病、脓性颌下炎、狼疮样须疮、莱姆病、性病淋巴肉芽肿、软化斑、地中海斑疹热、类鼻疽、脑膜炎球菌血症、密苏里莱姆病、支原体感染、坏死性筋膜炎、新生儿中毒性休克样发疹性疾病、诺卡菌病、新生儿坏疽性口炎、北亚蜱传斑疹伤寒、新生儿眼炎、丹毒、奥罗亚热、巴斯德菌病、根尖周脓肿、品他病、窝状角质松解症、瘟疫、蹄皮炎、原发性***性皮炎、假单胞菌脓皮病、假单胞菌热脚综合症、化脓性甲沟炎、多肌炎、Q热、昆士兰斑疹伤寒、鼠咬热、复发性毒素介导的***部红斑、鼻硬结病、埃氏立克次氏体感染、立克次氏体痘、跗骨赘、落基山斑疹热、军刀状胫、鞍鼻、沙门氏菌病、猩红热、***、志贺氏菌病、葡萄球菌性烫伤样皮肤综合症、链球菌性间擦疹、超级脚腐病、浅表性脓疱性毛囊炎、寻常性须疮、***、梅毒、蹄叉腐疽、蜱传播***病、中毒性休克综合症、战壕热、热带溃疡、野兔病、秘鲁疣、创伤弧菌感染或雅司病中的一种。

以下术语被定义如下。

术语“约”意指使用装置或方法来测定的数值的误差的固有变异性。

术语“硬水”意指具有高浓度溶解的矿物和固体的水。

术语“酚类化合物”、“源于天然”、“源于天然的酚类化合物”意指存在于或产生于自然界的酚类化合物。该酚类化合物可通过任何适当的手段从它们的自然环境中被提取或分离出来。当然，该酚类化合物也可通过人为被合成生产出来。这样合成的等价物在“源于天然”的定义的范围内。重要的是要注意在所述制剂包括一种以上的酚类化合物的结合的情况中，所述的结合将不是由i-香芹酚、百里香酚和对伞花烃或ii-百里香酚和松油醇一起或与其他酚类化合物结合而组成。

术语“附件”意指从有机体的身体伸出来的外部身体部分或自然延伸的部分，例如胳膊、手、腿、足、蹄、性器官、尾巴、耳朵、鼻子、***等。

术语“皮肤”意指脊椎动物的柔软外层。在哺乳动物中，皮肤是由多层外胚层组织构成的皮肤***的最大的器官，防护下层的肌肉、骨骼、韧带和内脏。其包括表皮、真皮和下皮，以及毛发和毛皮。

术语“局部的”或“局部地”意指主体的身体和身体的表面，包括皮肤和/或黏膜，以及由皮肤覆盖的附件。

术语“足够的时间”意指获得期望的治疗或预防结果的任何必须的时间。例如，时间可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、30、60秒或分钟，或1.5、2、3、4、5、6或更多的小时。足够的时间还可以是治疗的多次重复。

当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”一起使用时，使用的词“一种”可以是“一种”，也可与“一种或多种”、“至少一种”、以及“一种或多余一种”的意思相一致。类似地，词语“另一种”的意思可以是至少第二种或更多种。

如在该说明书和权利要求中使用的，词语分词形式的“包括”(以及任何形式的包括，例如动词形式的“包括”和动词单数形式的“包括”)、分词形式的“具有”(以及任何形式的具有，例如动词形式的“具有”和动词单数形式的“具有”、分词形式的“包含”(以及任何形式的包含，例如动词形式的“包含”和动词单数形式的“包含”)或分词形式的“含有”(以及任何形式的含有，例如动词形式的“含有”和动词单数形式的“含有”)，是包罗广泛的或开放的以及不排除其他的未引入的成分或方法步骤。根据如下有选择的实施例的详细地描述并结合附图，说明本发明主题的特征和益处。正如我们所意识到的，只要不背离权利要求书的范围，公开和请求保护的主题能在各方面进行修改。据此，附图和说明书被认为是自然的说明，并不作为限制，主题的全部范围设置在权利要求书中。

附图说明

本发明的进一步的特征和益处根据下面的详细描述结合附图将变得非常明显。

图1显示了在体外，在制剂56的三个浓度下，每个存活的角质细胞的密螺旋体的菌落形成单位吸附量。

图2显示了牛群A(CuSO4足浴)和牛群A’、B以及C(制剂56足浴)在第0天和在足浴后12周的健康蹄的百分比(没有蹄炎临床表现)。在12周，计算得出在牛群A中的健康蹄的百分率没有显著的发展(p＞0.05，不显著“ns”)，而在牛群A’、B以及C中的健康蹄显著增加了(*p＜0.05，****p＜0.0001，非配对t-检验)。

具体实施方式

在一个具体实施方式中，公开了一种减少存在于活的主体的至少一部分上的微生物的方法，该方法包括向主体部分局部应用抗微生物制剂足够的时间以减少微生物存在。所述抗微生物制剂包括：

a)至少一种抗微生物的、分离或合成的源于天然的酚类化合物；

b)至少一种足以形成酚类化合物在水性载体中的溶液或分散液的表面活性剂；

c)用于溶解酚类化合物的溶剂；以及

d)足够的水性载体的量以达到100％(w/w)。

源于天然的酚类化合物

用于本发明的源于天然的酚类化合物是所谓的“天然”抗微生物活性物的抗微生物剂。这些活性物的名字源于自然产生其的植物。这些抗微生物的酚类化合物是已被发现提供抗微生物益处的植物基础油的关键化学组分。

用于本发明的源于天然的酚类化合物可在技术人员的能力范围内通过已知的方法合成制备，或可从植物油提取物中获得。在本发明的一个实施方式中，源于天然的酚类化合物从植物提取物中获得。在本发明的进一步的实施方式中，源于天然的酚类化合物商购获得。

用于本发明的源于天然的酚类化合物可包括，但不限于，百里香酚(存在于例如百里香中)、丁香油酚(存在于例如樟属植物中)、薄荷醇(存在于例如薄荷中)、香叶醇(存在于例如天竺葵或玫瑰中)、马鞭草烯酮(存在于例如马鞭草属的植物中)、桉树脑(存在于例如桉树中)、柏木醇(存在于例如雪松)、松香芹酮、香芹酚(其与百里香酚同分异构，并存在于例如牛至中)、茴香脑(存在于例如茴香中)桧醇、黄连素、松油醇、柠檬烯、拉坦尼根、柠檬醛(存在于例如柠檬香桃木)及其混合物。根据本发明的一个优选实施方式，用于本发明的源于天然的酚类化合物为百里香酚、丁香油酚、香芹酚和柠檬醛。而在一个进一步优选的实施方式中，源于天然的酚类化合物包括香芹酚和百里香酚。在一个最优选的实施方式中，源于天然的酚类化合物包括百里香酚。重要的是要注意在所述制剂包括一种以上的酚类化合物的结合的情况中，所述的结合将不是由i-香芹酚、百里香酚和对伞花烃或ii-百里香酚和松油醇一起或与其他酚类化合物结合而组成。

