CN112661958B - 一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。本发明聚酯酰胺使用精氨酸，苯丙氨酸和肌醇作为合成原材料，采用溶液聚合的方法合成。肌醇的引入不仅能降低载体的细胞毒性，而且6个羟基也能够用来构建更多分子结构的聚酯酰胺。精氨酸，苯丙氨酸和肌醇的协同作用使支化聚酯酰胺的亲疏水性和溶解性能够被很好的控制。本发明聚酯酰胺作为药物递送载体，通过纳米沉淀法可自组装成稳定且粒径均一的纳米体系。该纳米体系安全无毒，生物相容性很好，降解产物为氨基酸，具有优异的生物相容性，可用于装载抗肿瘤药物、疏水性抗氧化剂和水溶性蛋白类药物，在生物医学领域有很大的应用潜力。

Description

一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别涉及一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺及其制备方法与应用。

背景技术

1960年以来，生物可降解的合成聚合物在生物医用领域已经成为一类非常重要的材料。这些材料包括聚α-羟基酸，聚α-氨基酸。聚羟基酸是一类具有很好生物降解性能和生物相容性的高分子材料，已经被用到了生物医学领域的多个方面。脂肪族聚酯是目前为止最重要的商业化聚α-羟基酸材料。其中在生物医学应用最多的就是聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及其共聚物(PLGA)。可吸收的手术缝合线是其杰出代表，在植入体内后能够被内源性的酯酶降解。但是，常用的脂肪族聚酯可能在体内引发较严重的炎症反应，其主链中缺乏反应位点也使得其改性面临巨大的困难。另外其力学性能也很难满足不同的生物医学应用方向。因此，近年来科学家们投入了大量精力研发具有生物医学应用前景的新材料。

聚酯酰胺，是一种集成了聚酯结构和聚酰胺结构于同一分子链中的聚合物。这种特殊的分子结构为研究者自由调控材料的物理化学性能提供了可能性。聚酯酰胺的降解产物为α-氨基酸，对生物体无毒。而在聚酯酰胺的分子链中，酯键的存在使得分子链具有良好的生物可降解性能。酰胺键的引入使得分子链间容易形成氢键，大大提高了材料的理化性能。通过调整聚酯酰胺分子链中各种结构的配比可以实现聚合物生物降解性能，物理化学性能，机械性能，热性能和生物学性能的调控。用于合成聚酯酰胺的单体来源也非常丰富，主要有氨基酸，氨基醇，碳水化合物等。通过调整单体的种类和配比，可以获得不同分子结构结构，不同酯键/酰胺键配比，不同脂肪结构族/芳环结构配比的聚酯酰胺。通过引入聚环氧乙烷结构可以增加聚酯酰胺的亲水性。改变亚甲基序列的长度可以调整材料的疏水性。另外，聚酯酰胺的官能度，结晶性能，分子链的刚性和弹性都能根据需要通过调整分子结构获得。

然而目前基于α-氨基酸的聚酯酰胺均为线性结构，虽然可以通过单体配方的调整来优化材料性能，但在力学性能上仍然存在一定的不足。分子结构相对比较固定，对后期功能性基团的引入也带来了很大的挑战。

发明内容

为了弥补化学结构对聚酯酰胺材料在生物应用上的限制，可以通过引入多官能度单体，例如多元胺，多元醇和多元酸，来构建支化型的聚酯酰胺。支化型的聚酯酰胺能够减少分子间氢键的形成，减少分子链的缠结，提高材料在溶剂中的溶解性，有利于从纳米级，微米级到宏观水凝胶等材料的构建。另外，由于多官能度单体的引入使结构中含有大量的氨基，羧基或者巯基等活性基团，为材料化学结构的设计提供了更多的可能性。我们可以通过向聚酯酰胺分子中引入更多的功能化结构，以实现材料在实际应用中的多功能性或者对机体微环境的响应性。因此，我们希望通过向聚酯酰胺结构中引入具有多官能度的生物活性的天然小分子来合成支化型的聚酯酰胺，并探索了这种支化型聚酯酰胺在药物载体等生物医学领域的应用潜力。通过用这一支化型聚酯酰胺构建抗癌药物纳米载体用于化疗，构建疏水性小分子抗氧化剂纳米载体用于组织工程微环境的调节和体内外蛋白类药物的递送来研究支化型聚酯酰胺在生物医学领域的应用潜力。

本发明的首要目的在于提供一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺(BPEA)的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的聚酯酰胺。

