CN112662605B

CN112662605B - Yh66_10715基因改造的生产l-异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN112662605B
Application number: CN202011631243.7A
Authority: CN
Inventors: 杨立鹏; 孟刚; 魏爱英; 赵春光; 马风勇; 贾慧萍; 苏厚波; 周晓群
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112662605A

Abstract

本发明公开了YH66_10715基因改造的高产L‑异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用。本发明将谷氨酸棒杆菌中野生型YH66_10715基因中引入点突变，使SEQ ID NO:1的第991位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)所得到的核苷酸序列。本发明还提供一种重组菌株是将该多核苷酸序列导入产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌中获得，重组菌株中包括含有点突变的YH66_10715基因，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L‑异亮氨酸。

Description

YH66_10715基因改造的生产L-异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及YH66_10715基因改造的生产L-异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用。

背景技术

L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。因此，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业。L-异亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。目前，生产L-异亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。谷氨酸棒杆菌具有无内毒素、代谢同工酶少，有利于解除反馈抑制或转录衰减以及关键代谢酶抗反馈抑制能力强等特点，因此大多数研究者倾向于研究谷氨酸棒杆菌及其亚种，如谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等。

在谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖被吸收到胞内后，经过一系列的酶学反应生成草酰乙酸。草酰乙酸进一步转化生成L-天冬氨酸，而后经过十步的生物反应生成L-异亮氨酸，中间又涉及到L-赖氨酸，L-蛋氨酸，L-丝氨酸以及L-缬氨酸等其他氨基酸的代谢途径。L-异亮氨酸生物合成途径的关键酶包括天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)、高丝氨酸脱氢酶(Homoserine dehydrogenase,HDH)、高丝氨酸激酶(Homoserine kinase,HSK)、苏氨酸脱水酶(Threonine dehydrogenase,TD)和乙酰羟基氨酸合酶(Acetohydroxy acid synthase,AHAS)，而AHAS又是同时催化合成L-异亮氨酸和L-缬氨酸酶系的第一个酶，所以L-异亮氨酸的代谢调控是比较复杂的胞内合成的L-异亮氨酸经由BrnFE转运胞外，而胞外的L-异亮氨酸也会由BrnQ转运到胞内。

优良菌种的选育依然是高产L-异亮氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于找到未知性状的高产L-异亮氨酸突变株。这些突变株有可能改变L-异亮氨酸代谢途径上某一点的活性或者整个途径的重组整合，从而来提高产酸量。

虽然已筛选到一些可以提高L-异亮氨酸产量的菌株，但是为了满足日益增加的需求，仍需要找到更多高产L-异亮氨酸的突变株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L-异亮氨酸生产能力。为了实现上述目的，本发明的发明人研究发现，具有L-异亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)中YH66_10715基因(GenBank：AKF27993.1)，可以通过修饰该基因或改善其表达，获得L-异亮氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-异亮氨酸能力更强。

本发明采用如下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供了生成L-异亮氨酸的细菌，其具有编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ IDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因YH66_10715编码的蛋白。

所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-异亮氨酸生产能力。

在本发明中，术语“具有L-异亮氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-异亮氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-异亮氨酸的细菌。具有L-异亮氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-异亮氨酸的细菌。

术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。

在本发明中，除非另有说明，术语“L-异亮氨酸”是指游离形式的L-异亮氨酸、其盐或其混合物。

所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。

可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体***或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。

可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。

在本发明的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。

在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。

在本发明的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。

在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第331位脯氨酸被不同的氨基酸所取代。

根据本发明，优选第331位脯氨酸变为丝氨酸所取代。

根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第331位脯氨酸变为丝氨酸所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第991位碱基发生突变而形成的。

根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第991位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。

在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸(YH66_10715)的启动子。

如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因***宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的***。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。

在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。

如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以***宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。

根据本发明，所述细菌可以是属于棒杆菌属的微生物，例如嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)等。

在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌ATCC15168。

在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌YPILE001,已于2020年08月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏机构简称：CGMCC，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

本发明的第二个方面，提供一种多核苷酸序列，由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括所述多核苷酸序列的重组载体，含有所述多核苷酸序列的重组菌株。

