CN112662795B - 用于感染性病原体检测的阳性对照品及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于感染性病原体检测的阳性对照品及其制备方法与应用，包括第一、第二阳性对照品，第一阳性对照品中病原体包括革兰氏阳性菌发酵乳杆菌、芽孢梭菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、威尔斯李斯特菌、革兰氏阴性荧光假单胞菌、产气克雷伯菌、大肠埃希氏杆菌；真菌黑曲霉、酿酒酵母及噬菌体T1，第二阳性对照品中病原体核酸包括细菌表皮葡萄球菌、真菌黑曲霉、病毒单纯疱疹病毒、噬菌体T1、病毒腺相关病毒、病毒轮状病毒、病毒呼吸道合胞病毒、病毒水疱性口炎病毒、噬菌体MS2。本发明提供了方便、安全、直接可用的双重对照标准品，同时从不同角度进行阳性标准对照，确保了感染性疾病宏基因组检测流程的准确性和稳定性。

Description

用于感染性病原体检测的阳性对照品及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于病原体检测技术领域，尤其涉及一种用于感染性病原体检测的阳性对照品及其制备方法与应用。

背景技术

感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。目前感染性疾病检测面临着以下几大痛点：一、造成感染的病原体种类繁多，致病原因不明，诊断困难；二、无法准确获取耐药信息，造成用药困难；三、传统检测方法存在耗时长、部分病原体难以培养、敏感性低、有窗口期、检测数量有限等局限性。

近年来快速发展的NGS(高通量测序)技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，mNGS(宏基因组测序)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的病原微生物，该技术打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物领域展现了广阔的前景。

然而感染性疾病的致病病原体种类繁多，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等，由于病原体结构不同，如革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁厚度不同，病原体的大小和含量差异，病原体核酸类型(单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA)的差异，给病原体检测带来难度，无标准化的处理会造成病原体检出结果偏差甚至出现假阴性和假阳性的结果。

现在NGS平台的感染性病原体检测，需要严格的质量控制标准，保证检测方法的稳定性。该技术的质量控制，依赖于标准品的设置，而病原体标准品制备复杂，操作风险高(一般要求BSL-2级以上实验室)，病原检测技术具有不稳定性，所以目前尚无针对临床需要的成熟稳定的商品化标准品。

发明内容

鉴于现有技术存在上述缺陷，本发明的目的在于提供一种用于感染性病原体检测的阳性对照品及其制备方法与应用。

本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：

用于感染性病原体检测的阳性对照品，包括第一阳性对照品，所述第一阳性对照品中的病原体包括革兰氏阳性菌发酵乳杆菌、芽孢梭菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、威尔斯李斯特菌，革兰氏阴性荧光假单胞菌、产气克雷伯菌、大肠埃希氏杆菌，真菌黑曲霉、酿酒酵母及噬菌体T1。

优选地，所述第一阳性对照品中病原体的拷贝数混合比例为:革兰氏阳性菌发酵乳杆菌:芽孢梭菌:枯草芽孢杆菌:表皮葡萄球菌：威尔斯李斯特菌:革兰氏阴性荧光假单胞菌:产气克雷伯菌:大肠埃希氏杆菌:真菌黑曲霉:酿酒酵母及噬菌体T1为16.44:16.44:16.44:16.44:16.44:5.48:5.48:5.48:0.55:0.55:0.27。

优选地，所述对照品还包括第二阳性对照品，其病原体核酸包括：表皮葡萄球菌；真菌黑曲霉；单纯疱疹病毒；腺相关病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、水疱性口炎病毒、噬菌体T1、噬菌体MS2。

优选地，所述第二阳性对照品，其病原体基因组结构包括：DNA双链、DNA单链、RNA双链和RNA单链。

优选地，所述第二阳性对照品中病原体核酸混合拷贝数的比例为表皮葡萄球菌：真菌黑曲霉：单纯疱疹病毒：腺相关病毒：轮状病毒：呼吸道合胞病毒：水疱性口炎病毒：噬菌体T1：噬菌体MS2为2:1:2:2:2:2:2:2:2。