根据一个实施方式，所述制剂可包括从约0.05％至约25％(w/w)的酚类化合物。根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约5％至约25％(w/w)的酚类化合物。而根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约15％至约25％(w/w)的酚类化合物。根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约0.05％至约25％(w/w)的百里香酚。根据另一个实施方式，所述制剂可包括占制剂约0.05％至约0.49％(w/w)的百里香酚。在一个特别的实施方式中，本发明的抗微生物制剂可包括0.18％(w/w)的百里香酚。而根据另一个实施方式中，所述制剂可包括占制剂约0.23％(w/w)的百里香酚。

基础油

在一个实施方式中，本发明的抗微生物制剂可进一步包括一种或多种基础油。基础油的名字源于自然产生其的植物。基础油包括源于草本植物、花、树以及其他植物的油。该油一般以微小液滴存在于植物的细胞间，并可通过本领域的技术人员已知的多种方法提取出来(例如蒸馏、吸脂法(例如用动植物油提取)、浸渍、溶剂提取或半干法成型)。基础油一般由可从中发现该油的植物或蔬菜命名。例如，玫瑰油或薄荷油分别源于玫瑰或薄荷植物。可用于本发明的非限制性的基础油的示例包括茴芹油、柠檬油、橙油、牛至、迷迭香油、冬绿油、百里香油、薰衣草油、丁香油、啤酒花、茶树油、香茅油、麦油、大麦油、香茅草油、杉木叶油、柏木油、肉桂油、蚤草油、天竺葵精油、檀香油、紫罗兰油、蔓越莓油、桉叶油、马鞭草油、薄荷油、安息香树胶、罗勒油、小茴香油、冷杉叶油、香脂油、薄荷醇、ocmea牛至油、北美黄连油、小檗科植物油、拉坦尼根和姜黄油、芝麻油、澳洲坚果油、月见草油、西班牙鼠尾草油、西班牙迷迭香油、芫荽油、百里香油、甜椒果油、玫瑰油、香柠檬油、玫瑰木油、春黄菊油、鼠尾草油、香紫苏油、柏树油、海茴香油、乳香油、姜油、圆柚油、茉莉花油、刺柏油、酸橙油、橘油、马郁兰油、没药油、橙花油、广藿香油、胡椒油、黑胡椒油、卑柠油、松树油、奥图玫瑰油、留兰香油、甘松油、香根油或依兰依兰。本领域的技术人员已知的其他基础油也被认为在本发明中是有用的(例如，International Cosmetic Ingredient Dictionary，第10版，2004，其被作为参考引入到本发明中)。

根据一个实施方式，所述基础油可以是选自牛至油、百里香油和桉叶油的基础油。根据一个优选的实施方式，用于本发明的基础油富含百里香酚和/或香芹酚。百里香酚和香芹酚是天然存在的消毒剂，其在环境中容易降解。照此，在环境中或在活的有机物种中很少或没有积累，即使进行本发明的抗微生物制剂的重复应用。

根据一个实施方式，所述制剂包括从约0.0001％至约4％(w/w)的基础油。根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约0.01％至约4％(w/w)的基础油。而根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约1％到4％(w/w)的基础油。

表面活性剂

表面活性剂(表面活性的制剂)一般意指当溶解在水中或其他含水体系中时，能减少其和其他物质或材料之间的表面或界面张力的物质。根据本发明的另一个实施方式，用于本发明方法中的抗微生物制剂进一步包括表面活性剂。合适的表面活性剂包括水溶性或水分散性的非离子、阴离子、阳离子或两性化合物。在进一步的实施例中，本发明的抗微生物制剂包括本领域已知的一种或多种传统的阴离子表面活性剂。表面活性剂和其特性的代表性的列表在雷明顿制药科学，第17版(麦克出版公司)(Remington′s PharmaceuticalSciences，17th edition(Mack Publishing Company))中有详细描述。根据本发明的一个实施方式的非限制性的表面活性剂的示例包括月桂基磺酸钠、硬脂酸己六酯、脱水山梨糖醇酯、月桂醇聚醚硫酸酯钠、十二烷基肌酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱(CAPB)、月桂基醚磺酸钠、烷基苯磺酸盐、壬基酚聚氧乙烯醚、十六烷基甜菜碱、月桂基甜菜碱和醚乙氧基化物。根据另一个实施方式，用于本发明方法中的抗微生物制剂中可包括一种或多种额外的表面活性剂。

在本发明的一个实施方式中，表面活性剂有助于用于本发明的酚类化合物和/或基础油在水载体中的分散或乳化。在本发明的进一步实施方式中，表面活性剂在通过变性破坏生物膜的结构方面有帮助。而在本发明的进一步的实施方式中，当抗微生物溶液被用于治疗的局部表面时，表面活性剂可以制造出“发泡效果”。而在本发明的进一步的实施方式中，表面活性剂可以改善另一表面活性剂的粘度响应。制造泡沫可以使抗微生物溶液保持与被治疗的局部表面接触更长的时间。而在进一步的实施方式中，表面活性剂被用作“湿润”剂。湿润剂一般能减少水分子的表面张力，能使溶液扩展的更大以及渗透到被处理的表面的小裂缝和裂缝的更深处。

根据一个实施方式，所述制剂可以包括从约0.1％至约15％(w/w)的表面活性剂。根据另一个实施方式，制剂可以包括从约5％至约15％(w/w)的表面活性剂。根据另一个实施方式，所述制剂可以包括从约10％至约15％(w/w)的表面活性剂。

溶剂

用于本发明的源于天然的酚类化合物(例如香芹酚、百里香酚)一般不能在水介质中充分溶解。因此，用于本发明的抗微生物制剂一般包括溶剂。溶剂可以是本质上亲水性的、疏水性的或两亲性的。在一个实施方式中，本发明的抗微生物制剂包括两亲性的溶剂。两亲性的溶剂能在水性载体中溶解源于天然的酚类化合物和/或基础油。根据本发明的一个具体实施方式，溶剂的非限制性的示例包括甲醇、乙醇、十六烷、丙二醇、丙二醇正丁醚、丙二醇甲醚醋酸酯、丙二醇甲醚、二丙二醇正丙醚、乙二醇甲醚、1，3-丙二醇和己二醇。向本发明的抗微生物溶液中添加显著量的溶剂允许该溶液在稍微的低于0℃的温度下被使用。确定该溶剂的量在熟练的技术人员的能力之内。根据本发明的一个实施方式，优选溶剂是丙二醇甲醚。

根据一个实施方式，所述制剂可以包括从约0.1％至约40％(w/w)的溶剂。根据另一个实施方式，所述制剂可以包括从约5％至约35％(w/w)的溶剂。而根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约15％至约30％(w/w)的溶剂。