根据本发明，所述多核苷酸序列包括编码含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述序列的第331位脯氨酸被不同的氨基酸所取代。

根据本发明，优选第331位脯氨酸变为丝氨酸所取代。。

根据本发明，优选所述编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。

在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第991位碱基发生突变而形成的。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。在本发明中，优选采用PCR定点突变法和/或同源重组。

根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第991位胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。

在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

根据本发明，所述氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

根据本发明，所述重组载体是将所述多核苷酸序列导入质粒构建而成。

在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pK18mobsacB质粒。

在本发明的另一个实施方式中，所述质粒为pXMJ19质粒。

具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过NEBuider重组***构建成重组载体。

根据本发明，所述重组菌株含有所述的多核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为ATCC 15168。

本发明的第三个方面，提供上述多核苷酸序列、由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列、包括所述多核苷酸序列的重组载体、含有所述多核苷酸序列的重组菌株在生产L-异亮氨酸中的应用。

本发明的第四个方面，还提供一种生成L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。

根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：

改造宿主菌株中如SEQ ID NO:1所示的野生型YH66_10715基因的多核苷酸序列，使其第991位碱基发生突变，得到包含突变YH66_10715编码基因的重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第991位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)；具体地，所述包含突变YH66_10715编码基因的多核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型YH66_10715基因的核苷酸序列，使其第991位碱基发生突变，得到突变的YH66_10715基因多核苷酸序列；

(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；

(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变YH66_10715编码基因的重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的YH66_10715基因构建：根据未修饰菌株的基因组序列，合成两对扩增YH66_10715基因片段的引物P1和P2及P3和P4，通过PCR定点突变法在野生型YH66_10715基因SEQ ID NO:1中引入点突变，得到点突变的YH66_10715基因核苷酸序列SEQ ID NO:2，记为YH66_10715^C991T。

在本发明的一个实施方式中，所述未修饰菌株基因组可以来源于ATCC15168菌株，其基因组序列GenBank：CP011309.1可以从NCBI网站获取。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：

P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGTTCTTCGTTCACGATCC 3'(SEQID NO:5)

P2:5'GTTGATTGGAGCCTCGAAGCCTGAAACCAGACGGTGGTAG 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'CTACCACCGTCTGGTTTCAGGCTTCGAGGCTCCAATCAAC 3'(SEQ ID NO:7)

P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGGAACGCCAGTTGGAAG3'(SEQID NO:8)

在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，包括：将分离纯化后的YH66_10715^C991T和pK18mobsacB质粒，通过NEBuider重组***组装，获得重组质粒。

根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒转化至宿主菌株，得到重组菌株。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 15168。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株为谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

在本发明的一个实施方式中，所述重组是通过同源重组实现的。

本发明的第五个方面，还提供一种生成L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。

根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：

扩增YH66_10715的上下游同源臂片段、YH66_10715基因编码区及其启动子区序列，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入YH66_10715或YH66_10715^C991T基因，以实现所述菌株过表达YH66_10715或YH66_10715^C991T基因。

在本发明的一个实施方式中，扩增上游同源臂片段的引物是：

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGTTTGCTTCCAAAGGCGTG3'

P8:5'CGGGGTTTCAAACGCCACTCATTTCAGCGTCAGATG3'

在本发明的一个实施方式中，扩增下游同源臂片段的引物是：

P11:5'GAATTGTACTTCGACTGCTAATGCCGAAATAAGGCCGG3'

P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGCCTTCTAAAACTGCCG 3'

在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：

P9:5'CATCTG ACGCTGAAATGAGTGGCGTTTGAAACCCCG 3'(SEQ ID NO:13)

P10:5'CCGGCCTTAT TTCGGCATTAGCAGTCGAAGTACAATTC 3'(SEQ ID NO:14)

在本发明的一个实施方式中，再以前述P7/P12为引物，以扩增的上游同源臂片段、下游同源臂片段、基因编码区及其启动子区序列片段的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。

