CN112675360B

CN112675360B - 一种负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架的制备和应用

Info

Publication number: CN112675360B
Application number: CN202011463467.1A
Authority: CN
Inventors: 李燕; 臧宏运; 宋婷
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Shenzhen Campus
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN112675360A

Abstract

本发明公开了一种负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架的制备和应用。所述复合支架以明胶静电纺丝纤维膜为基底，加入脂肪干细胞悬浮液进行粘附，然后再加入明胶光交联溶液，经光交联作用制备成圆柱状明胶水凝胶，即为所述复合支架。所述复合支架具有双层结构，其中纤维膜能够能阻挡异物和病原侵入，防止组织液丧失；圆柱状明胶不仅保证了hADSCs的负载量、生存力和粘附力，还促进hADSCs迁移和增殖，协同促进皮肤组织的再生和形成；且其独特的形状，在保证复合支架与创伤贴合度良好的同时，还具有很好的透气性，有利于伤口氧气及营养物质的运输，还能够促进创伤处血管、新生肉芽组织和胶原蛋白的生成，降解周期与创伤愈合周期接近，有利于创伤的愈合。

Description

一种负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架的制备和应用

技术领域

本发明涉及生物组织支架技术领域，更具体地，涉及一种负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架的制备和应用。

背景技术

作为对人体最重要的屏障，皮肤经常遭受急性和慢性伤害，特别是难愈合伤口，严重影响了患者的生活质量。对于这些不能通过各种手术方法治愈的难治性伤口，干细胞移植成为有效的研究方向。作为成人干细胞之一，脂肪干细胞比其他干细胞在修复皮肤伤口方面起着不可或缺的作用，因为它们具有免疫相容性优点。基于大量的动物和临床试验，脂肪干细胞在未来皮肤伤口修复领域，尤其是在慢性难治性伤口领域将有更大的突破。

直接将干细胞注射到修复部位可将手术的侵袭性降到最低。然而，这种方式细胞与宿主组织的融合程度较低，其较低的细胞存活率仍然是临床移植成功的主要障碍。细胞在体内生存的微环境大多是由胶原纤维及其他细胞表面构成的纳米支架结构，除蛋白质是调节细胞生命活动的重要因素外，纳米级的支架结构是另一重要因素。静电纺丝制备的纳米纤维有利于细胞的植入，贴附、营养物质的渗入及代谢废物的排出，为细胞的生长、增殖提供了良好的微环境，从而可以增强干细胞的黏附，迁移、增殖及分化功能。静电纺纳米纤维促进细胞生长的方面具有比较优越的作用。

纳米纤维膜纺到一定厚度以后，膜内部的孔径就会变小，限制了细胞的浸润生长。对于绝大多数组织工程支架来说，细胞浸润深度至关重要。难愈合创面较大，片层状结构组织浸润性较差，影响细胞的存活和功能，且缺乏足够的氧气和营养供应导致促进创面修复能力差，降低临床移植的成功率。另外，细胞与水凝胶材料之间有限的界面相互作用限制了组织长入。通过调整静电纺丝的参数，例如纺丝的电压、体积等，制备适合细胞粘附和增殖的纤维膜。因此，静电纺丝纤维膜是脂肪干细胞的优良载体，

但目前已有的敷料中，脂肪干细胞的负载量、粘附性，以及敷料的透气性、贴合度、营养物质运输、伤口愈合等方面，仍然存在较大的提升空间。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的伤口敷料，其功能单一，且生物相容性、降解性、细胞粘附性、负载量、透气性、与伤口的贴合度、营养物质运输、伤口愈合方面存在的缺陷和不足，提供一种负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架。本文采用静电纺丝和光交联方法制备双层皮肤结构水凝胶复合支架，其中以生物相容性良好的明胶经静电纺丝制备的纳米纤维膜具有和细胞外基质相类似的结构，能最大程度上模拟细胞外结构，为hADSCs的黏附和增殖提供依据；光交联明胶在纳米纤维膜上形成一定间隔的柱状水凝胶，使得复合支架材料具有良好的透气性，较大的孔隙率和孔径，有利于伤口氧气及营养物质和hADSCs的运输，提高创面血管的生成，促进新生肉芽组织和胶原蛋白生成，有利于伤口的恢复。