掩蔽剂

根据另一个实施方式，在本发明的方法中使用的抗微生物制剂通常在现场用混合物组分的浓缩溶液配制。根据一个实施方式，自来水用于稀释。自来水一般具有一定量的硬度。因为溶解的矿物质(例如，Ca++和Mg++)的存在可能对抗微生物制剂的性能和特性产生不利影响，所以在所述制剂中包括掩蔽剂，从而以水溶复合物的形式螯合溶解的矿物质。掩蔽剂在本领域中是周知的。非限制性的示例包括乙二胺四乙酸(EDTA)钠盐、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、乙二胺二琥珀酸三钠、柠檬酸、氨三乙酸三钠、磷酸钠和胆酸钠。通常，掩蔽剂阻止溶解的矿物质结合表面活性剂分子。而且，掩蔽剂还可以除去要消毒的表面上的矿物质。

根据一个实施方式，所述制剂可包括从约0.01％至约10％(w/w)的掩蔽剂。根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约1％至约5％(w/w)的掩蔽剂。而根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约1％至约3％(w/w)的掩蔽剂。

芳香剂

本发明使用的源于天然的酚类化合物通常有相关的刺鼻的气味，这可能会阻碍其大规模的应用。因此，根据另一个实施方式，本发明所述的抗微生物制剂可进一步包括一种或多种具有赋予其愉快气味的功能的药剂。而根据另一个实施方式，所述药剂可具有进一步提高用于本发明制剂的抗微生物特性和同时赋予其更愉快气味的双重功能。赋予愉快气味和/或提高抗微生物特性的药剂的非限制性的示例包括香芹酚、甲基异丙基苯、桉油酚、丁香油酚、百里香酚、薄荷醇、柠檬醛和柠檬烯。

根据一个实施方式，所述制剂可包括从约0.01％至约5％(w/w)的芳香剂。而根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约0.03％至约5％(w/w)的芳香剂。而根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约0.5％至约5％(w/w)的芳香剂。而根据另一个实施方式，所述制剂可包括从约0.01％至约0.15％(w/w)的芳香剂。

其他组分

本发明的抗微生物制剂可任选地包括宽范围的添加组分，其非限制性的示例包括着色剂、增稠剂、芦荟胶、丙三醇、维生素和pH调节剂。该种添加组分在熟练技术人员的能力之内。优选地，抗微生物制剂的pH可以是从约6到约10。

消毒方法

根据本发明的一个实施方式，本发明的抗微生物制剂可通过各种技术手段局部地接触被应用到活的主体的部分。在一个实施方式中，使用扩散器或喷雾器来施用本发明的抗微生物制剂。或者，本发明的抗微生物制剂也可被配制成喷雾制剂。进一步施用本发明的抗微生物溶液的方法在熟练的技术人员的能力之内。例如，所述接触可借助于沐浴、足浴、直接施用、涂抹、乳霜、软膏和油膏的方法。优选地，局部接触可采用足浴。

本发明的抗微生物制剂可以直接被应用或在应用之前被稀释。由于本发明的抗微生物制剂基本无腐蚀的特性，因此所述制剂能容易地被应用而不会对活的主体部分产生不当损伤。可根据本发明的方法被治疗的活的主体部分的非限制性的示例包括皮肤、四肢、头、耳朵、鼻子、手、足、黏膜、蹄或它们的结合。

根据一个实施方式，根据本发明的方法的被接触的活的主体可以是哺乳动物或禽类。根据实施方式，哺乳动物可以选自牛类、绵羊类、犬类、山羊类、马类、猫类、猪类、啮齿目动物以及人类。根据实施方式，禽类选自鸡、鸭、鸸鹋、鹅、火鸡和野鸡。

根据另一个实施方式，本发明的方法可以用于减少微生物存在以预防或治疗疾病，疾病例如为腐蹄病、蹄烫伤、蹄脓肿和其结合。根据另一个实施方式，本发明的方法可以用于预防或治疗选自皮肤损伤、附件疾病、细菌感染和真菌感染的疾病。

根据一个实施方式，细菌感染可以是沙门氏菌感染、大肠杆菌感染、葡萄球菌感染、螺旋体感染、脓疱病、深脓疱病、痈病、毛囊炎、丹毒、气单胞菌感染、非洲蜱咬热、美洲蜱咬热、溶血隐秘杆菌感染、杆菌性血管瘤病、非性病梅毒、类芽生菌脓皮病、水疱性远端指炎、葡萄状菌病、勃秦氏病、布鲁氏菌病、大疱性脓疱病、溃疡、猫抓病、下疳、软下疳、衣原体感染、慢性***炎、慢性复发性丹毒、慢性穿凿性窦道性溃疡、色素杆菌病感染、***、皮肤放线菌病、皮肤炭疽病感染、皮肤白喉感染、B组链球菌皮肤感染、溶血性巴氏杆菌皮肤感染、海豚链球菌皮肤感染、坏疽性皮炎、沙漠疮、蹄炎、坏疽性深脓疱病、伊氏埃立克体感染、慢性链球菌性淋巴水肿、地方性斑疹伤寒、流行性斑疹伤寒、丹毒、罗森巴赫类丹毒、风湿性环状红疹、红癣、外耳炎、甲沟炎、跳蚤传染的斑点热、弗林德斯岛斑疹热、飞鼠斑疹伤寒、毛囊炎、脚脓肿、富尼埃坏疽、疔疮、气性坏疽、鼻疽、革拉泽氏病、***血症、淋病、革兰氏阴性菌毛囊炎、革兰阴性趾蹼感染、***、***、JK组棒状杆菌败血症、流感嗜血杆菌性蜂窝组织炎、幽门螺杆菌性蜂窝组织炎、医院疖病、热水浴毛囊炎、人粒细胞无形体病、人粒细胞埃立克体病、触染性脓疱病、感染性脂腺、指间皮炎、腐蹄病、意大利脚腐病、日本斑点热、关节病、钩端螺旋体病、单核细胞增生李斯特菌感染、李斯特菌病、脓性颌下炎、狼疮样须疮、莱姆病、性病淋巴肉芽肿、软化斑、地中海斑疹热、类鼻疽、脑膜炎球菌血症、密苏里莱姆病、支原体感染、坏死性筋膜炎、新生儿中毒性休克样发疹性疾病、诺卡菌病、新生儿坏疽性口炎、北亚蜱传斑疹伤寒、新生儿眼炎、丹毒、奥罗亚热、巴斯德菌病、根尖周脓肿、品他病、窝状角质松解症、瘟疫、蹄皮炎、原发性***性皮炎、假单胞菌脓皮病、假单胞菌热脚综合症、化脓性甲沟炎、多肌炎、Q热、昆士兰斑疹伤寒、鼠咬热、复发性毒素介导的***部红斑、鼻硬结病、埃氏立克次氏体感染、立克次氏体痘、跗骨赘、落基山斑疹热、军刀状胫、鞍鼻、沙门氏菌病、猩红热、***、志贺氏菌病、葡萄球菌性烫伤样皮肤综合症、链球菌性间擦疹、超级脚腐病、浅表性脓疱性毛囊炎、寻常性须疮、***、梅毒、蹄叉腐疽、蜱传播***病、中毒性休克综合症、战壕热、热带溃疡、野兔病、秘鲁疣、创伤弧菌感染或雅司病中的一种。