在本发明的一个实施方式中，所采用的PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10μM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组***，将穿梭质粒PK18mobsacB和整合同源臂片段组装，获得整合质粒。

在本发明的一个实施方式中，将整合质粒转染宿主菌株，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入YH66_10715或YH66_10715^C991T基因。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No.20437。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 15168。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。

本发明的第六个方面，还提供一种生产L-异亮氨酸的重组菌株的构建方法。

根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：

扩增YH66_10715基因编码区及启动子区序列，或YH66_10715^C991T基因编码区及启动子区序列，构建过表达质粒载体，将所述载体转入宿主菌株中，以实现所述菌株过表达YH66_10715或YH66_10715^C991T基因。

P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGTGGCGTTTGAAACCCCG 3'(SEQID NO:21)

P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACGAATTGTACTTCGACTGCTAA 3'(SEQID NO:22)。

在本发明的一个实施方式中，所述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10μM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组***，将穿梭质粒pXMJ19和带有自身启动子的YH66_10715或YH66_10715^C991T片段组装，获得过表达质粒。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 15168。

本发明获得重组菌株可以单独应用于发酵生产L-异亮氨酸中，也可以和其他产L-异亮氨酸的细菌混合发酵生产L-异亮氨酸。

本发明的另一个方面提供了生产L-异亮氨酸的方法，该方法包括培养所述细菌；并且从培养物中获得L-异亮氨酸。

可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行细菌的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的L-异亮氨酸，即用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。

本发明的有益效果

本发明通过对YH66_10715基因的敲除，发现该基因编码的产物对L-异亮氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L-异亮氨酸。

生物保藏说明

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏机构简称：CGMCC，保藏日期为2020年08月17日，生物保藏编号为CGMCC No.20437，菌株命名：YPILE001。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

以下实施例中培养所述菌株使用的基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加相应需要的蔗糖、卡那霉素或氯霉素等，基础培养基组成如下：

表1固体培养基的组成

成分	配方
		葡萄糖	5g/L
多聚蛋白胨	10g/L
		牛肉膏	10g/L
酵母粉	5g/L
		氯化钠	55g/L
琼脂粉	20g/L
		pH(NaOH调节)	7.0
培养条件	31℃

实施例1构建包含点突变的YH66_10715基因编码区的转化载体pK18-YH66_10715^C991T

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，设计并合成两对扩增YH66_10715基因(GenBank：AKF27993.1)编码区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株ATCC15168和高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中引入点突变，对应编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，YH66_10715基因的核苷酸序列第991位胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)(SEQ ID NO：2：YH66_10715^C991T)，对应编码蛋白的氨基酸序列第331位脯氨酸(P)变为丝氨酸(S)(SEQ ID NO：4：YH66_10715^P331S)。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGTTCTTCGTTCACGATCC 3'(SEQID NO:5)

P2:5'GTTGATTGGAGCCTCGAAGCCTGAAACCAGACGGTGGTAG 3'(SEQ ID NO:6)

P3:5'CTACCACCGTCTGGTTTCAGGCTTCGAGGCTCCAATCAAC 3'(SEQ ID NO:7)

P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGGAACGCCAGTTGGAAG3'(SEQID NO:8)

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增。

PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min，获得两条大小分别约771bp和756bp，含有YH66_10715基因编码区的DNA片段(YH66_10715^C991T-Up和YH66_10715^C991T-Down)。

将YH66_10715^C991T-Up和YH66_10715^C991T-Down经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后；再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增出长约1628bp的YH66_10715^C991T-Up-Down片段。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

此DNA片段导致ATCC15168的诱变菌株谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中YH66_10715基因编码区的第991位的胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)，最终导致编码蛋白的第331位氨基酸由脯氨酸(P)变为丝氨酸(S)。

将pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用XbaI酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化YH66_10715^C991T-Up-Down和线性化的pK18mobsacB质粒，再通过NEBuider重组***组装，获得载体pK18-YH66_10715^C991T，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pK18-YH66_10715^C991T送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变(C-T)的载体pK18-YH66_10715^C991T保存备用。