本发明的另一目的在于提供所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架。

本发明的再一目的在于提供所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架制备敷料中的应用。

本发明的还一目的在于提供所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架在负载药物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

一种负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架，所述复合支架以明胶静电纺丝纤维膜为基底，加入脂肪干细胞悬浮液，待细胞附在明胶静电纺丝纤维膜后，再加入明胶光交联溶液，然后经光交联作用制备成圆柱状明胶水凝胶，即为负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架。

明胶是胶原蛋白经过酸法或碱法水解得到的一种衍生蛋白质，由18种氨基酸组成的两性高分子聚电解质，其与胶原的组成相似、性质相近。明胶无抗原性，具有优良的生物相容性、降解性及细胞粘附性，在血浆膨胀剂、止血剂及创伤处理和组织工程等领域有广泛的应用。但是其直接作为敷料应用时，其机械性太差，以及降解速度过快，导致其应用受到限制。本发明通过组合使用光交联/静电纺丝方法生成具有可调节的物理和生物学特性的三维光交联明胶图案化支架(即明胶静电纺丝一面交联圆柱状明胶水凝胶)，图案化明胶支架不仅可以支持细胞生存力和细胞粘附，还可以促进细胞迁移和增殖，促进皮肤组织的再生和形成。类似ECM(细胞外基质)的纳米纤维结构提供了高的表面体积比，不仅可以实现最大的细胞-材料相互作用和材料介导的信号传导，还可以促进快速血管化。

其中，所述复合支架的明胶静电纺丝纤维膜相当于皮肤的表皮层，能够能阻挡异物和病原侵入，并能防止组织液丧失。在模拟糖尿病的伤口环境中，图案化明胶(即圆柱状明胶)降解后，明胶静电纺丝纤维膜还可以维持较长时间，进一步保护伤口，克服了明胶快速降解的缺陷。同时，图案化明胶提高了比表面积，能与皮肤很好的贴合，同时避免伤口的二次伤害。此外，所述复合支架在制备过程中，可以通过调节光交联的时间，以及掩膜的孔径大小，可调节水凝胶的物理性能，包括保水性、降解性等，以适用不同患者的需求。

所述复合支架中hADSCs的负载量和粘附性优良，且由于其具有圆柱状的明胶柱，所述复合支架与创面的贴合度高，但同时又透气性好，便于氧气和脂肪干细胞运输至创伤，从而有利于创面的愈合。

目前已有类似双层结构的复合支架公开，但是现有技术中其纤维膜采用的与本申请完全不同，其为了保证纤维膜的机械性能，通常采用聚已内酯或聚乙烯醇等材料经纺丝得到纤维膜，这种纤维膜虽然提高了复合支架整体的机械性能，但是其生物相容性以及可降解性能较差，其作为敷料进行应用时，其与伤口的贴合性、透气性能等方面明显差于本申请所述采用明胶静电纺丝纤维制备的复合支架。

另外，本申请采用光交联的方式，在明胶静电纺丝纤维膜上交联圆柱状的明胶，一方面是过程简单，条件不苛刻，适于所述复合支架负载活细胞；另一方面，圆柱状的明胶水凝胶，在保证复合支架与创伤贴合度良好的前提下，增加了复合支架的透气性，同时也便于所述复合支架向机体输送负载的活细胞、其他药物或营养物质等。

虽然现有技术中，明胶静电纺丝纤维膜作为敷料的应用较多，但通常是作为载体，负载其他的有利因子(例如维生素类物质、纳米银或其他抗菌类物质)，但是单独采用明胶制备纤维膜的较少，且单独将其制备成为敷料的应用更少，也并有将其制备成为本申请所述双层皮肤结构的的复合支架状。

优选地，圆柱状明胶水凝胶的直径为600-800μm，其直径可根据需要，控制掩膜孔径的大小，进行调节；其厚度为300-600μm。

更优选地，所述圆柱状明胶水凝胶的直径为600μm，厚度为300μm。

优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜以明胶为原料，采用静电纺丝设备纺丝得到纤维膜，然后将所得纤维膜置于京尼平-酒精溶液中进行交联固化制备得到。为了保证明胶纤维膜成型固化，此处采用京尼平进行交联反应时，必须采用京尼平-酒精溶液，而不能是京尼平-水溶液。