根据一个实施方式，真菌感染可以是曲霉感染、隐球菌病、鳞屑、念珠菌病、牛皮癣、蹄叉腐疽、芽生菌病、壶菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病、花斑癣(蛇皮癣)、非洲组织胞浆菌病、链格孢病、抗性念珠菌病、黑色毛结节菌病、念珠菌性间擦疹、念珠菌性甲癣、念珠菌性甲沟炎、念珠菌性外阴***炎、念珠菌疹、着色芽生菌病、慢性皮肤粘膜念珠菌病、球孢子菌病、先天性皮肤念珠菌病、隐球菌病、皮癣菌疹、尿布念珠菌病、播散性球孢子菌病、远端甲下甲真菌病、蝇疫霉病、芽生菌性指间糜烂、黄癣、真菌性毛囊炎、镰刀菌病、地丝菌病、婴儿臀部肉芽肿、组织胞浆菌病、透明丝孢霉病、脓癣、链状芽生菌病、毛霉病、足菌肿、北美芽生菌病、甲真菌病、口腔念珠菌病、耳霉菌症、肛周念珠菌病、传染性口角炎、暗色丝孢霉病、毛结节菌病、糠秕孢子菌性毛囊炎、原发性皮肤曲霉菌病、原发性皮肤球孢子菌病、原发性皮肤组织胞浆菌病、原发性肺球孢子菌病、原发性肺组织胞浆菌病、进行性播散性组织胞浆菌病、近端甲下甲真菌病、鼻孢子虫病、南美芽生菌病、孢子丝菌病、***性念珠菌病、须癣、头癣、体癣、斗士体癣(tinea corporis gladiatorum)、股癣、面癣、叠瓦癣、隐匿癣、手癣、黑癣、足癣、花斑癣、白色毛结节菌病、浅表白甲型甲真菌病或接合菌病中的一种。

根据一个实施方式，皮肤损伤可以是溃疡、糖尿病性溃疡、疔疮、痈、龟裂、破裂或水肿中的一种。

根据一个实施方式，所述附件疾病可以是乳腺炎。

本发明的制剂可包括在该说明书全文中讨论的组分的任何结合(例如源于天然的酚类化合物、基础油、表面活性剂、溶剂、掩蔽剂和水等)。还可预期的是组分的浓度可变。

通过参考如下的实施例可以更容易地理解本发明，给出这些实施例是为了说明本发明而不是限制其范围。

实施例1

抗微生物制剂

表1-抗微生物制剂

n/a：不适用该公式在使用前需要稀释

当存在掩蔽剂例如柠檬酸钠时，其先溶解在预定量的水中，并搅拌至溶解。然后加入丙二醇单甲醚PM或1，3-丙二醇(溶剂)、百里香酚、基础油(牛至油)以及任选地芳香剂，并搅拌直到溶解。然后加入表面活性剂(月桂基磺酸钠和/或月桂醇聚醚硫酸酯钠和/或十六烷基甜菜碱)和额外的水，并搅拌至溶解以提供100％(w/w)的制剂。搅拌该最终的制剂直到获得均质化的溶液。通过用水(1％w/w)稀释的方式由制剂2获得的制剂1，被视为“备用”制剂。通过由制剂4用水(3％w/w)稀释的方式获得的制剂3，被视为“备用”制剂。通过用水(1％w/w)稀释的方式由制剂5获得的制剂6，被视为“备用”制剂。通过用水(3％w/w)稀释的方式由制剂7获得的制剂8，被视为“备用”制剂。制剂9为备用制剂。

如上文所示，先配制浓缩物(制剂2、4、5和7)，稀释所述浓缩物来提供制剂1、3、6和8的制备。制剂A、B、C、D、E、1和2包括基础油(牛至油)。制剂3和4不包括任何芳香剂。制剂5、6、7、8和9可包括芳香剂。制剂5、6和9不包括任何掩蔽剂。制剂的pH范围从约6.5到约9.7。

如上文所示，制剂A和D没有溶剂，并且既不稳定也不能溶解在水中。溶剂有利于制剂1、2、3、4、5、6、7、8和9的溶解性和稳定性。制剂B和E没有表面活性剂并且不稳定，也不能溶于水，也没有发泡效果。表面活性剂有利于制剂1、2、3、4、5、6、7、8和9的稳定性、溶解性和发泡效果。制剂C含有溶剂和表面活性剂，并且稳定，溶于水并具有发泡效果。用硬水稀释不影响制剂1、3和8的特性，这表明掩蔽剂对制剂1、3和8的效果。

实施例2

掩蔽剂

发泡能力是消毒剂的一个非常重要的特性。至关重要的是，即使用硬水稀释配制时，消毒剂也发泡。这在农村环境中特别重要，在那里，用于稀释农业消毒剂的水几乎总是硬水。

制剂10至17(表2)用400ppm的硬水制备。20mL的制剂10至17被分配于圆柱形的刻度量简中。圆筒被摇动10秒，然后放置1分钟。然后测量每个制剂的泡沫的高度和厚度(表3)。该测试再重复2次，对每种制剂共测量3次。

表2-含硬水的制剂

制剂	10	11	12	13	14	15	16	17
									百里香酚％	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23
表面活性剂％	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35	0.35
									溶剂％	0.9	0.9	0.9	0.9	0.9	0.9	0.9	0.9
基础油％	0	0.02	0	0.02	0	0.02	0	0.02
									芳香剂％	0	0	0.03	0.03	0	0	0.03	0.03
掩蔽剂％	0.09	0.09	0.09	0.09	0	0	0	0
									硬水％	Q.S.	Q.S.	Q.S.	Q.S.	Q.S.	Q.S.	Q.S.	Q.S.