实施例2构建包含点突变的YH66_10715^C991T的工程菌株

构建方法：将等位替换质粒pK18-YH66_10715^C991T通过电击转化入高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中；对培养产生的单菌落分别通过引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出大小约1527bp条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养；对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P5:5'AAGGACGGC AAGCCACTC 3'(SEQ ID NO:9)

P6:5'AGTTCGTAGA GGTCCTTG3'(SEQ ID NO:10)

上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒pK18-YH66_10715^C991T扩增片段为阳性对照，ATCC15168扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物P5和P6再次通过PCR扩增等位替换成功的菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体测序，通过比对碱基序列确定是否替换成功；并将来自高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)替换成功的突变株命名为YPI019。

表2 sscp电泳的PAGE的制备

实施例3构建基因组上过表达YH66_10715或YH66_10715^C991T基因的工程菌株

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及YH66_10715基因编码区及启动子区序列的引物，以同源重组的方式在菌株谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中引入YH66_10715或YH66_10715^C991T基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGTTTGCTTCCAAAGGCGTG3'

P8:5'CGGGGTTTCAAACGCCACTCATTTCAGCGTCAGATG 3'

P9:5'CATCTGACGCTGAAATGAGTGGCGTTTGAAACCCCG 3'

P10:5'CCGGCCTTATTTCGGCATTAGCAGTCGAAGTACAATTC 3'

P11:5'GAATTGTACTTCGACTGCTAATGCCGAAATAAGGCCGG 3'

P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGCCTTCTAAAACTGCCG 3'

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC15168或YPI019为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段约735bp，YH66_10715或YH66_10715^C991T基因片段约1470bp及下游同源臂片段约914bp，再以P7/P12为引物，用以上扩增的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的约3119bp的DNA片段，采用NEBuider重组***与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB相连接，获得整合质粒pk18mobsacB-YH66_10715或pk18mobsacB-YH66_10715^C991T，质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将2个整合质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCCNo.20437)中，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约1056bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。阳性菌株经15％蔗糖筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小约845bp的菌为YH66_10715或YH66_10715^C991T基因整合到菌株谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)基因组上的菌株，其被命名为YPI-020(不含突变点)和YPI-021(含突变点)。

P13:5'TGATGGATGG GCTCACTC 3'

P14:5'CGAACTCGAC GTTTTCATC 3'

P15:5'CAGTACAAGTACGACAACG 3'

P16:5'CGAATTTGTA TAGCCTAG 3'

实施例4构建质粒上过表达YH66_10715或YH66_10715^C991T基因的工程菌株

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，设计并合成一对扩增YH66_10715基因编码区及启动子区序列的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGTGGCGTTTGAAACCCCG 3'

P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACGAATTGTACTTCGACTGCTAA 3'

构建方法：以ATCC15168或YPI019为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得YH66_10715或YH66_10715^C991T基因片段约1510bp，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1510bp的DNA片段，采用NEBuider重组***与经EcoR I酶切、回收的穿梭质粒pXMJ19相连接，获得过表达质粒pXMJ19-YH66_10715或pXMJ19-YH66_10715^C991T。质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素筛选获得质粒转化到菌株中。

所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中，对培养产生的单菌落通过M13R(-48)和P18引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约920bp的片段的为转入菌株，其被命名为YPI-022(不含点突变)和YPI-023(含点突变)。

实施例5构建基因组上缺失YH66_10715基因的工程菌株

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC15168基因组(GenBank：CP011309.1)序列，合成两对扩增YH66_10715基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海英俊公司合成)：

P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAAATTTGCAACTCTCGC 3'

P20:5'CGGCTAGCTAAGTGAATTAGCGGTGACTCCTCATTGAC3'

P21:5'GTCAATGAGGAGTCACCGCTAATTCACTTAGCTAGCCG 3'

P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAAAATGCTTTTCGACGTCC 3'

以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，分别以引物P19/P20及P21/P22，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段894bp及下游同源臂片段690bp。再用引物P19/P22进行OVER PCR得到整个同源臂片段1484bp。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1484bp的DNA片段，并通过NEBuider重组***与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。

将敲除质粒电转化入谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中，对培养产生的单菌落分别通过如下引物(上海英俊公司合成)进行PCR鉴定：