优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为14-18kV，针头到接收装置的距离为18-22cm，推进速度为16-18μL/min。

更优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为16kV，针头到接收装置的距离为20cm，推进速度为16.7μL/min。

优选地，所述京尼平-酒精溶液中，京尼平的质量浓度1％-2％。更优选地，所述京尼平的质量浓度为1％。

优选地，所述纤维膜交联固化过程为：将含有所述纤维膜的玻片置于京尼平-酒精溶液中，没过纤维膜，并置于4-8℃环境下静置24-48h，然后转移到32-37℃环境下静置36-48h，最后用酒精溶液清洗即得。

更优选地，所述纤维膜交联固化过程为：将含有所述纤维膜的玻片置于京尼平-酒精溶液中，没过纤维膜，并置于4℃环境下静置24h，然后转移到37℃环境下静置36h，最后用酒精溶液清洗即得。

优选地，用于清洗的酒精溶液的体积浓度为75％-90％；更优选地，酒精的体积浓度为90％。

优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜制备过程为：将明胶溶于六氟异丙醇中，制备得到静电纺丝溶液，然后在室温、湿度低于50％条件下，静电纺丝设备的正极高压喷射头采用8#平头针头(长度20cm)，调电压16kV，针头到接收装置的距离为20cm，推进速度为16.7μL/min，静电纺丝溶液体积为320μL；在自行组装的大小为10cm×10cm的平台上平铺铝箔纸，放置若干15mm的玻片，用于收集纺丝纤维膜。

优选地，所述静电纺丝溶液中，明胶的质量体积浓度为0.1-0.15g/mL；更优选地，明胶的质量体积浓度为0.1g/mL。

优选地，所述脂肪干细胞悬浮液中，细胞的数量为1×10⁴～3×10⁴个；更优选地，细胞的数量为1.5×10⁴个。

优选地，所述脂肪干细胞悬浮液的制备过程为：hADSCs(人源脂肪干细胞)体外扩增至P3-P4代，对培养瓶内细胞用PBS清洗两遍后，使用胰酶消化，计数后离心，加培养基重悬。

优选地，所述明胶光交联溶液为：质量浓度10％-30％Type A型明胶PBS溶液、联吡啶钌PBS溶液、过硫酸钠PBS溶液和质量浓度0.05～0.2％胭脂红PBS溶液，按照体积比为8:1:1:6配置而成。

优选地，Type A型明胶PBS溶液的质量浓度为30％。

优选地，所述联吡啶钌PBS溶液中溶质的浓度为16～32mM；所述过硫酸钠PBS溶液中溶质的浓度为160～320mM。

优选地，所述光交联作用在PDMS模具及掩膜存在下进行，其过程为：将所述明胶静电纺丝纤维膜置于PDMS模具中，然后加入所述明胶光交联溶液，盖上掩膜，并经过光照进行交联反应，加PBS溶解未交联的部分(由于未发生光交联作用的明胶溶液在37℃条件下很好的溶解于PBS溶液，因此这一过程在37℃条件下进行)，最后再浸泡于京尼平-缓冲溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。

优选地，所述光照条件为：光源为冷光源LED白光，光照时间为8～20min，光源距离为7～20cm。

优选地，所述京尼平-PBS溶液中京尼平的体积比例为0.5％；所述PBS溶液为pH为7.4。

本发明同时还保护所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架的制备方法，包括如下步骤：

S1.制备明胶静电纺丝纤维膜：将明胶溶于六氟异丙醇中，制备得到静电纺丝溶液，然后在室温、湿度低于50％条件下，经静电纺丝设备制备，收集纺丝纤维膜，并在京尼平-酒精溶液中进行交联固化，洗净后得到明胶静电纺丝纤维膜；

S2.制备PDMS模具及掩膜：采用PDMS模具产品制备所需形状的上层模具和下层模具；所述掩膜为PET膜，可按照需要设计其图案，然后将S1制备好的明胶静电纺丝纤维膜置于PDMS上层模具中；

S3.负载脂肪干细胞：脂肪干细胞经贴壁培养后，加入细胞胰酶消化，计数离心，加细胞培养基重悬后，滴加到明胶静电纺丝纤维膜上，静置；

S4.光交联作用：配置光交联溶液，待脂肪干细胞贴附在明胶静电纺丝纤维膜上后，加入光交联溶液，静置，然后盖上掩膜，并经光照进行交联反应；

S5.待光交联反应结束后，加PBS在37℃环境下溶解未交联的部分，最后再浸泡于京尼平-缓冲溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。