优选地，所述第二阳性对照品中病原体基因组结构比例为DNA双链：DNA单链：RNA双链：RNA单链为7:2:2:6。

优选地，所述第一阳性对照品的制备包括如下步骤，按病原体比例混合，添加菌体裂解液，50-70℃下孵育20-40分钟；所述菌体裂解液的组成为，Tris-HCl，EDTA，异硫氰酸胍，LiCl及SDS的混合液，其中所述Tris-HCl的pH＝9。

优选地，所述阳性对照品应用于包括且不限于为微生物检测、模拟临床用样本。

优选地，所述阳性对照品应用方式包括且不限于高通量测序、荧光定量PCR检测、多重PCR和病原体探针捕获检测等方法。

优选地，所述阳性对照品应用于微生物检测时，对所述第一阳性对照品进行处理，其步骤为，添加溶菌酶，进行室温孵育，添加蛋白酶K后进行消化；通过MP组织破碎仪，进行机械破碎；对所述第二阳性对照品中的病原体根据核酸基因组类型分为两组，分别为DNA双链的表皮葡萄球菌、DNA双链的黑曲霉、DNA双链的单纯疱疹病毒、DNA双链的噬菌体T1构成的第一组，及由DNA单链的腺相关病毒、RNA双链的轮状病毒、RNA单链的呼吸道合胞病毒、RNA单链的水疱性口炎病毒、RNA单链的噬菌体MS2构成的第二组。

本发明突出效果为：本发明提供了方便、安全、直接可用的双重对照标准品，同时从两个角度进行阳性标准对照，确保了感染性疾病宏基因组检测流程的准确性和稳定性。

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1是文库产出稳定性分析T1标准曲线设置示意图。

图2是文库产出稳定性分析MS2标准曲线设置示意图。

具体实施方式

本发明揭示了一种用于感染性病原体检测的阳性对照品及其制备方法与应用。

病原体来源、培养和保存

1)所需病原体来源于实验室已有研究的毒株或采购于ATCC：

2)所需病原体核酸来源于病原体培养后提取，也可直接采购病原体核酸：

3)病原体培养

A细菌、真菌

培养：根据病原体说明书，选用最适的培养条件(培养基、温度、培养时间等)培养菌种。培养时间应掌握在生长后期，因为对数生长期的细胞对冷冻干燥的抵抗力较弱。一般细菌培养24～48h，操作时，在无菌条件下轻轻刮下菌苔或孢子，制成菌悬液。

细胞数计算：将细菌/真菌用特定的培养基复苏并培养至可传代的浓度后，在无菌操作条件下，用无菌移液枪头吸取1mL已充分混匀的菌/孢子悬液，加入9mL生理盐水，混匀得10^-1管，同法依次稀释至10^-6。于上述盛有不同稀释度菌液(0.2mL)的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的相应培养基约10-15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养。培养相应时间后(如24h)，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数。

按下列公式进行计算：

每毫升中菌落形成单位(cfu)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

B噬菌体(T1、MS2)

培养：使用大肠杆菌作为噬菌体宿主，以液体培养法于适当温度下培养，振摇孵育直至对数生长中期(OD600～0.5)。蘸取少量噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培养，直至试管中菌悬液由浑浊变清，培养物经离心(8000rpm/30min)后取上清液，0.22um微孔滤膜过滤，-20℃保存待用。

噬菌体滴度测定：.

①稀释噬菌体：

将4管含0.9ml液体培养基的试管分别标写10-3，10-4，10-5和10-6。

用1ml无菌吸管吸0.1ml 10-2噬菌体，注入10-3的试管中，旋摇试管，混匀。

用另一支无菌吸管从10-3管中吸0.1ml加入10-4管中，混匀，余类推，稀释至10-6管。

②噬菌体与菌液混合

将5支灭菌空试管分别标写10-4，10-5，10-6，10-7和对照。

用吸管从10-3噬菌体稀释管吸0.1ml加入10-4的空试管内，用另一支吸管从10-4稀释管内吸0.1ml加入10-5空试管内，直至10-7管。

将宿主菌培养液摇匀，用吸管取菌液0.9ml加入对照试管内，再吸0.9ml加入10-7试管，如此从最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9ml大肠杆菌培养液。

将以上试管旋摇混匀。

③混合液加入上层培养基内

将5管上层培养基溶化，标写10-4，10-5，10-6，10-7和对照。使冷却至48℃，并放入48℃水浴箱内。

分别将4管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合液后，立即旋摇混匀。

④接种了的上层培养基倒入底层平板上

将旋摇均匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板。

凝固后，倒置于37℃培养。

⑤观察平板中的噬菌斑，并选取30～300个pfu数的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数(效价)。噬斑数乘以稀释度即可获得每ml噬菌体的滴度-噬斑形成单位(pfu)。