本发明的再一目的在于提供上述聚酯酰胺的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺的制备方法，使用精氨酸，苯丙氨酸和肌醇作为合成原材料，采用溶液聚合的方法合成支化型聚酯酰胺。在合成过程中可通过改变含精氨酸成分的单体和含苯丙氨酸成分的单体的配方来调节材料的亲疏水性能；优选的操作如下：

S1、将精氨酸，二元醇和对甲苯磺酸一水合物分散到溶剂中，进行酯化反应，初产物纯化，得到单体A；

S2、将苯丙氨酸，肌醇和对甲苯磺酸一水合物分散到溶剂中，反应，初产物纯化，得到单体B；

S3、冰浴状态下，将二元酰氯，三乙胺溶解在溶剂中，然后将溶解在预冷的溶剂中的对硝基苯酚逐滴加入到体系中，反应；换到常温状态下，继续反应；初产物纯化，得到单体C；

S4、将单体A，单体B和单体C加热溶解在溶剂中，加入三乙胺，搅拌均匀，进行缩聚反应；初产物纯化，即获得所述的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺。

步骤S1中所述的二元醇可选自1,4-丁二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇或1,10-癸二醇等脂肪二元醇中的一种或几种。

步骤S1中所述的精氨酸，二元醇和对甲苯磺酸一水合物的配比优选为摩尔比1～4:1～2:4～10；更优选为摩尔比2:1:4.1。

步骤S1中所述的溶剂优选为甲苯。

步骤S1中所述的酯化反应的条件优选为温度120～140℃、时间20～30h，反应过程中通过分水器去除产生的水分；更优选为温度130℃、时间24h。

步骤S1中所述的初产物纯化的具体操作为：酯化反应完成后，待反应体系降至室温，去除体系中的溶剂，再在产物中加入异丙醇，升温搅拌至其溶解，再降温沉降，反复纯化3～5次，干燥，即可。如暂时不用，于干燥48h后密封保存备用。

步骤S2中所述的苯丙氨酸，肌醇和对甲苯磺酸一水合物的配比优选为摩尔比5～14:1～2:7～30；更优选为摩尔比6:1:12。

步骤S2中所述的溶剂优选为甲苯。

步骤S2中所述的酯化反应的条件优选为温度120～140℃、时间20～30h，反应过程中通过分水器去除产生的水分；更优选为温度130℃、时间24h。

步骤S2中所述的初产物纯化的具体操作为：反应完成后，待反应体系降至室温，去除体系中的溶剂，再将产物萃取，洗涤，干燥，即可。如暂时不用，于干燥48h后密封保存备用。

步骤S3中所述的二元酰氯可选自乙二酰氯、丁二酰氯或辛二酰氯等脂肪二元酰氯中的一种或几种。

步骤S3中所述的二元酰氯，三乙胺，硝基苯酚的配比优选为摩尔比15～25:40～50:38～45；更优选为摩尔比20:45:42。

步骤S3中所述的溶剂均优选为丙酮。

步骤S3中所述的滴加对硝基苯酚后反应的时间优选为1～2h，换到常温状态后的继续反应的时间优选为20～30h。

步骤S3中所述的初产物纯化的具体操作为：反应完成后，初产物通过在水中反复沉降3～5次，干燥，在丙酮和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶剂中重结晶3～5次，再干燥，即可。

步骤S4中所述的单体A，单体B，单体C，三乙胺的配比优选为0.5～1g:0.1～2g:0.1～0.5g:0.1～0.3mL；更优选为0.774g:1.776g:0.338g:0.3mL。

步骤S4中所述的加热的温度优选为70～80℃；更优选为75℃。

步骤S4中所述的溶剂优选为二甲基亚砜(DMSO)。

步骤S4中所述的缩聚反应的条件优选为温度70～80℃、时间45～55h；更优选为温度75℃、时间48h。

步骤S4中所述的初产物纯化的具体操作为：将初产物溶解在甲醇中，然后用预冷的乙酸乙酯将产物沉淀出来，反复溶解沉淀3～5次，干燥，即可。如暂时不用，于干燥24h后密封保存备用。

一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺，通过上述制备方法制备得到。

所述的聚酯酰胺的分子量范围为1000～50000Da；优选为2000～10000；更优选为4000～5000。

优选的，所述的聚酯酰胺的化学结构如式(Ⅰ)所示：

式中，n、x、y均表示聚合度，其中，n的取值范围为1～20，x与y的取值范围均为1～12。

上述基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺在制备药物纳米递送载体或纳米载药体系中的应用。

所述的药物包括但不限于抗肿瘤药物，如紫杉醇、多西紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱、阿霉素、姜黄素等药物；疏水性抗氧化剂，如维生素类抗氧化剂，类胡萝卜素抗氧化剂，黄酮类化合物，酶类抗氧化剂，蛋白类抗氧化剂等；水溶性蛋白类药物，如胰岛素、血清白蛋白、干扰素、组织纤溶酶原激活物、***、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素、免疫抑制剂、抗体或抗原多肽等药物。