优选地，步骤S1中，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为14-18kV，针头到接收装置的距离为18-22cm，推进速度为16-18μL/min。

优选地，步骤S3中，脂肪干细胞悬浮液中，细胞的数量为1×10⁴～3×10⁴个；更优选地，细胞的数量为1.5×10⁴个。

优选地，脂肪干细胞悬浮液的制备过程为：hADSCs(人源脂肪干细胞)体外扩增至P3-P4代，对培养瓶内细胞用PBS清洗两遍后，使用胰酶消化，计数后离心，加培养基重悬。

优选地，步骤S4中，所述光交联溶液为：质量浓度10-30％Type A型明胶PBS溶液、联吡啶钌PBS溶液、过硫酸钠PBS溶液和质量浓度为0.05～0.2％胭脂红PBS溶液，按照体积比为8:1:1:6配置而成。

优选地，Type A型明胶PBS溶液的质量浓度为30％。

优选地，步骤S4的过程为：将所述明胶静电纺丝纤维膜置于PDMS模具中，待脂肪干细胞贴附在明胶静电纺丝纤维膜上后，然后加入所述明胶光交联溶液，盖上掩膜，并经过光照进行交联反应，加PBS在37℃环境下溶解未交联的部分，最后再浸泡于京尼平-缓冲溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。

优选地，步骤S4中，所述光照条件为：光源为冷光源LED白光，光照时间为8～20min，光源距离为7～20cm。

所述所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架在制备创伤敷料中的应用也在本发明的保护范围之内。

所述所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架作为载体，负载细胞和/或药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

更优选地，所述细胞为脂肪干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本申请以明胶为原料，通过静电纺丝和光交联作用，制备得到双层皮肤结构水凝胶复合支架，在制备过程中，在明胶静电纺丝纤维膜和圆柱状图案化的明胶水凝胶之间，负载hADSCs细胞。所述复合支架具有双层结构，其中纤维膜相当于皮肤的表皮层，能够能阻挡异物和病原侵入，并能防止组织液丧失；图案化圆柱状明胶不仅可以支持hADSCs生存力和hADSCs粘附，还可以促进hADSCs迁移和增殖，促进皮肤组织的再生和形成；且其独特的形状，在保证复合支架与创伤贴合度良好的同时，还具有很好的透气性，较大的孔隙率和孔径，有利于伤口氧气及营养物质的运输，此外还能够促进创伤处血管的生成，其降解速度与创伤愈合周期接近，有利于创伤的愈合。

再者，所述复合支架在制备过程中，可以通过调节光交联的时间，以及掩膜的孔径大小，可调节水凝胶的物理性能，包括保水性、降解性等，以适用不同患者的需求。

附图说明

图1为负载细胞复合支架的直观图。

图2为明胶静电纺丝纤维膜(图中简称纤维膜)和复合支架负载细胞并培养7d后，其细胞负载情况。

图3为明胶静电纺丝纤维膜(图中简称纤维膜)和复合支架负载细胞8d后，细胞的存活情况。

图4为糖尿病大鼠创面血流血流分析的结果。

图5为糖尿病创面新生组织CD31染色结果

图6为糖尿病大鼠创面光学相干断层扫描OCT成像分析结果。

图7为糖尿病创面新生组织H&E染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架

一、明胶静电纺丝纤维膜的制备

配制静电纺丝溶液：用微量电子天平称取明胶0.5g溶于5mL六氟异丙醇(HFIP)于玻璃瓶(10mL)中，加磁力搅拌子，置于磁力搅拌器，磁力搅拌24h，待用。

静电纺丝方法：静电纺丝实验在室温、湿度低于50％条件下进行。正极高压喷射头采用8#平头针头(长度20cm)，调电压16kV，针头到接收装置的距离为20cm，推进速度为16.7μL/min，静电纺丝溶液体积为320μL。在自行组装的大小为10cm×10cm的平台上平铺铝箔纸，放置若干15mm的玻片，以便样品收集。