Q.S.代表足够的量或添加足够的主要成分直到达到100％的配方。

表3-当使用标准的AOAC 400ppm硬水时，1分钟后的泡沫高度(cm)和厚度

泡沫厚度：1＝薄，类似泡泡浴；5＝厚，类似剃须膏

如上文所示，含有掩蔽剂(2.75)的制剂10、11、12和13比不含掩蔽剂(2.42)的制剂14、15、16和17的泡沫的厚度要高，相差14％。当与不含掩蔽剂的制剂(10.75cm)相比时，含有掩蔽剂的制剂(13.75cm)的泡沫的高度要显著地高(p＜0.05，非配对t检验)，相差23％。这些结果清楚地显示掩蔽剂的存在影响了由制剂产生的泡沫的量。消毒应用中泡沫的重要性是非常重要的，特别是在农业环境中。

实施例3

选择的酚类化合物和基础油的生物学功效

采用AOAC方法955.15(酚系数法)(仅作较小修改)来测定选择的源于天然的酚类化合物和选择的基础油的能观察到总的抗微生物活性的最小浓度。不同浓度的基础油和源于天然的酚类化合物被加入到制剂F(见本发明的下表)中，并接种0.05％的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538，约8logs的浓度)细菌悬浮液。在接触10分钟后，0.1ml的接种溶液被转移到中性的肉汤培养基(Difco 268110)中，并在37℃培养72小时。肉汤培养基中的浊度的存在指示微生物的存活。

如下表4所示，这些结果表明了百里香酚和香芹酚出色的抗微生物的活性。为了获得全部抗微生物活性，百里香酚和香芹酚需要的浓度(0.07％v/v)比其他酚类化合物和基础油低得多。

表4-抗微生物剂的最小浓度

实施例4

微生物减少的定量分析

对选择的本发明的制剂的抗微生物活性进行测定。不同的制剂(表5)被接种0.05％金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的细菌培养物，该细菌培养物刚刚在最佳生长培养基中在37℃下培养了48小时。在接触10分钟的时间后，0.1ml的接种溶液被接种到不同稀释的中性TSA琼脂(Difco 255320)上来测定残留微生物的负载。通过计算用参比制剂(即水)获得的剩余电荷的对数，并将其与使用包含酚类化合物或基础油的任何制剂获得的剩余电荷进行比较来测定对数减少值。

包含天然酚类化合物或基础油(0.18％)的几种制剂被试验以测定它们在减少金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的负载量方面的效果。用浓缩制剂以及用水稀释(1∶100)制备所述溶液。如下表5所示，这些结果表明了制剂10、11和12在减少金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)负载量方面的高效率。

表5-微生物减少

实施例5

单独成分的生物功效

用本发明制剂的单独组分和组分结合来制备制剂8和13到25(表6)。然后测试制剂8和13到25对金黄色葡萄球菌的生物功效。简单地说，含有1×108CFU的金黄色葡萄球菌(例如100000000细菌)的0.1mL的细菌培养物被接种到含有10mL给定制剂(以给定比例稀释)的试管中。然后混合试管中的成分，并放置2分钟(“接触时间”)。2分钟后，转移0.01mL试管中的成分到含有9mL中性细菌培养基(Letheen肉汤)中，该中性细菌培养基能够终止所述制剂的抗微生物作用并让微生物生长。然后在72小时后检查试管中微生物生长的存在。在给定接触时间下，制剂的抗微生物效果越强劲，那么在不再足够有效杀死99.999％(5logs)的细菌之前，它就能被稀释得越多。

表6-含有单独或结合组分的制剂

如下表7所示，明显地，制剂8、23、24和25(本发明的实施方式)大大地优越于仅含有本文件中描述的部分组分的制剂。制剂8、23、24和25在被稀释1/4时仍能杀死所有的细菌。其他制剂即使不被稀释(除制剂17外，制剂17一旦被稀释1/2就不能杀死细菌了)时，也不能杀死细菌。

从这些结果看，对本领域的技术人员来说很明显的是，在含有所有组分的制剂和仅含有部分组分的制剂之间存在非常大的差异。同样地，当考虑它们单个组分的特性时，所有组分的结合产生了效果超出预期的制剂。

表7-制剂的抗微生物效果

(+)代表培养试管显示出细菌生长。这表明所述制剂在该稀释度下、在2分钟的接触时间的期间不能杀死所有的细菌，因此，细菌在培养试管中繁殖。

(-)代表培养试管没有显示细菌生长。这表明所述制剂在该稀释度下、在2分钟的接触时间的期间不能杀死所有的细菌，因此，细菌在培养试管中繁殖。

实施例6

制剂1对选择的微生物的生物功效

本发明的抗微生物制剂展示出对各种微生物的广谱活性。如下所示，测定了制剂1对各种微生物的功效。

表8-对各种微生物的微生物活性

¹：美国分析化学家协会，²：美国材料与试验协会

实施例7

在短的接触时间下的制剂的生物功效

在现实生活中的情况，消毒或清洁附件(不包括皮肤)的各种制剂不允许在所述制剂和所述附件之间长时间接触。例如，洗手剂的泡沫、凝胶和喷雾等等停留在活的主体的手上最好约30秒。因此，消毒或清洁皮肤的制剂在短的接触时间里有抗微生物功效是很关键的。

如下表9所示，制备制剂9和26到29。制剂26到29基于制剂9，含有减少的百里香酚的浓度。然后测试它们对金黄色葡萄球菌的生物功效。简单地说，将含有1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴或1×10³CFU的金黄色葡萄球菌的0.1mL细菌培养物接种到含有10mL的给定的制剂的试管中。然后混合试管中的成分，并放置15秒(“接触时间”)。15秒后，0.01mL的试管内容物被转移到含有9mL的中性细菌培养基(Letheen肉汤)的试管中。该中性细菌培养基能够终止所述制剂的抗微生物活性并能够让微生物生长。然后在72小时后检查含有不同浓度细菌(5、4、3、2和1logs)的试管中微生物生长的存在。在给定接触时间的期间，制剂的抗微生物效果的越强，其越能杀死高logs的细菌。对绿脓杆菌(Pseudomona aeruginosa)也进行了相同的实验。

表9百里香酚浓度减少的制剂和在15秒的接触时间下的抗微生物功效

药剂	9	26	27	28	29
						百里香酚％(w/w)	0.24	0.17	0.1	0.05	0.01
表面活性剂％(w/w)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
						溶剂％(w/w)	5	5	5	5	5
芳香剂(w/w)	0.09	0.09	0.09	0.09	0.09
						水％(w/w)	Q.S.	Q.S.	Q.S.	Q.S.	Q.S.
对金黄色葡萄球菌的log减少值	4	3	1	0	0
						对绿脓杆菌的log减少值	4	2	1	1	1

如上表9所示，根据本发明的实施方式，在15秒的接触时间下，制剂9、26和27优于含有低浓度的百里香酚的制剂。在0.05和0.01的百里香酚浓度下，我们不再观察金黄色葡萄球菌的Log减少值，而我们仍能杀死1Log的绿脓杆菌。这可以由革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的结构差异来解释。

从这些结果看，对本领域的技术人员来说明显的是，含有降低的百里香酚浓度的制剂在短的接触时间下获得抗微生物功效，它们之间在功效方面存在显著的差异。而且，当百里香酚的浓度高于0.05％时，制剂在短的接触时间里更有可能有效。