所述的药物纳米递送载体或纳米载药体系均可通过纳米沉淀法制备。

当所述的应用为在制备药物纳米递送载体中的应用时，所述的应用的具体操作为：将所述的聚酯酰胺与稳定剂均溶解于有机溶剂中，在搅拌状态下将得到的混合溶液逐滴滴加至水中自组装成纳米粒，即可；

所述的聚酯酰胺、稳定剂、有机溶剂的配比优选为5g:0.1～10g:50～1000mL。

所述的稳定剂优选为DSPE-PEG 2000。

所述的有机溶剂优选为二甲基亚砜。

当所述的药物为抗肿瘤药物或疏水性抗氧化剂时，具体操作为：将所述的聚酯酰胺、稳定剂与药物溶解于有机溶剂中，在搅拌状态下将得到的混合溶液逐滴滴加至水中自组装成纳米粒，即可；其中，聚酯酰胺和药物的的质量比为5：0.1～10。

当所述的药物为水溶性蛋白类药物时，具体操作为：将所述的聚酯酰胺溶于有机溶剂中，配成浓度为0.05～40mg/mL的溶液M，将稳定剂溶解于有机溶剂中，配成浓度为0.05～40mg/mL的溶液N，将溶液M和溶液N按1:1～2的体积比混合均匀，得到溶液L；将所述的药物溶于合适的溶剂***中，配成浓度为150～250μg/mL的药物溶液；再在1500～2500rpm转速下将所述的溶液L逐滴滴加至药物溶液中自组装成纳米粒，即可。

一种纳米载药体系，通过上述具体操作方法制备得到。

1)本发明提供一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺材料，具有优异的生物安全性和生物可降解性，安全无毒。分子结构中引入具有生物活性的生长因子肌醇来构建支化型的聚酯酰胺，为聚酯酰胺结构的设计提供了更多的可能性。将这种天然的环状多元醇引入在聚酯酰胺骨架重来构建支化聚酯酰胺。将肌醇引入到聚酯酰胺结构中不仅能够很大程度降低载体对内脏器官的细胞毒性，而且肌醇结构中的6个羟基也能够用来构建更多分子结构的聚酯酰胺。另外，这种具有活性的肌醇或者能够带来附加的治疗效果。阳离子的精氨酸和疏水性的氨基酸(苯丙氨酸等)分别被用来构建聚酯酰胺分子结构中的正电荷亲水链段和疏水链段用以调节分子的结构和性能。精氨酸，苯丙氨酸和肌醇的协同作用使支化聚酯酰胺的亲疏水性和溶解性能够被很好的控制。

2)本发明提供一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺的纳米载药体系和制备方法。

3)本发明提提供基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺纳米载体在作为或制备抗肿瘤药物纳米载体中的应用。利用合成的聚酯酰胺构建天然抗癌药物如紫杉醇的纳米载体。并通过细胞实验和荷瘤小鼠动物模型来研究装载紫杉醇的纳米载体的抗癌性能和材料本身的生物相容性。***的分析纳米材料对紫杉醇抗癌作用的影响。

4)本发明提供基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺纳米载体作为疏水性抗氧化剂的递送体系。利用合成的聚酯酰胺构建疏水性小分子抗氧化剂如维生素E的纳米载体。解决维生素E的疏水性和环境敏感性给其应用带来的挑战。同时利用纳米载体在含水体系的分散能力和聚酯酰胺对维生素E的保护作用，将装载维生素E的纳米载体引入组织再生支架材料调节微环境。通过纳米载体在细胞内外的抗氧化能力和免疫调节能力的研究深入探讨了装载维生素E的纳米载体对组织工程微环境的调节作用和组织再生的促进作用。

5)本发明提供基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺纳米载体作为蛋白类药物的递送体系。利用合成的聚酯酰胺与带负电荷的蛋白类药物通过静电相互作用形成纳米复合物。通过细胞实验研究了含精氨酸的聚酯酰胺纳米复合物向细胞内递送蛋白类药物的能力。同时通过糖尿病小鼠模型研究了聚酯酰胺与胰岛素的复合物对胰岛素在体内的缓释作用和对胰岛素有效作用时间的影响。通过制剂的优化利用具有生物安全性支化型聚酯酰胺载体来延长胰岛素有效作用时间，降低注射胰岛素给患者带来的痛苦。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1)本发明以肌醇，精氨酸和其他氨基酸等为主要原料，通过溶液聚合合成基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺高分子材料，该方法重复性好，操作简便，所用原料无毒、经济且易得。