P23:5'GCGCTGA CTATGCAGATTC 3'

P24:5'AAACT CGACC TTCACGTC 3'

上述PCR扩增出大小约1484bp及约2940bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2940bp条带的菌株为出发菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1484bp条带的菌株为YH66_10715基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPI-024。

实施例6L-异亮氨酸发酵实验

将实施例2-5构建的菌株和原始谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCCNo.20437)在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示发酵控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表5所示。

表3发酵培养基配方

成分	配方(g/L)
		葡萄糖	90
硫酸铵	12
		硫酸镁	0.87
硫酸二氢钾	2
		酸化玉米浆	3mL/L
酵母粉	4
		消泡剂(2％泡敌)	4mL/L
VB<sub>1</sub>	0.006
		VH	0.003
生物素	0.088

表4发酵控制工艺

表5L-异亮氨酸发酵实验结果

结果如表5所示，在产异亮氨酸的工程菌谷氨酸棒杆菌YPILE001(生物保藏编号为CGMCC No.20437)中，对YH66_10715基因编码区进行点突变YH66_10715^C991T都有助于L-异亮氨酸产量的提高；过表达YH66_10715、YH66_10715^C991T有助提高L-异亮氨酸的产量，而对YH66_10715基因敲除，不利于L-异亮氨酸的积累。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> YH66_10715基因改造的高产L-异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

gtggcgtttg aaaccccgga agaaattgtc aagttcatca aggatgaaaa cgtcgagttc 60

gttgacgttc gattcaccga ccttcccggc accgagcagc acttcagcat cccagctgcc 120

agcttcgatg cagatacagt cgaagaaggt ctcgcattcg acggatcctc gatccgtggc 180

ttcaccacga tcgacgaatc tgacatgaat ctcctgccag acctcggaac ggccaccctt 240

gatccattcc gcaaggcaaa gaccctgaac gttaagttct tcgttcacga tcctttcacc 300

cgcgaggcat tctcccgcga cccacgcaac gtagcacgca aggcagagca gtacctggca 360

tccaccggca ttgcagacac ctgcaacttc ggcgccgagg ctgagttcta cctcttcgac 420

tccgttcgct actccaccga gatgaactcc ggcttctacg aagtagatac cgaagaaggc 480

tggtggaacc gtggcaagga aaccaacctc gacggaaccc caaacctggg cgcaaagaac 540

cgcgtcaagg gtggctactt cccagtagca ccatacgacc aaaccgttga cgtgcgcgat 600

gacatggttc gcaacctcgc agcttccggc ttcgctcttg agcgtttcca ccacgaagtc 660

ggtggcggac agcaggaaat caactaccgc ttcaacacca tgctccacgc ggcagatgat 720

atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgctcgcc tccacggcaa ggctgcaacc 780