实施例8

抗微生物制剂的毒性

对本发明的抗微生物制剂的选择的组分进行毒性试验(LD₅₀)。制剂1被测定具有＞15g/Kg的LD₅₀。根据Hodge and Sterner toxicity scale，制剂1被认为是相对无害的。如在表10中显示，测试了从本发明的制剂中分离的组分的毒性，并且它们被认为是从轻微的毒性到相对地无害。还测试了其他消毒剂中存在的活性组分的毒性，其结果显示在表11中。这些示例比本发明的制剂的每种组分更有毒性。

表10-本发明制剂1的各种组分的毒性

表11-已知的商业制剂的各种组分的毒性(现有技术)

组分	LD<sub>50</sub>口服-大鼠	规格
			硫酸铜	352mg/Kg	ClearTech
甲醛	100mg/Kg	SicenceLab.com
			季铵类	366mg/kg	Lonza Inc
碘	14mg/kg	Finsher Scentific

实施例9

足浴产品比较

一般来讲，牛蹄感染的治疗包括抗生素的局部应用和含有消毒剂溶液的足浴以控制病原剂在受感染的牛群中传播。本发明的制剂5能在足浴中被使用以控制牛的蹄感染。五水合硫酸铜和甲醛是足浴中两种其他常用的溶液。表12描述了制剂5和两种其他溶液的特性。

表12列出了制剂5的如下特性，本发明的一个实施方式：i)需要低度稀释；ii)可生物降解的；iii)无刺激性；iv)无毒；v)没有致癌效果以及vi)活性组分被食品药品监督管理局(FDA)一般认为是安全的(GRAS)。这些是有益的特性，因为其使得制剂有效地减少微生物存在，同时对人类和动物是安全无毒的。硫酸铜和甲醛没有这些特性。

表12-足浴溶液的特性

¹制剂：MSDS硫酸铜，ClearTech

²制剂：MSDS甲醛37％，SicenceLab.com

实施例10

制剂5和硫酸铜对密螺旋体的体外功效

蹄炎(DD)(Digital dermatitis)是牛的主要蹄疾病中的一种。蹄炎(DD)，也被称之为腐蹄病，是常见于绵羊、山羊和牛中的一种高度传染性疾病。控制和治疗牛的蹄炎一般通过足浴和局部应用抗生素来完成。密螺旋体(Treponema)被强烈地怀疑是病原体，并被发现于蹄炎的几乎所有的情况。在此评价了制剂5和硫酸铜在体外对密螺旋体的功效。

密螺旋体(T.phagedaenis-like细菌在约10⁶CFU/ml的浓度)被暴露于用50％(体积/体积)三次系列稀释的溶液中。制剂5的起始％(w/w)为1％，硫酸铜的起始％(w/w)为5％，即这些溶液在足浴中的惯用工作浓度。在10％和20％的无菌肥料的存在下，溶液暴露10分钟以及最少的暴露时间。MIC被定为溶液的最小抑制浓度。制剂5和硫酸铜的MIC列于表13中。

表13-对足浴溶液中的密螺旋体的MIC

	制剂5	硫酸铜
			足浴中的工作浓度	1％	5％
在最小暴露时间下的MIC	0.00781％	0.01953％
			在10分钟的暴露时间下的MIC	0.0026％	0.03906％
10％的肥料、在最小暴露时间下的MIC	0.00651％	0.01302％
			20％的肥料、在最小暴露时间下的MIC	0.00391％	0.01953％

如上表13所示，对于这些溶液，制剂5和硫酸铜具有低于工作浓度的MIC。在肥料的存在下，这些制剂也能获得好的功效。制剂5的MIC大致上比硫酸铜低10倍。从这些结果可以明显看出，制剂5可以以低于硫酸铜的浓度在体外获得对密螺旋体功效。

实施例11

在牛蹄炎阳性中制剂5的足浴短期应用

本发明的实施方式，制剂5，在一个短的时间段(三周)结合局部抗生素处理的来控制和治疗牛的DD被进行了评估。三群散栏牛群中的DD阳性奶牛选择总计400头动物。包括的牛群的特征列在表14中。制剂5被1∶100稀释在水中，并被引入到浴缸中。在实验中，所有的牛都经受一周三次的足浴。在溶液被换成新鲜溶液之前，二百头奶牛被允许经受足浴。整个实验期间，基于泰拉罗损伤级别：M0没有损伤；M1小的活跃损伤；M2大的活跃损伤；M3康复损伤以及M4慢性损伤来评价后蹄的损伤。当观察到活跃损伤(M1和M2)时，向蹄施用四环素。牛的“损伤情况”由两个后蹄最严重的病情决定。最严重的病情到轻微严重：M2＞M1＞M4＞M3＞M0。在足浴开始前0周到3周，观察调查病灶评分基于蹄笼(0周)和牛奶店(3周)。进行统计学McNemar检验来确定活跃损伤M1和M2是否在牛群中有显著的减少(特别严重和痛苦)。结果列在表15中。

表14-包括在研究中的牛群的特征

表15在第0周以及足浴起始后第3周的奶牛的无损伤(M0)、早期和活跃损伤(M1+M2)、治疗性损伤(M3)以及慢性损伤(M4)的百分率

如本发明上面说明的和描述的，制剂5在水中以1∶100的稀释作为三群阳性牛群的DD阳性对照，进行足浴试验。这些牛群有不同的DD起始水平，不同的足浴装置，不同的牛群大小。尽管如此，在三群牛群中，在足浴3周后，患有活跃损伤的奶牛的百分率显著地下降了(p＜0.0001)。对本领域的技术人员来说明显的是，该发现的显著性水平是非常高的。因此，制剂5的足浴结合抗生素的局部应用有助于减少牛群中最严重的损伤。

本发明的制剂5，i)与其他足浴溶液相比，具有有益的特征(表12)，ii)有较高的体外抗DD病原体功效(表13)以及iii)经过短时间使用后，能够使牛中活跃的DD损伤降低。对本领域的技术人员来讲，结合这些研究结果使本发明的制剂成为足浴的优选溶液，是显然的。

而优选的实施方式已在上面进行了描述并结合附图进行了说明，对本领域的技术人员来讲，在没有脱离本公开的情况下的修改是很明显的。这样的修改被认为是包括在本公开范围的可能的变形。

实施例12

抗微生物功效的评价

本发明制剂的抗微生物(制剂50，含有一种酚类化合物)的功效与含有特定比例的两种酚类化合物的制剂(制剂52和54)进行比较。

制剂

制剂以表16中的组分％(w/w)来制备。制剂A(本发明的实施方式)仅含有一种酚类化合物，而制剂B和C含有以比例为3∶2和1∶4的百里香酚和香芹酚。

表16-测试的制剂

抗微生物效果测试

0.1mL含有1×10⁶CFU的金黄色葡萄球菌的细菌培养物(例如1 000 000细菌)被接种到含有10mL给定制剂(未稀释或在给定比例下稀释)的试管中。然后混合试管内容物并放置2分钟(“接触时间”)。在2分钟后，0.01mL的试管内容物被转移到含有9mL的中性细菌培养基(Letheen肉汤)的试管中，所述中性细菌培养基能终止所述制剂的抗微生物作用并允许微生物生长。然后再72小时后检测试管中的微生物生长的存在。