2)本发明以基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺作为药物递送载体，通过纳米沉淀法，可在水中与DSPE-PEG2000自组装成稳定且粒径均一的纳米体系。该纳米体系粒径在100nm左右，尺寸适中，可通过高渗透长滞留(EPR)效应达到肿瘤部位。该纳米体系安全无毒，生物相容性很好，降解产物为氨基酸，具有优异的生物相容性。本发明的纳米载药体系，可通过疏水相互作用包裹疏水性的化疗药PTX，该纳米载体能显著延长PTX在血液中的循环时间，使其在肿瘤位置聚集，提高药物的生物利用度。

3)本发明以基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺作为疏水性小分子抗氧化剂维生素E的载体，通过纳米沉淀法，可在水中与DSPE-PEG2000自组装成稳定且粒径均一的纳米体系BPEA@VE NPs。实验结果显示BPEA@VE NPs在细胞外和细胞内都显示出了优异的抗氧化性能。BPEA纳米载体能够在提高维生素E在水体系中的溶解行的同时，增强它的抗氧化性能。BPEA@VE NPs能够应用于伤口敷料以及组织工程，发挥其抗氧化和稳定细胞生长微环境的作用。在BPEA纳米载体的帮助下，还能够保护细胞及组织免受过量抗氧化剂的损伤。另外，这种基于天然氨基酸的BPEA由于含有精氨酸于分子结构中，所以本身也具有一定的抗氧化和抗炎能力。总之，BPEA@VE NPs在生物医学领域有很大的应用潜力。

4)本发明以基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺蛋白形的静电作用和疏水作用构建和BPEA与蛋白的微纳米级复合物。通过调节配方能够实现对粒径从纳米级到微米级的调控。在磷酸盐缓冲液中不发生聚集而稳定存在。一方面，我们利用BPEA与蛋白构建的纳米复合物实现了细胞内蛋白质的有效递送。克服了这类大分子蛋白药物向细胞内递送的困难。同时由于BPEA分子结构中含有大量的活性成分如精氨酸，还能够清除细胞内外产生的ROS，保护细胞免受ROS的氧化损伤。BPEA还能促进细胞的增殖，具有非常好的生物相容性和安全性。另一方面，我们利用BPEA与蛋白质构建了微米级复合物，如BPEA与胰岛素的微米级复合物。BPEA与胰岛素的微米级复合物能够实现胰岛素的长效缓释，降低患者低血糖风险。这一长效缓释作用能够降低胰岛素的注射频率，减少病人的痛苦。另外BPEA优异的抗氧化性能和抗炎能力也能很大程度降低因长期注射胰岛素对皮肤和皮下组织造成的损伤。

附图说明

图1是实施例1、6、7制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA聚合物的核磁图。

图2是实施例2制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA聚合物的核磁图。

图3是实施例1制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA装载紫杉醇前后的TEM图和粒径分布结果图；其中，图a为装载紫杉醇前的TEM图，图b为装载紫杉醇后的TEM图，图c为装载紫杉醇前的粒径分布图，图d为装载紫杉醇后的粒径分布图。

图4是实施例1制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA装载紫杉醇后对肿瘤细胞增殖的抑制作用实验结果图；其中，图a为材料装载紫杉醇形成的纳米颗粒以不同浓度作用于4T1细胞后对细胞对细胞增殖的影响结果图，图b为材料装载紫杉醇形成的纳米颗粒作用于4T1细胞后细胞增殖随着作用时间增加的变化趋势图，图c为材料装载紫杉醇形成的纳米颗粒以不同浓度作用于MDA-MB-231细胞后对细胞对细胞增殖的影响结果图，图d为材料装载紫杉醇形成的纳米颗粒作用于MDA-MB-231细胞后细胞增殖随着作用时间增加的变化趋势结果图，图e为材料装载紫杉醇形成的纳米颗粒以不同浓度作用于MCF-7细胞后对细胞对细胞增殖的影响结果图，图f为材料装载紫杉醇形成的纳米颗粒作用于MCF-7细胞后细胞增殖随着作用时间增加的变化趋势图。

图5是实施例1制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA装载紫杉醇后对小鼠体内实体瘤生长的抑制作用实验结果图。

图6是实施例1制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA装载维生素E后对细胞内ROS的清除作用实验结果图；其中，图a为清除作用机理图，图b为清除作用实验结果图。