ttcatgccta agccactggc tggcgacaac ggttccggca tgcacgctca ccagtccctc 840

tggaaggacg gcaagccact cttccacgat gagtccggct acgcaggcct gtccgacatc 900

gcccgctact acatcggcgg catcctgcac cacgcaggcg ctgttctggc gttcaccaac 960

gcaaccctga actcctacca ccgtctggtt ccaggcttcg aggctccaat caacctggtg 1020

tactcacagc gcaaccgttc cgctgctgtc cgtatcccaa tcaccggatc caacccaaag 1080

gcaaagcgca tcgaattccg cgctccagac ccatcaggca acccatacct gggcttcgca 1140

gcgatgatga tggccggcct cgacggcatc aagaaccgca tcgagccaca cgctccagtg 1200

gacaaggacc tctacgaact gccaccagag gaagctgcat ccattccaca ggcaccaacc 1260

tccctggaag catccctgaa ggcactgcag gaagacaccg acttcctcac cgagtctgac 1320

gtcttcaccg aggatctcat cgaggcgtac atccagtaca agtacgacaa cgagatctcc 1380

ccagttcgcc tgcgcccaac cccgcaggaa ttcgaattgt acttcgactg ctaa 1434

<210> 2

<211> 1434

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 2

gtggcgtttg aaaccccgga agaaattgtc aagttcatca aggatgaaaa cgtcgagttc 60

gttgacgttc gattcaccga ccttcccggc accgagcagc acttcagcat cccagctgcc 120

agcttcgatg cagatacagt cgaagaaggt ctcgcattcg acggatcctc gatccgtggc 180

ttcaccacga tcgacgaatc tgacatgaat ctcctgccag acctcggaac ggccaccctt 240

gatccattcc gcaaggcaaa gaccctgaac gttaagttct tcgttcacga tcctttcacc 300

cgcgaggcat tctcccgcga cccacgcaac gtagcacgca aggcagagca gtacctggca 360

tccaccggca ttgcagacac ctgcaacttc ggcgccgagg ctgagttcta cctcttcgac 420

tccgttcgct actccaccga gatgaactcc ggcttctacg aagtagatac cgaagaaggc 480

tggtggaacc gtggcaagga aaccaacctc gacggaaccc caaacctggg cgcaaagaac 540

cgcgtcaagg gtggctactt cccagtagca ccatacgacc aaaccgttga cgtgcgcgat 600

gacatggttc gcaacctcgc agcttccggc ttcgctcttg agcgtttcca ccacgaagtc 660

ggtggcggac agcaggaaat caactaccgc ttcaacacca tgctccacgc ggcagatgat 720

atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgctcgcc tccacggcaa ggctgcaacc 780

ttcatgccta agccactggc tggcgacaac ggttccggca tgcacgctca ccagtccctc 840

tggaaggacg gcaagccact cttccacgat gagtccggct acgcaggcct gtccgacatc 900

gcccgctact acatcggcgg catcctgcac cacgcaggcg ctgttctggc gttcaccaac 960

gcaaccctga actcctacca ccgtctggtt tcaggcttcg aggctccaat caacctggtg 1020

tactcacagc gcaaccgttc cgctgctgtc cgtatcccaa tcaccggatc caacccaaag 1080

gcaaagcgca tcgaattccg cgctccagac ccatcaggca acccatacct gggcttcgca 1140

gcgatgatga tggccggcct cgacggcatc aagaaccgca tcgagccaca cgctccagtg 1200

gacaaggacc tctacgaact gccaccagag gaagctgcat ccattccaca ggcaccaacc 1260

tccctggaag catccctgaa ggcactgcag gaagacaccg acttcctcac cgagtctgac 1320

gtcttcaccg aggatctcat cgaggcgtac atccagtaca agtacgacaa cgagatctcc 1380

ccagttcgcc tgcgcccaac cccgcaggaa ttcgaattgt acttcgactg ctaa 1434

<210> 3

<211> 477

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 3

Met Ala Phe Glu Thr Pro Glu Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Asp Glu

1 5 10 15

Asn Val Glu Phe Val Asp Val Arg Phe Thr Asp Leu Pro Gly Thr Glu

20 25 30

Gln His Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Val Glu

35 40 45

Glu Gly Leu Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Arg Gly Phe Thr Thr Ile

50 55 60

Asp Glu Ser Asp Met Asn Leu Leu Pro Asp Leu Gly Thr Ala Thr Leu

65 70 75 80

Asp Pro Phe Arg Lys Ala Lys Thr Leu Asn Val Lys Phe Phe Val His

85 90 95

Asp Pro Phe Thr Arg Glu Ala Phe Ser Arg Asp Pro Arg Asn Val Ala

100 105 110

Arg Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Ala Ser Thr Gly Ile Ala Asp Thr Cys