表17-抗微生物效果的结果

稀释度/增长	50	52	54
				1	-	-	-
1/2	-	-	-
				1/4	-	-	-
1/8	-	+	+

(+)表示培养试管显示出细菌的生长。这意味着在那个稀释度下的制剂在2分钟的接触时间的时候不能杀死所有的细菌，并因此细菌在培养试管中繁殖。

(-)表示培养试管没有显示出细菌的生长。这意味着在那个稀释度下的制剂在2分钟的接触时间的时候能够杀死所有的细菌，并因此细菌不能在培养试管中繁殖。

结论

在给定接触时间的时候，制剂的抗微生物效果的越强劲，则在不再足够强劲以杀死至少99.999％(5logs)的细菌之前，它越能被稀释。例如，当制剂52和54被稀释1/4时，它们能够杀死99.999％的细菌，但是当稀释1/8的比例时，它们不再能够杀死99.999％的细菌。

从这些结果看，在本发明实施方式中，制剂50优于制剂52和54是清楚的。当被稀释1/8时，在2分钟的接触时间里，制剂50能够杀死99.999％的细菌，而52和54不能。

实施例13

在化学挑战下的密螺旋体粘附试验

来自于密螺旋体(Treponema)的细菌的种类被发现是蹄炎(DD)的病原体，蹄炎是一种在牛中蹄的高度传染性、侵蚀性和增殖性的感染。为了能够起始感染，密螺旋体像粘附素那样通过表面蛋白吸附在蹄的角质形成细胞。这种粘附复合物在体外重建了密螺旋体和培养的角质形成细胞之间，并用本申请人的制剂来挑战，目的是为了评价本申请人的制剂对密螺旋体粘附的影响。

制剂

制剂用表18中的组分％(w/w)制备。

表18-测试的制剂

药剂	56
		百里香酚％	0.23
表面活性剂％	0.12
		溶剂％	0.36
水％	Q.S.

试验

当密螺旋体(5×10⁴到1×10⁶源于DD活跃损伤的T.phagedaenis-like细菌)被暴露到制剂56下时，刺激了宿主-病原体互作，并且在向牛角质形成细胞的单层细胞培养物孵育40分钟后，检测到了所述制剂对密螺旋体粘附的影响。所述细胞是来源于与作为饲养细胞来源于真皮的成纤维细胞共培养的牛足的牛皮肤-角质边界牛角质形成细胞原代细胞培养物。所述制剂在1×MIC、2×MIC和4×MIC下进行测试。0.00781％的制剂56对类似T.phagedaenis的细菌的MIC在前面的工作中确定。随着孵育的时间，用如先前报道的Ct值和实时定量荧光PCR分析标准曲线确定密螺旋体的数量(

et al.2012)，用“台盼蓝拒染实验”区分活的和死的角质形成细胞。化学挑战下的密螺旋体粘附实验的结果以平均菌落形成单位的密螺旋体/活的角质形成细胞进行公布。

结果

结果显示粘附于存活的角质形成细胞的密螺旋体的数量随着制剂56浓度的增加而减少。这些结果显示在图1中。

结论

在化学挑战下的密螺旋体粘附试验的结果表明随着浓度的增加，制剂56能够减少体外粘附角质形成细胞的密螺旋体的存在。在本发明的实施方式中，该制剂对细菌粘附的观察到的效果显示了其能预防细菌在活的表面上定殖。

实施例14

对患有蹄炎的奶牛的长期功效试验

来自于密螺旋体(Treponema)的细菌的种类被发现是蹄炎(DD)的病原体，蹄炎是牛蹄的高度传染性、侵蚀性和增殖性的感染。密螺旋体存在两种主要的形态形式：如在蹄炎活跃损伤发现的螺旋形式和细菌代谢休眠期的包囊形式。包囊形式的(或休眠的)密螺旋体与蹄炎(DD)不确定的慢性损伤相关，例如损伤是DD新的活跃损伤的前兆。抗微生物药物一般不能消除休眠阶段的密螺旋体(所以不能治愈蹄炎)，甚至有些时候，是螺旋形式和包囊形式的细菌之间转移的刺激物。在现场试验中，在使用足浴一段长时间后(12周)，本发明的制剂通过奶牛的交叉足浴被应用于牛蹄来评价其对包括慢性损伤的蹄炎的功效。

为了能够起始感染，密螺旋体像粘附素那样通过表面蛋白吸附在蹄的角质形成细胞。这种粘附复合物在体外重建了密螺旋体和培养的角质形成细胞之间，并用本申请人的制剂来挑战，目的是为了评价本申请人的制剂对密螺旋体粘附的影响。

制剂

制剂用表19中的组分％(w/w)制备。

表19-测试的制剂

现场试验

选择三群散栏牛群中的DD阳性奶牛。选定的牛群不共享相同的房间。牛群A使用最常用的化学足浴来治疗，护理标准：水合硫酸铜(CuSO₄)，从第0天道第12周，然后另外的12周改变为制剂56。牛群B和C接受12周的制剂56的足浴。牛群的特点和治疗列在表20中。

表20参与该研究的牛群的特点

	牛群A	牛群A’	牛群B	牛群C
					#观察的奶牛	135	135	115	165
测试的起始	第0周	第12周	第0周	第0周
					测试结束	第12周	第24周	第12周	第12周
足浴治疗	CuSO<sub>4</sub>(5％)	制剂56(1％)	制剂56(1％)	制剂56(1％)
					足浴频率	3×/周	3×/周	3×/周	3×/周

在第0天(治疗之前)和开始足浴后12周由受过训练的兽医在配料槽内完成奶牛后蹄的观察。蹄被定级为健康(没有蹄炎的临床表现)或感染(有蹄炎的早期、溃疡性、慢性或康复阶段的临床表现)。

结果

图2显示了参与该研究的每个牛群的健康蹄的百分比的发展情况。在试验开始时(第0天)，牛群A、B和C有不同水平的蹄炎。在足浴12周后，牛群A没有改善(相同水平的蹄炎)，而牛群A’、B和C显著地改善了：健康蹄分别增加了28.5％、7.0％和16.2％。这些牛群与含有本发明制剂56的足浴有关。

结论

蹄炎是一种带有密螺旋体作为病原体的多因子疾病。密螺旋体是通过附在角质形成细胞而定殖于足皮肤的细菌。它们通过一般抗微生物药物不能消灭的代谢休眠阶段侵入而能引起慢性损伤。对应这种损伤，蹄炎阳性的牛群可以通过化学药品足浴来管理，但是这些化学药品不能完全根除慢性感染。这与硫酸铜足浴试验期间观察到的相一致，在所述硫酸铜足浴试验期间，在使用很长一段时间足浴后，所观察到的与健康蹄的阳性发展不相关。在该相同的牛群和另外两个牛群中，测试制剂56，并观察到了健康蹄的显著增加。该结果暗示本发明的制剂能够解决蹄炎，包括由休眠期细菌引起的慢性损伤。当认为这些结果是通过将本领域使用的其他普通的足浴剂通常得到的结果时，这些结果是令人惊讶的，也是出乎意料的，并且这是不能被预料到的。