图7是实施例1制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA装载维生素E后加入水凝胶中对皮肤伤口愈合的促进作用实验结果图。

图8是细胞对实施例2制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA与罗丹明标记的牛血清白蛋白纳米复合物的摄取图；其中，图Ⅰ为Hela细胞对游离罗丹明标记的牛血清白蛋白的摄取结果图，图Ⅱ为Hela细胞对BPEA材料装载罗丹明标记的牛血清白蛋白纳米颗粒的摄取结果图，图Ⅲ为Hela细胞对BPEA材料装载罗丹明标记的牛血清白蛋白纳米颗粒的摄取结果图(纳米颗粒的浓度增加后)。

图9是实施例2制备的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺BPEA与胰岛素复合物对糖尿病小鼠血糖控制的增强效果实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：基于肌醇的氨基酸基枝化聚酯酰胺(BPEA-3)的合成：

本发明提供了一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺高分子的合成方法，步骤如下：

(1)合成Arg-6单体

Arg-6单体的合成路线如下所述：将精氨酸(0.04mol)，1,6-己二醇(0.02mol)和对甲苯磺酸一水合物(0.082mol)在磁力搅拌下分散在300mL甲苯中。不停搅拌，酯化反应在130℃下进行24小时生成单体Arg-6。同时通过分水器去除产生的水分。酯化反应彻底完成后，反应体系自然降至室温。去除体系中的溶剂甲苯。再将产物中加入异丙醇，升温搅拌至其溶解，再冰箱降温沉降。反复纯化3次得单体Arg-6，真空干燥48h后密封保存备用。将纯化后的单体Arg-6溶解在氘代水中通过1H NMR鉴定其化学结构。

(2)合成Phe-ino单体

Phe-ino单体的合成是通过苯丙氨酸和肌醇之间的酯化反应实现。其合成方法如下：苯丙氨酸(0.12mol)，肌醇(0.02mol)，和对甲苯磺酸一水合物(0.24mol)在磁力搅拌下分散到300mL甲苯中。在130℃和机械搅拌下反应24h。同时通过分水器去除产生的水分。反应彻底完成后，溶液自然降至室温。除去体系中的溶剂甲苯。初产物通过去离子水反复萃取洗涤得纯净的Phe-ino单体，真空干燥48h后密封保存备用。最后将单体Phe-ino溶解在氘代二甲基亚砜中通过1H NMR鉴定其化学结构。

(3)合成N4单体

N4单体的合成是通过己二酰氯和对硝基苯酚通过缩合反应实现。其合成方法如下：丁二酰氯(0.2mol)，三乙胺(0.45mol)溶解在200mL丙酮中，冰浴保持0℃。冰浴下将对硝基苯酚(0.42mol)溶解在预冷的丙酮中再逐滴加入到体系中。在冰浴下反应2h后再继续常温反应24h。初产物通过在水中反复沉降至少3次得单体N4。真空干燥24h后，在丙酮和DMF的混合溶剂中重结晶三次，再真空干燥。将纯化后的单体N4溶解在氘代二甲基亚砜中通过1HNMR鉴定其化学结构。

(4)基于肌醇的氨基酸基枝化聚酯酰胺的合成

基于肌醇的支化型聚酯酰胺(BPEA)是用单体Arg-6，Phe-ino和N4在三乙胺的催化下发生缩聚反应合成得到。具体合成方法如下：将Arg-6(0.774g)，Phe-ino(1.776g)和N4(0.338g)搅拌作用下加热到75℃使其溶解在10mL DMSO中。然后将0.3mL三乙胺作为催化剂加入反应体系中搅拌均匀。缩聚反应在75℃进行48h后，将产物溶解在甲醇中，然后用预冷的乙酸乙酯是产物沉淀出来。反复溶解沉淀三次得纯化的BPEA，再真空干燥24h后密封保存。纯化后的聚合物BPEA通过1H NMR鉴定其化学结构。

结果：聚酯酰胺BPEA通过含二胺的精氨酸单体Arg-6和多元胺的苯丙氨酸单体Phe-ino以及带离去基团的二酸单体N4在三乙胺的催化下通过酰胺化反应缩合聚合成功制得，所得产物命名为BPEA-3。核磁结果如图1所示，GPC测试结果显示其分子量为4386。其化学结构式如下所示：