实验过程中用光学显微镜观察纤维膜形貌。

纤维膜交联：将含有纤维膜的玻片从铝箔剪下放在孔板中，每孔加1％京尼平溶液(溶于90％酒精)，没过纤维膜，放在4℃冰箱24h后，转移到37℃培养箱放置36h，吸出原来的溶液，用90％酒精清洗三遍，在超净台上风干，储存在4℃冰箱待用。

二、PDMS(聚二甲基硅氧烷)模具制备

采用道康宁DC184硅橡胶进行制备PDMS模具。将其中的本组分与固化剂按10:1重量比完全混合，并按照说明书内容进行制备模具。

(1)上层模具

在35mm的培养皿中加2mL的PDMS，抽真空30min，在室温下，平的实验台上放置12小时，最后放在80℃烘箱30min固化，模具用15mm打孔器在中间打孔。

(2)下层模具

在60mm的培养皿中加1.5mL的PDMS，抽真空30min，在室温下，平的实验台上放置12小时，最后放在80℃烘箱30min固化，模具剪成正方形。

(3)掩膜的制备

使用纳秒激光器在PET膜上按照设计的图案：400μm的圆，圆心间距离为800μm进行激光加工直径为2cm的圆形膜，打标次数为50次。将所得圆形PET膜喷不透光的黑色漆，晾干。

三、复合支架的制备

主要溶液配制

(1)30％Type A型明胶溶液：称取6g明胶颗粒置于50mL离心管中高温高压蒸汽灭菌后加入20mL无菌PBS溶液，50℃烘箱使其充分溶解，溶解后密封置于4℃冰箱保存。

(2)0.5％京尼平溶液：称量5g京尼平溶于100mL PBS溶液中，600rpm磁力搅拌2h充分溶解后，过滤灭菌置于4℃保存。

制备过程：

1、将上述所得的PDMS模具、掩膜，酒精浸泡4h灭菌后，在超净台风干；

2、用镊子将下层模具放到60mm培养皿中，保持平整；将步骤一制备的明胶静电纺丝纤维膜放在模具中间(模具中打的孔中)，放置上层模具后，加适量细胞培养基或甘氨酸溶液至没过明胶静电纺丝纤维膜，37℃培养箱放置1.5h；这一过程保证明胶静电纺丝纤维膜完全停止交联反应，同时保证明胶静电纺丝纤维膜呈水凝胶状；

其中细胞培养基为本领域常规使用的细胞培养基，本实施例所采用的细胞培养基的成分为：DMEM低糖培养基、胎牛血清、双抗，具体的制备过程为：89％DMEM,10％胎牛血清，1％双抗。

上述甘氨酸溶液的质量浓度为0.015-0.02g/mL；

3、配制光交联溶液：取上述配置好的30％Type A型明胶溶液0.5mL，16～32mM联吡啶钌62.5μL，160～320mM过硫酸钠62.5μL，质量浓度0.05～0.2％胭脂红溶液375μL至EP管中，吹打使其混合均匀；上述溶液均为pH为7.4的PBS溶液进行配置；

4、将70～200μL的光交联溶液滴加到PDMS模具中明胶静电纺丝纤维膜上，然后避光静置2min，待光交联溶液凝固后，加掩膜，冷光源LED白光光照8～20min，LED光源距离明胶静电纺丝纤维膜距离7～20cm；

5、待光照结束后，再加入PBS至浸没支架，然后置于37℃培养箱中静置10min，溶解未交联的部分，吸去PBS，加1mL 0.5％上述配好的京尼平溶液，放到培养箱30～60min，吸去京尼平溶液，加PBS洗两遍后，加培养基，停止交联。即制备得到双层皮肤结构水凝胶复合支架。

上述过程制备的是未负载脂肪干细胞的双层皮肤结构水凝胶复合支架。参照上述过程，在第3步，配置光交联溶液之前，配置好脂肪干细胞悬浮液，并添加到明胶静电纺丝纤维膜上贴附后，再按照上述过程，进行后续的步骤，即可得到所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架。

其中，配置脂肪干细胞悬浮液并贴附在明胶静电纺丝纤维膜上的过程为：脂肪干细胞经贴壁培养P3-P4代后，加入细胞胰酶消化，计数离心，加细胞培养基重悬后，滴加到明胶静电纺丝纤维膜上，直径为15mm圆形纤维膜上滴加含有1.5×10⁴细胞量的细胞悬液，静置用于细胞贴附在纤维膜上。