C病毒(单纯疱疹病毒HSV、腺相关病毒AAV、水疱性口炎病毒VSV)培养和保存：

①单纯疱疹病毒HSV-2：

a.10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基培养Vero细胞至平皿90％密度；

b.弃去原有培养基，加入2％FBS的EMEM培养，加入HSV病毒(最佳MOI：0.1)，于5％CO₂培养箱(37℃)中感染1-2h，再次弃去上清，更换新培养基(2％FBS的EMEM)；

c.感染2-5天后观察细胞大部分已死亡漂浮即可收集细胞上清，分装冻存于-80℃冰箱。

②腺相关病毒AAV-2：

a.10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基培养HEK-293细胞至平皿80-90％密度；

b.弃去原有培养基，加入2％FBS的EMEM培养，加入AAV virus和helper virus(最佳MOI：1)，于5％CO₂培养箱(37℃)中感染1-2h，再次弃去上清，更换新培养基(2％FBS的EMEM)；

c.感染2-3天后观察细胞大部分已死亡漂浮即可收集细胞上清，分装冻存于-80℃冰箱

③水疱性口炎病毒VSV：

a.使用10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基培养VERO细胞到达80～90％的密度；

b.将培养基换成含5ml 2％血清的DMEM培养基，加入VSV病毒(MOI约为1)在37℃敷箱感染1h，1h后弃上清，使用PBS洗一遍后再次换成含5ml 2％血清的DMEM培养基；

C.感染18～24小时后观察细胞大部分已死亡漂浮即可收集细胞上清，分装冻存于-80℃冰箱。

本实施例中所提供的第一阳性对照包含不同裂解难度的病原体，尤其加大了革兰氏阳性菌的比例，具体组成和比例如表1所示：

表1：第一阳性对照包含的病原体及细胞比例对照表。

每种病原体培养、计数后，使用PBS将各病原体微生物分别稀释至所需细胞数量，分装至无菌离心管保存。

配置第一阳性对照时，按表1中病原体类型，各取一份已稀释的病原体，吹打混匀，将所有病原体混合到同一个无菌离心管中，并量好体积。

用移液器吸取裂解液加入第一阳性对照混合病原体的离心管中，使第一阳性对照的总体积为1mL，60℃孵育30分钟。此第一阳性对照共可使用100次。

将第一阳性对照等分为100μL/份，-80℃长期保存。

使用时，取一份第一阳性对照，等分为10μL/份，每次使用10μL，其余置于-80℃保存。

以上裂解液的选择配方如表2所示：

表2：裂解液配方表。

编号	裂解液配方
		L1	100mM Tris-HCl(pH 9)，40mM EDTA，4M异硫氰酸胍
L2	500mM NaCl，50mM Tris-HCl，50mM EDTA，4％SDS
		L3	100Tris-HCl(pH 9),40mM EDTA,4M异硫氰酸胍，3.5M LiCl，3％SDS

病原体按照第一阳性对照所需的细胞量混合好之后，吹打混匀，加入裂解液之前取出1/20体积，等分为3份。

分别加入700μL的L1、L2、L3裂解液。

加入20μg/μL蛋白酶K，55℃消化30分钟。

使用MP组织破碎仪进行物理破碎，设置条件为6m/s，20s/次，3次/样。

使用试剂盒AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen，货号80204)进行病原体DNA提取。

取1ng DNA，使用转座酶法进行测序文库构建，Illumina Novaseq测序仪进行测序，每个样品产出6Gb的原始数据。

使用Trimmomatic软件对原始数据进行质控，得到有效数据(Clean Data)，利用Soap软件将有效数据与宿主基因组序列比对，去除宿主数据，进一步提高分析效率，通过MetaPhlAn2对最终的有效数据进行物种注释，随后统计物种注释结果。通过物种注释，统计病原信息。