实施例2：基于肌醇的氨基酸基枝化聚酯酰胺(BPEA-4)的合成：

本发明提供了一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺高分子的合成方法，步骤如下：

(1)合成Arg-8单体

Arg-8单体的合成路线如下所述：将精氨酸(0.04mol)，1,6-辛二醇(0.02mol)和对甲苯磺酸一水合物(0.082mol)在磁力搅拌下分散在300mL甲苯中。不停搅拌，酯化反应在130℃下进行24小时生成单体Arg-8。同时通过分水器去除产生的水分。酯化反应彻底完成后，反应体系自然降至室温。去除体系中的溶剂甲苯。再将产物中加入异丙醇，升温搅拌至其溶解，再冰箱降温沉降。反复纯化3次得单体Arg-8，真空干燥48h后密封保存备用。将纯化后的单体Arg-8溶解在氘代水中通过1H NMR鉴定其化学结构。

(2)合成Phe-ino单体

Phe-ino单体的合成是通过苯丙氨酸和肌醇之间的酯化反应实现。其合成方法如下：苯丙氨酸(0.12mol)，肌醇(0.02mol)，和对甲苯磺酸一水合物(0.24mol)在磁力搅拌下分散到300mL甲苯中。在130℃和机械搅拌下反应24h。同时通过分水器去除产生的水分。反应彻底完成后，溶液自然降至室温。除去体系中的溶剂甲苯。初产物通过去离子水反复萃取洗涤得纯净的Phe-ino单体，真空干燥48h后密封保存备用。最后将单体Phe-ino溶解在氘代二甲基亚砜中通过1H NMR鉴定其化学结构。

(3)合成N8单体

N4单体的合成是通过辛二酰氯和对硝基苯酚通过缩合反应实现。其合成方法如下：辛二酰氯(0.2mol)，三乙胺(0.45mol)溶解在200mL丙酮中，冰浴保持0℃。冰浴下将对硝基苯酚(0.42mol)溶解在预冷的丙酮中再逐滴加入到体系中。在冰浴下反应2h后再继续常温反应24h。初产物通过在水中反复沉降至少3次得单体N8。真空干燥24h后，在丙酮和DMF的混合溶剂中重结晶三次，再真空干燥。将纯化后的单体N8溶解在氘代二甲基亚砜中通过1HNMR鉴定其化学结构。

(4)基于肌醇的氨基酸基枝化聚酯酰胺的合成

基于肌醇的支化型聚酯酰胺(BPEA)是用单体Arg-8，Phe-ino和N8在三乙胺的催化下发生缩聚反应合成得到。具体合成方法如下：将Arg-6(0.917g)，Phe-ino(0.455g)和N4(0.444g)搅拌作用下加热到75℃使其溶解在10mL DMSO中。然后将0.3mL三乙胺作为催化剂加入反应体系中搅拌均匀。缩聚反应在75℃进行48h后，将产物溶解在甲醇中，然后用预冷的乙酸乙酯是产物沉淀出来。反复溶解沉淀三次得纯化的BPEA，再真空干燥24h后密封保存。纯化后的聚合物BPEA通过1H NMR鉴定其化学结构。

结果：聚酯酰胺BPEA通过含二胺的精氨酸单体Arg-8和多元胺的苯丙氨酸单体Phe-ino以及带离去基团的二酸单体N8在三乙胺的催化下通过酰胺化反应缩合聚合成功制得，所得产物命名为BPEA-4。核磁结果如图2所示，其化学结构式如下所示：

实施例:3：负载紫杉醇的聚酯酰胺纳米颗粒的制备方法及其抗肿瘤能力测试：

首先，将5mg实施例1制备的支化型聚酯酰胺BPEA，1mg DSPE-PEG 2000和1mg紫杉醇溶解在0.5mL二甲基亚砜中。在磁力搅拌下(1000rpm)，将上述混合溶液逐滴加入到9mL去离子水中形成BPEA@PTX NPs。DSPE-PEG 2000作为稳定剂使纳米颗粒的形态结构保持稳定。然后通过多次超滤去除介质中的有机溶剂DMSO。制备空载体BPEA NPs的方法与BPEA@PTXNPs一致，体系中不加紫杉醇。制备好的纳米粒储存于4℃冰箱待用。分别通过DLS和TEM表征纳米颗粒的粒径的形态结构。负载紫杉醇的纳米颗粒的稳定性过DLS测定粒径进行评估。最后通过细胞实验和体内抑瘤实验测试BPEA@PTX NPs的抗肿瘤能力。

细胞实验方法：负载紫杉醇的载体BPEA@PTX NPs，空载体PEA NPs和游离紫杉醇对肿瘤细胞的毒性通过MTT法来评估。实验中用到的肿瘤细胞有乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF7和4T1(ATCC)。首先将细胞以1000个每孔的浓度接种在96孔板上。待细胞完全粘附在孔板底部后，将BPEA@PTX NPs，BPEA NPs和游离紫杉醇以一定的浓度添加到培养基中继续培养细胞。24h后，用新鲜的含MTT的培养基替换就培养基，继续孵育4h。再去除含有MTT的培养基。每孔加入150mL DMSO。用酶标仪读取560nm处的吸光度值，绘制细胞活力曲线。同时，细胞在相同药物浓度下不同作用时间的细胞活性也通过MTT方法进行评估。