115 120 125

Asn Phe Gly Ala Glu Ala Glu Phe Tyr Leu Phe Asp Ser Val Arg Tyr

130 135 140

Ser Thr Glu Met Asn Ser Gly Phe Tyr Glu Val Asp Thr Glu Glu Gly

145 150 155 160

Trp Trp Asn Arg Gly Lys Glu Thr Asn Leu Asp Gly Thr Pro Asn Leu

165 170 175

Gly Ala Lys Asn Arg Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Tyr

180 185 190

Asp Gln Thr Val Asp Val Arg Asp Asp Met Val Arg Asn Leu Ala Ala

195 200 205

Ser Gly Phe Ala Leu Glu Arg Phe His His Glu Val Gly Gly Gly Gln

210 215 220

Gln Glu Ile Asn Tyr Arg Phe Asn Thr Met Leu His Ala Ala Asp Asp

225 230 235 240

Ile Gln Thr Phe Lys Tyr Ile Ile Lys Asn Thr Ala Arg Leu His Gly

245 250 255

Lys Ala Ala Thr Phe Met Pro Lys Pro Leu Ala Gly Asp Asn Gly Ser

260 265 270

Gly Met His Ala His Gln Ser Leu Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Phe

275 280 285

His Asp Glu Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Ala Arg Tyr Tyr

290 295 300

Ile Gly Gly Ile Leu His His Ala Gly Ala Val Leu Ala Phe Thr Asn

305 310 315 320

Ala Thr Leu Asn Ser Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Phe Glu Ala Pro

325 330 335

Ile Asn Leu Val Tyr Ser Gln Arg Asn Arg Ser Ala Ala Val Arg Ile

340 345 350

Pro Ile Thr Gly Ser Asn Pro Lys Ala Lys Arg Ile Glu Phe Arg Ala

355 360 365

Pro Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Ala Ala Met Met Met

370 375 380

Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys Asn Arg Ile Glu Pro His Ala Pro Val

385 390 395 400

Asp Lys Asp Leu Tyr Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ala Ala Ser Ile Pro

405 410 415

Gln Ala Pro Thr Ser Leu Glu Ala Ser Leu Lys Ala Leu Gln Glu Asp

420 425 430

Thr Asp Phe Leu Thr Glu Ser Asp Val Phe Thr Glu Asp Leu Ile Glu

435 440 445

Ala Tyr Ile Gln Tyr Lys Tyr Asp Asn Glu Ile Ser Pro Val Arg Leu

450 455 460

Arg Pro Thr Pro Gln Glu Phe Glu Leu Tyr Phe Asp Cys

465 470 475

<210> 4

<211> 477

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 4

Met Ala Phe Glu Thr Pro Glu Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Asp Glu

1 5 10 15

Asn Val Glu Phe Val Asp Val Arg Phe Thr Asp Leu Pro Gly Thr Glu

20 25 30

Gln His Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Val Glu

35 40 45

Glu Gly Leu Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Arg Gly Phe Thr Thr Ile

50 55 60

Asp Glu Ser Asp Met Asn Leu Leu Pro Asp Leu Gly Thr Ala Thr Leu

65 70 75 80

Asp Pro Phe Arg Lys Ala Lys Thr Leu Asn Val Lys Phe Phe Val His

85 90 95

Asp Pro Phe Thr Arg Glu Ala Phe Ser Arg Asp Pro Arg Asn Val Ala

100 105 110

Arg Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Ala Ser Thr Gly Ile Ala Asp Thr Cys

115 120 125

Asn Phe Gly Ala Glu Ala Glu Phe Tyr Leu Phe Asp Ser Val Arg Tyr

130 135 140

Ser Thr Glu Met Asn Ser Gly Phe Tyr Glu Val Asp Thr Glu Glu Gly

145 150 155 160

Trp Trp Asn Arg Gly Lys Glu Thr Asn Leu Asp Gly Thr Pro Asn Leu

165 170 175

Gly Ala Lys Asn Arg Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Tyr

180 185 190

Asp Gln Thr Val Asp Val Arg Asp Asp Met Val Arg Asn Leu Ala Ala

195 200 205

Ser Gly Phe Ala Leu Glu Arg Phe His His Glu Val Gly Gly Gly Gln

210 215 220

Gln Glu Ile Asn Tyr Arg Phe Asn Thr Met Leu His Ala Ala Asp Asp

225 230 235 240

Ile Gln Thr Phe Lys Tyr Ile Ile Lys Asn Thr Ala Arg Leu His Gly

245 250 255

Lys Ala Ala Thr Phe Met Pro Lys Pro Leu Ala Gly Asp Asn Gly Ser

260 265 270

Gly Met His Ala His Gln Ser Leu Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Phe