物种注释结果如表3所示：

表3：不同裂解液配方对第一阳性对照带来的偏差对比表。

由上可知，优选L3配方的裂解液作为第一阳性对照的菌体保存和核酸提取裂解液。

为更好的体现对病原体处理条件的选择，以下进行相应实验的筛选：

表4：对病原体进行不同的处理方式表。

取出7份已配置完成的第一阳性对照，加入700μL的裂解液。

分别按照表4中的不同处理条件进行病原体处理。

使用试剂盒AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen，货号80204)进行病原体DNA提取。

取1ng DNA，使用转座酶法进行测序文库构建，Illumina Novaseq测序仪进行测序，每个样品产出6Gb的原始数据。

使用Trimmomatic软件对原始数据进行质控，得到有效数据(Clean Data)，利用Soap软件将有效数据与宿主基因组序列比对，去除宿主数据，进一步提高分析效率，通过MetaPhlAn2对最终的有效数据进行物种注释，随后统计物种注释结果。通过物种注释，统计病原信息。

病原体处理结果如表5所示：

表5：对病原体处理结果对比表。

由以上结果确定病原体处理方式优选为：溶菌酶(3mg/mL)，室温10分钟，蛋白酶K(20μg/μL)，55℃消化30分钟，MP组织破碎仪(6m/s，30s/次，4次/样)。

本发明所提供的第二阳性对照作为对第一阳性对照的补充和完善，在保证高难度病原体核酸获得完整的条件下，进一步补充了病原体基因组结构的4种形式，以下从真实病原体核酸进行配比，模拟临床样本核酸复杂性。

使用试剂盒AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen，货号80204)提取表皮葡萄球菌、黑曲霉、噬菌体T1、噬菌体MS2的核酸。使用试剂盒QIAamp UltraSens Virus Kit(Qiagen，货号53704)提取单纯疱疹病毒、腺相关病毒、水疱性口炎病毒的核酸。轮状病毒和呼吸道合胞病毒核酸均采购于ATCC。使用数字PCR检测病原体核酸拷贝数。其中病原体核酸所需拷贝数比例如表6所示：

表6：病原体核酸信息表。

为更好选择出针对第二阳性对照的分组配置，以下根据检测方式的不同将表6中的基因组结构进行分组，分组方式如表7所示。

表7：第二阳性对照中的核酸基因组分类示意表。

N1-1和N2-1建库：取1ng DNA，使用转座酶法进行测序文库构建，IlluminaNovaseq测序仪进行测序，每个样品产出6Gb的原始数据。

N2-1和N2-2建库：取10pg RNA，使用试剂盒Ovation solo RNA-seq system(Tecan，货号0500-32)进行文库构建，每个样品产出10Gb的原始数据。

对测序数据进行分析，进行物种注释。病原体核酸测序数据结果如表8所示：

表8：病原体核酸测序数据结果表。

由以上结果确定，当DNA单链与DNA双链组合时，DNA建库方法会造成单链DNA病原体检出偏低；当DNA单链与RNA同时建库时，可以提高单链DNA病原体的检出。由此确定第二阳性对照的病原体核酸分组优选为：N1的分类方式，按照N1方式将病原体核酸分组混合，此为第二阳性对照。

临床样本模拟处理

根据第二阳性对照的分组处理，为保证病原体检出的完整性和准确性，临床样本尤其要注意DNA单链病原体的处理方式。根据第二阳性对照对病原体核酸拷贝数的要求，将表中9种病原体混合，模拟临床样本的复杂性。

临床样本模拟处理方式如表9所示：

表9：临床样本模拟处理方式。

将混合后的模拟临床样本分成3份，使用试剂盒AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen，货号80204)同时提取DNA和RNA。其中S1的DNA和RNA分别保存，S2和S3的DNA、RNA进行混合。

S2样本处理：将S2样本分为2份，分别使用DNA酶I和RNA酶A处理，得到S2-RNA和S2-DNA。

S3样本处理：使用HL-dsDNase对S3样本进行处理，得到S3-RNA。

S1-DNA、S2-DNA使用转座酶法进行文库构建，Illumina Novaseq测序仪进行测序，每个样品产出6Gb的原始数据。

S1-RNA、S2-RNA和S3-RNA使用试剂盒Ovation solo RNA-seq system(Tecan，货号0500-32)进行文库构建，每个样品产出10Gb的原始数据。