抑瘤实验方法：用4T1荷瘤小鼠来评估BPEA@PTX NPs在体内的抗癌效果。实验方法如下：将100μl含有约3000000个4T1细胞的无血清培养基通过皮下注射的方法接种在4周龄雌性BALB/c小鼠背部。当肿瘤生长至约100mm³时，将荷瘤小鼠随机分为四组，每组5只。每组小鼠每三天通过尾静脉注射分别BPEA@PTX NPs,PTX,BPEA NPs和生理盐水。紫杉醇的注射计量为5mg/Kg。在游离紫杉醇组用聚氧乙烯蓖麻油作为助溶剂将紫杉醇溶解在生理盐水中再进行尾静脉注射。每三天测量小鼠肿瘤大小的体重。肿瘤大小的计算公式如下。

结果：结果显示BPEA@PTX NPs的平均粒径约为100nm(图3)。众所周知，纳米载体的粒径对细胞的摄取能力影响较大。我们制备的BPEA@PTX NPs粒径较小，有利于肿瘤细胞对载体的摄取，发挥其抗癌作用。如图4所示，BPEA@PTX NPs无论在同一时间点和在同一浓度不同时间点对三种肿瘤细胞的毒性都与游离紫杉醇相当。当BPEA@PTX NPs样品中紫杉醇的浓度为100ng/mL时，三种乳腺癌细胞的细胞活力都降低到50％以下，且BPEA@PTX NPs组合游离紫杉醇组的趋势一致。这说明BPEA载体对紫杉醇的肿瘤细胞药效无影响。另外，BPEA空载体BPEA NPs的肿瘤细胞毒性实验结果跟空白对照组结果一致，空载体对肿瘤细胞的增殖无影响。说明BPEA载体具有很好的生物相容性，对细胞无毒副作用。又保证了BPEA的使用安全性。

抑瘤实验结果如图5。空白对照组和空载体BPEA NPs组中小鼠背部肿瘤体积的生长趋势一致，说明空载体对小鼠肿瘤的生长和小鼠的健康无影响。在游离紫杉醇组中，肿瘤体积的增长速度明显低于空白对照组，肿瘤的生长在一定程度上受到了抑制。在BPEA@PTXNPs组中，小鼠背部肿瘤的生长相比于游离紫杉醇组得到了进一步的抑制。从结果中可以看出BPEA@PTX NPs组中肿瘤的大小是游离紫杉醇组的二分之一。

实施例4：负载维生素E的聚酯酰胺纳米颗粒的制备方法及其抗氧化能力测试：

我们用实施例1合成的基于氨基酸的支化型聚酯酰胺BPEA来构建维生素E(VE，一种用途广泛的商业抗氧化剂)的纳米载体得BPEA@VE NPs。通过纳米沉淀法制备BPEA@VENPs的过程如下所述：首先，将BPEA(5mg)和DSPE-PEG2000(1mg)和一定量的维生素E(1mg,2mg,4mg)溶解在0.5mL二甲基亚砜中。然后，将以上混合溶液逐滴加入到9.5mL搅拌的去离子水中。在这个过程中疏水性的维生素E通过纳米沉淀法被装载在BPEA纳米载体中得BPEA@VE NPs。在利用超滤管用PBS(pH 7.4)将BPEA@VE NPs溶液中的介质除去有机溶剂二甲基亚砜。以上含有不同维生素E比例的样品分别被标记为BPEA@VE1 NPs，BPEA@VE2NPs，BPEA@VE4NPs。BPEA NPs表示未装载维生素E的BPEA空载体。用DLS表征装载不同比例维生素E的BPEA@VE NPs的粒径。并用透射电镜观察BPEA@VE NPs的形态结构。在用于细胞实验前，用0.22μm的滤膜对样品进行除菌处理。最后通过细胞实验和皮肤伤口愈合实验测试BPEA@VE NPs的抗氧化能力和对组织再生的促进作用。