实施例2负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架

1、制备的负载hADSCs双层皮肤结构水凝胶复合支架的外观如图1所示。

从图1中可知，制备的负载hADSCs的双层皮肤结构水凝胶复合支架呈水凝胶状，其中明胶静电纺丝纤维膜为基底层，其上均匀排列着圆柱状的明胶水凝胶，且圆柱状水凝胶之间保持一定的间隔。

实施例1中制备的复合支架，其整体厚度为350μm；其中圆柱状的水凝胶的直径为600μm；高度为300μm。

2、检测所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架的细胞负载情况

以实施以1中制备的明胶静电纺丝纤维膜为对比，比较其与复合支架对于细胞的负载量和稳定性的影响。

其中明胶静电纺丝纤维膜(图中简称纤维膜)和复合支架负载hADSCs并培养7d后，其hADSCs负载情况如图2所示，其中hADSCs经负载7d后，先后经F-ACTIN(绿色)和DAPI(蓝色的)，得到染色图如图2所示，从中可以观察到，hADSCs在纤维膜上浸润性生长，细胞形态较好，说明明胶静电纺丝纤维膜适合hADSCs粘附和增殖，且圆柱状的水凝胶不影响hADSCs在明胶静电纺丝纤维膜上的粘附。

明胶静电纺丝纤维膜(图中简称纤维膜)和复合支架负载hADSCs8d后，hADSCs的存活情况如图3所示。负载hADSCs第八天后，经Calcein AM/PI染色，染色结果如图3所示。从染色结果可知，负载hADSCs的复合支架，培养八天后，复合支架中具有大量活细胞(绿色)和少量死细胞(红色)。细胞死活染色进一步证实了支架的良好细胞相容性，具有良好的微环境可以促进细胞粘附和增殖。同时支架能将细胞运送到伤口区域，保证其存活率。

3、测试所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架对于创面的影响作用

Ⅰ型糖尿病大鼠(TIDM)建模

(1)取SD大鼠(8周龄，体重200～250g，雄性)10只诱导TIDM造模，造模前禁食24小时。造模前称量每只大鼠体重，并取尾静脉血液测量每只大鼠的空腹血糖值。

(2)1％STZ溶液按50mg/kg的剂量，腹腔注射。造模后，尾静脉采血测量大鼠血糖。若诱导前血糖值<8.9mmol/L，诱导后连续三日血糖值≥16.7mmol/L，即认为是造模成功。如诱导TIDM造模失败，正常饮食饲养大鼠并监测血糖值，待大鼠血糖恢复至正常值且无明显异常后继续按50mg/kg的剂量，注射1％STZ溶液重新诱导TIDM建模。

全层皮肤切除创伤模型的建立

上述成功造模的TIDM大鼠，正常饮食饲养四周，每隔三天测量体重及血糖值。取TIDM大鼠，腹部局部消毒，使用10％水合氯醛溶液，按4.5mL/kg剂量腹腔注射麻醉。显效后，剔除大鼠前肢及背侧毛发，并涂一层脱毛膏，10分钟后去除脱毛膏并使用酒精棉球擦拭消毒。以大鼠脊椎为中线，各创面间隔距离为2cm，使用直径为15mm的活检打孔器建立4个全层皮肤切除创伤模型，深至大鼠肌肉层，最后用手术剪将皮肤层与肌肉组织连接的筋膜剪掉。用无菌棉球擦干创面，采用自身对照，以左侧为空白(无治疗)，左侧下方滴加hADSCs细胞悬液(约50μL,细胞量为3×10⁴)，右侧上方敷未负载hADSCs复合支架，右侧下方敷负载hADSCs复合支架；然后用PI透明敷料(含直径20mm垫圈)覆盖上述伤口，并进一步用自粘绷带固定。

采用血管显像仪检测大鼠创面其血管的生成情况。血管显像仪的工作原理是当红外光线照射人体组织时，静脉血管中的血红蛋白比周围组织对红外光线有更明显的吸收效果，在用红外摄像头摄取时会形成很明显的静脉血管图像，经专门的软硬件图像处理***转换后，显示到屏幕显示器上，形成静脉血管的可见图像，辅助静脉定位显示。