对测序数据进行分析，进行物种注释。临床样本模拟测序数据如表10所示：

表10：临床样本模拟测序数据结果。

由以上结果确定，S3处理方法可提高单链DNA病毒的检出，S1和S2处理会降低单链DNA病毒的检出，因此根据临床样本的检测目的，可针对性的选择处理方式：宏基因组检测可选择S1和S2的处理方法，只针对双链DNA进行分析；宏病毒组的检测需要结合S1和S3或结合S2和S3，可提高单链DNA病毒的检出。

稳定性检测

为准确评估微生物检测方法的稳定性，对阳性对照、阴性对照和临床样本进行测试，每个样本进行3次平行实验，实验样本及说明如表11所示：

表11：微生物检测的稳定性测试样本。

①测序数据稳定性分析

对上述样品测序数据进行筛选，得到处理后样本序列，将所述处理后样本序列与参考序列进行比对，绘制各病原体比例。阳性对照病原体比例与理论值进行比较，确定病原体检出偏差。阳性对照检出结果如表12-13所示：

表12：稳定性检测第一阳性对照的检出结果。

表13：稳定性检测第二阳性对照的检出结果。

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通过物种注释结果，统计噬菌体T1 reads数(测序数据条数)和噬菌体MS2 reads数在样本总reads数的比例，如表14-15所示：

表14：T1测序数据条数占比结果。

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表15：MS2测序数据条数占比结果。

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根据样本中病原体丰度不同，样本中T1和MS2比例差异较大，所述阳性对照中T1和MS2数据条数的占比应大于万分之0.5。

②文库产出稳定性分析

对已测序样本的起始核酸、测序文库进行荧光定量PCR实验，通过Taqman法的绝对定量，分别计算起始样本和测序文库中噬菌体T1和MS2的绝对含量，计算文库产出稳定性(CV值)，所述CV值应<20％。

CV值计算公式：

单拷贝文库产出＝文库中噬菌体T1(或MS2)拷贝数÷起始核酸噬菌体T1(或MS2)拷贝数。

文库稳定性CV值＝STDEV.S(单拷贝文库产出)÷AVERAGE(单拷贝文库产出)。

荧光定量PCR的结果如下：

A.结合图1所示，标准曲线设置(T1)：

文库产出稳定性计算结果(T1)：

B.结合图2所示，标准曲线设置(MS2)：

	平均Ct	MS2拷贝数
			std 1	18.20387268	531000
std 2	21.8133405	53100
			std 3	25.69413567	5310
std 4	29.82939021	531
			std 5	33.49228795	53.1

文库产出稳定性计算结果(MS2)：

综上所述，本发明所提出的阳性对照应用于微生物检测时具有稳定性。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种用于痰液病样本感染性病原体检测的双重对照标准品，其特征在于：包括第一阳性对照品，所述第一阳性对照品中的病原体包括革兰氏阳性菌发酵乳杆菌、芽孢梭菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、威尔斯李斯特菌，革兰氏阴性荧光假单胞菌、产气克雷伯菌、大肠埃希氏杆菌，真菌黑曲霉、酿酒酵母及噬菌体T1；所述标准品还包括第二阳性对照品，其病原体核酸包括：表皮葡萄球菌；真菌黑曲霉；单纯疱疹病毒；腺相关病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、水疱性口炎病毒、噬菌体T1、噬菌体MS2；

所述第二阳性对照品，其病原体基因组结构包括：DNA双链、DNA单链、RNA双链和RNA单链；

所述第一阳性对照品中病原体的拷贝数混合比例为:革兰氏阳性菌发酵乳杆菌:芽孢梭菌:枯草芽孢杆菌:表皮葡萄球菌：威尔斯李斯特菌:革兰氏阴性荧光假单胞菌:产气克雷伯菌:大肠埃希氏杆菌:真菌黑曲霉:酿酒酵母及噬菌体T1为16.44:16.44:16.44:16.44:16.44:5.48:5.48:5.48:0.55:0.55:0.27；

所述第二阳性对照品中病原体核酸混合拷贝数的比例为表皮葡萄球菌：真菌黑曲霉：单纯疱疹病毒：腺相关病毒：轮状病毒：呼吸道合胞病毒：水疱性口炎病毒：噬菌体T1：噬菌体MS2为2:1:2:2:2:2:2:2:2；

所述第二阳性对照品中病原体基因组结构比例为DNA双链：DNA单链：RNA双链：RNA单链为7:2:2:6。