275 280 285

His Asp Glu Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Ala Arg Tyr Tyr

290 295 300

Ile Gly Gly Ile Leu His His Ala Gly Ala Val Leu Ala Phe Thr Asn

305 310 315 320

Ala Thr Leu Asn Ser Tyr His Arg Leu Val Ser Gly Phe Glu Ala Pro

325 330 335

Ile Asn Leu Val Tyr Ser Gln Arg Asn Arg Ser Ala Ala Val Arg Ile

340 345 350

Pro Ile Thr Gly Ser Asn Pro Lys Ala Lys Arg Ile Glu Phe Arg Ala

355 360 365

Pro Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Ala Ala Met Met Met

370 375 380

Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys Asn Arg Ile Glu Pro His Ala Pro Val

385 390 395 400

Asp Lys Asp Leu Tyr Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ala Ala Ser Ile Pro

405 410 415

Gln Ala Pro Thr Ser Leu Glu Ala Ser Leu Lys Ala Leu Gln Glu Asp

420 425 430

Thr Asp Phe Leu Thr Glu Ser Asp Val Phe Thr Glu Asp Leu Ile Glu

435 440 445

Ala Tyr Ile Gln Tyr Lys Tyr Asp Asn Glu Ile Ser Pro Val Arg Leu

450 455 460

Arg Pro Thr Pro Gln Glu Phe Glu Leu Tyr Phe Asp Cys

465 470 475

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaagt tcttcgttca cgatcc 56

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttgattgga gcctcgaagc ctgaaaccag acggtggtag 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctaccaccgt ctggtttcag gcttcgaggc tccaatcaac 40

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccctg gaacgccagt tggaag 56

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggacggca agccactc 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agttcgtaga ggtccttg 18

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggttt gcttccaaag gcgtg 55

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggggtttca aacgccactc atttcagcgt cagatg 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catctgacgc tgaaatgagt ggcgtttgaa accccg 36

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccggccttat ttcggcatta gcagtcgaag tacaattc 38

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaattgtact tcgactgcta atgccgaaat aaggccgg 38

<210> 16

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccctg ccttctaaaa ctgccg 56

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgatggatgg gctcactc 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgaactcgac gttttcatc 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagtacaagt acgacaacg 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgaatttgta tagcctag 18

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgtgg cgtttgaaac cccg 54

<210> 22

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacgaattg tacttcgact gctaa 55

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaaaa tttgcaactc tcgc 54

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cggctagcta agtgaattag cggtgactcc tcattgac 38

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtcaatgagg agtcaccgct aattcactta gctagccg 38

<210> 26

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccaa aatgcttttc gacgtcc 57

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcgctgacta tgcagattc 19

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaactcgacc ttcacgtc 18

Claims

1.一种L-异亮氨酸生产能力提高的细菌，其特征在于，所述细菌为以下（a）或（b）：

（a）在其基因组上编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸是过表达的；

（b）编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸经过点突变使得SEQ ID NO:3的

氨基酸序列的第331位脯氨酸被丝氨酸所取代且进行了过表达；

所述细菌的出发菌是具有L-异亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌。

2.根据权利要求1所述的细菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No. 20437，或谷氨酸棒杆菌ATCC 15168。

3.如权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，所述经过点突变的多核苷酸序列是由SEQID NO:1所示多核苷酸序列第991位碱基发生突变而形成的。

5.如权利要求4所述的细菌，其特征在于，所述点突变的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

6.一种提高细菌L-异亮氨酸产量的方法，所述方法包括：培养权利要求1-5任一项所述的细菌，并从所述培养物中回收L-异亮氨酸。

7.一种多核苷酸在提高细菌L-异亮氨酸产量中的应用，其特征在于，在细菌中将所述多核苷酸过表达，所述细菌的出发菌是具有L-异亮氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌，所述多核苷酸为编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第991位碱基发生突变而形成的。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

10.如权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌YPILE001，生物保藏编号为CGMCC No. 20437，或谷氨酸棒杆菌ATCC 15168。