实施例15

证明所有类型的表面活性剂都可被用于本发明的消毒制剂中

根据表面活性剂的极性首基的电荷特性，表面活性剂可被分组。四个组为：

1.阴离子：在极性头部基团上是负电荷。这些包括例如硫酸盐、磺酸和羧酸的表面活性剂。

2.阳离子：在极性头部基团上是正电荷。这些包括例如胺和季铵盐化合物(Quats)的表面活性剂。

3.两性：可同时具有正电荷和负电荷。主要用作次要表面活性剂。这些包括包括甜菜碱和咪唑鎓化合物。

4.非离子：没有特定的电荷。到目前为止最经常使用的表面活性剂。其包括醇类、链烷醇酰胺类、酯类和胺氧化物类。

本发明制剂的抗微生物功效用所有类型的表面活性剂进行了评价。测试的不同制剂仅表面活性剂不同。所有的制剂均是基于列于表21中的通用配方。测试的不同的表面活性剂列在表22中。在0.12％(w/w)和/或0.35％(w/w)的浓度下测试表面活性剂。

表21制剂1-124的通用配方

表22制剂1-68中测试的表面活性剂

抗微生物效果的测试

0.1mL含有金黄色葡萄球菌的细菌培养物接种到含有10mL给定的制剂的试管中。然后混合试管的内容物，并放置2分钟(“接触时间”)。2分钟后，将0.01mL的试管内容物转移到含有9mL的中性细菌培养基(Letheen肉汤)的试管中，所述中性细菌培养基能终止制剂的抗微生物作用并能够使微生物生长。然后在72小时后检查试管中微生物生长的存在。对于每个抗微生物药效试验，将阳性对照进行平板涂布，随后进行菌落计数，以评估减少的金黄色葡萄球菌的log值，作为与制剂1-68接触两分钟的结果。如果在测试的试管中没有观察到生长，认为所述制剂能杀死至少阳性对照的细菌负载量。

表23列出了制剂1-68的功效测试的结果。减少的金黄色葡萄球菌的log值表明了每个制剂的功效。每个制剂用不同的表面活性剂在0.12和/或0.35％(重量)的浓度下配制。

表23对金黄色葡萄球菌的抗微生物效果的结果

结论

在本发明的消毒制剂中，测试了每种类型的表面活性剂(阴离子、阳离子、两性和非离子)。制剂1-68覆盖了不同类型的表面活性剂，但是所述表面活性剂为市场上可获得的最普通的表面活性剂化学药品群组。因此，本发明的制剂可以使用任何表面活性剂配制，而保持抗微生物功效。

从表23发现的结果看，本发明的制剂1-68在接触时间是2分钟的时候保持了抗微生物的功效是清楚的。

容易理解，本发明不限于本申请中的如本发明上面描述的结构和部分的细节。本发明能包括其他实施方式并以各种方式实践。也可以理解，本发明使用的措词或术语是为了描述的目的而不是限制的目的。因此，虽然本发明通过其说明性的实施方式在本发明的上面已进行了描述，但是在不脱离如附属权利要求的本发明主题的精神、范围和类型的情况下，其能够被修改。

然而，优选的实施方式已经在上面结合附图进行了描述和说明，对本领域的技术人员来讲，在没有脱离本公开的情况下，修改是显而易见的。这样的修改被认为是包括在本公开范围的可能的变形。

Claims (17)

1.一种抗菌制剂在用于预防或治疗在不同于人类的活的动物的至少一只蹄上的蹄螺旋体感染的药物的制备中的用途，所述抗菌制剂包括：

a)从约0.05％至约25％(w/w)的一种抗微生物的分离或合成的源于天然的酚类化合物，所述酚类化合物为百里香酚；

b)从约0.1％至约15％(w/w)的足以形成酚类化合物在水性载体中的溶液或分散液的至少一种阴离子的、阳离子的、两性的、非离子的表面活性剂或其组合；

c)从约0.1％至约40％(w/w)的用于溶解所述酚类化合物的溶剂；以及

d)足够的水性载体的量以达到100％(w/w)。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述表面活性剂选自月桂基磺酸钠、硬脂酸己六酯、月桂醇聚醚硫酸酯钠、十二烷基肌酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱(CAPB)、月桂基醚磺酸钠、烷基苯磺酸盐、壬基酚聚氧乙烯醚、脱水山梨糖醇酯和醚乙氧基化物构成的组。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述动物是哺乳动物或禽类。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蹄细菌感染选自腐蹄病、蹄烫伤、蹄脓肿及其结合。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途是采用喷雾、沐浴、足浴、直接应用、涂抹、乳霜、药膏和软膏中的一种。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蹄细菌感染是皮肤损伤。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述皮肤损伤是溃疡、糖尿病性溃疡、疔疮、痈、龟裂、破裂或水肿中的一种。

8.一种抗菌制剂在用于预防或治疗在不同于人类的活的动物的至少一只蹄上的蹄螺旋体感染的药物的制备中的用途，所述抗菌制剂由以下组分组成：

a)从约0.05％至约25％(w/w)的一种抗微生物的分离或合成的源于天然的酚类化合物，所述酚类化合物为百里香酚；

b)从约0.1％至约15％(w/w)的足以形成酚类化合物在水性载体中的溶液或分散液的至少一种阴离子、阳离子、两性的、非离子的表面活性剂或其组合；

c)从约0.1％至约40％(w/w)的用于溶解所述酚类化合物的溶剂；以及

d)足够的水性载体的量以达到100％(w/w)，以及

e)掩蔽剂；

f)基础油；和

g)芳香剂中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述制剂包括从约0.01％至约10％(w/w)的所述掩蔽剂。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述掩蔽剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)钠盐、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸、氨三乙酸三钠、环氧琥珀酸三钠、磷酸钠和胆酸钠构成的组。

11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述基础油选自牛至油、百里香油和桉叶油构成的组。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述基础油是所述制剂的约0.0001％至约4％(w/w)。

13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述表面活性剂选自月桂基磺酸钠、硬脂酸己六酯、月桂醇聚醚硫酸酯钠、十二烷基肌酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱(CAPB)、月桂基醚磺酸钠、烷基苯磺酸盐、壬基酚聚氧乙烯醚、脱水山梨糖醇酯和醚乙氧基化物构成的组。

14.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述芳香剂是柠檬醛。

15.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述动物是哺乳动物或禽类。

16.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途是采用喷雾、沐浴、足浴、直接应用、涂抹、乳霜、药膏和软膏中的一种。

17.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述蹄细菌感染是皮肤损害。

Images