术后三天后，糖尿病大鼠创面血流血流分析的结果如图4所示。图中的细胞组为滴加hADSCs细胞悬液组，支架组为未负载hADSCs细胞复合支架组，负载细胞支架组为负载hADSCs细胞复合支架组。

从图4中可知，与空白组和细胞组相比，复合支架组(负载细胞和不负载细胞)伤口的新生血管生成的更多，血管密度更高，几乎整个创面有血流迹象，负载细胞支架组相比于支架组效果更明显，进一步证明了材料能够促进糖尿病伤口的血管生成。

对于糖尿病伤口，血管再生对于创面愈合极为重要。CD31的免疫组织化学染色结果如图5。术后第3，创面浅层肉芽组织中合支架组(负载细胞和不负载细胞)材料周围均出现大量血管，其中负载细胞支架组血管密度最高。hADSCs在明胶复合支架中三维培养可增强其旁分泌作用，如增加促血管生成因子VEGF等基因及蛋白表达，从而促进血管再生。新血管的生成利于创面营养物质和氧气运输，改善创面微环境，促进伤口愈合。

术后三天和八天后，糖尿病大鼠创面光学相干断层扫描OCT成像分析结果如图6所示。光学相干断层扫描仪利用生物组织不同深度层对入射弱相干光的背向反射或几次散射信号进行扫描后得到重新构建的组织截面断层图像。从图6中可以看到，创面第三天水凝胶仍呈现图案化，能保护负载的细胞，且支架材料与伤口能很好的贴合，支架在伤口分布均匀。第八天，下层圆柱状的水凝胶开始降解，吸收，被新生组织所替代，且新生组织向创面处生长(图中虚线框)

术后三天、十三天和二十天后，糖尿病创面新生组织H&E染色结果如图7所示。从图7中可知，术后第3天，各组均可见新生肉芽组织，其中包括炎症细胞和红细胞的广泛浸润。负载hADSCs细胞复合支架组可见更多的细胞向水凝胶处迁移和增殖，炎症细胞少。第十三天，负载hADSCs细胞复合支架组已有新生表皮覆盖大部分创面。第二十天，负载hADSCs细胞复合支架组可见成熟毛囊和皮脂腺，材料完全降解，新生肉芽组织比其他组厚。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架，其特征在于，所述复合支架以明胶静电纺丝纤维膜为基底，加入脂肪干细胞悬浮液，待细胞附在明胶静电纺丝纤维膜后，再加入明胶光交联溶液，然后经光交联作用制备成阵列排布图案化圆柱状明胶水凝胶，即为负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架；

所述明胶静电纺丝纤维膜以明胶为原料，采用静电纺丝设备纺丝得到纤维膜，然后将所得纤维膜置于京尼平-酒精溶液中进行交联固化制备得到；

所述明胶光交联溶液为：质量浓度10-30％Type A型明胶PBS溶液、联吡啶钌PBS溶液、过硫酸钠PBS溶液和质量浓度为0.05～0.2％胭脂红PBS溶液，按照体积比为8:1:1:6配置而成。

2.根据权利要求1所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架，其特征在于，所述圆柱状明胶水凝胶的直径为600-800μm，厚度为300-600μm。

3.根据权利要求1所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架，其特征在于，所述脂肪干细胞悬浮液中，细胞的数量为1×10⁴～3×10⁴个。

4.根据权利要求1所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架，其特征在于，所述光交联作用在PDMS模具及掩膜存在下进行，其过程为：将所述明胶静电纺丝纤维膜置于PDMS模具中，然后加入所述明胶光交联溶液，盖上掩膜，并经过光照进行交联反应，加PBS溶解未交联的部分，最后再浸泡于京尼平-PBS溶液中进一步固化，清洗后即得所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架。

5.根据权利要求4所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架，其特征在于，所述光照条件为：光源为冷光源LED白光，光照时间为8～20min，光源距离为7～20cm。

6.一种权利要求1所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S5.待光交联反应结束后，最后再浸泡于京尼平-PBS溶液中进一步固化，清洗后即得所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架。

7.权利要求1至5任一所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架在制备创伤敷料中的应用。

8.权利要求1至5任一所述负载hADSCs双层皮肤仿生水凝胶复合支架作为载体，负载药物中的应用。