细胞内ROS清除实验方法：将小鼠胚胎成纤维细胞NIH 3T3细胞(ATCC)以10⁵个/孔的密度接种在12孔板中。在细胞培养箱中培养过夜后。去除培养基。将含有一定浓度BPEA@VE NPs的新鲜培养基加入到孔板中，继续培养。6h后再去除培养基。按照使用说明书将Rosup添加到新鲜培养基中刺激细胞30min，产生ROS。然后用PBS(pH 7.4)洗涤细胞3次。再按说明书向孔板中加入荧光探针DCFH-DA，细胞培养箱内孵育30min。最后通过荧光显微镜观察细胞，评估BPEA@VE NPs对细胞内ROS的清除能力。

皮肤伤口愈合实验方法：我们利用温敏型材料Pluronic F-127作为BPEA@VE NPs载体，进行SD大鼠全层皮肤伤口修复实验。Pluronic F-127作为一种温度敏感型材料，是一类新型高分子非离子型表面活性剂。在4℃条件下能够溶解在水中形成Pluronic F-127溶液。而在37℃时发生溶胶-凝胶转变，形成不具流动性的水凝胶4℃冰箱保存备用。在全层皮肤伤口愈合实验中，我们利用Pluronic F-127作为BPEA@VE NPs载体。实验步骤如下：首先按照之前提到的方法准备BPEA@VE NPs。将20mg Pluronic F-127溶解在100mLPBS(pH 7.4)缓冲液中，4℃冰箱保存。

我们选用体重约250g雄性SD大鼠来评估BPEA@C6 NPs对伤口愈合的影响。首先，将SD大鼠随机的分成三组。用手术剪刀在大鼠背部建立直径为1.5cm的圆形全层皮肤缺损。在空白对照组中，用无菌PBS(pH 7.4)清洗伤口后，再覆盖一层3M伤口保护膜。在实验组中，用无菌PBS(pH 7.4)清洗伤口后，在伤口处涂覆一层含BPEA@VE NPs的Pluronic F-127溶胶，在体温的作用下，在原位形成凝胶。再在表面覆盖一层3M伤口保护膜。在对照组中，用无菌PBS(pH 7.4)清洗伤口后，在皮肤伤口涂覆一层不含的Pluronic F-127溶胶。再在表面覆盖一层3M伤口保护膜。伤口处理完成后，每只大鼠分开侍养，避免相互攻击对伤口愈合以及实验结果的评价产生影响。每隔一定时间点观察并记录大鼠背部伤口修复情况。

结果：我们用荧光探针DCFH-DA(2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯)来研究BPEA@VENPs在细胞内的ROS清除能力(图6)。DCFH-DA本身没有荧光，能够自由穿过细胞膜进入细胞后被酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能穿过细胞膜而被装载在细胞内。DCFH在被细胞内的ROS氧化后能生成呀欧荧光的DCF。我们通过检测细胞的荧光强度就可以知道细胞内ROS水平，从而评估BPEA@VE NPs对细胞内ROS的清除能力。利用Rosup刺激3T3细胞产生细胞内ROS(图6)。在对照组种经过Rosup刺激和荧光探针DCFH-DA处理的细胞中能够观察到明显的绿色荧光。在实验组中，细胞先后经过BPEA@VE NPs孵育和Rosup刺激后，再装载荧光探针DCFH-DA。能够观察到绿色荧光的强度降低。且随着BPEA载体中维生素E的装载量增加，荧光强度进一步衰减。另外，从结果中可以看出聚酯酰胺空载体也具有一定的抗氧化能力。

在图7中，在伤口形成后的第5天，所有三组中的伤口都已经从炎症期过渡到增殖期。皮肤缺损处形成了粉色的肉芽组织。另外，在肉芽组织中大量的成纤维细胞的张力作用下，伤口面积也在逐渐缩小。从图中可以看出经过BPEA@VE NCs loaded F-127hydrogel处理后的伤口比对照组和F-127hydrogel组中的面积收缩更快。随着伤口愈合的进行，组间差异变的不那么明显。这一结果说明BPEA@VE NCs能够通过缩短炎症期促性肉芽组织的形成来加速伤口的早期愈合，降低慢性伤口形成的可能性。

实施例5：负载蛋白类药物的聚酯酰胺颗粒的制备方法及其向细胞内递送蛋白能力测试：

细胞摄取实验：通过荧光显微镜来观察HeLa细胞对BPEA/BSA-Rhodamine纳米复合物的摄取行为。实验步骤如下：首先，将标记有罗丹明的牛血清白蛋白BSA-Rhodamine与实施例2制备的BPEA通过纳米沉淀法制备出BPEA/BSA-Rhodamine纳米复合物。其中BSA-Rhodamine的浓度为200μg/mL。即将BPEA以40mg/mL的浓度溶解在二甲基亚砜中，将稳定剂DSPE-PEG2000以20mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜中，将BSA-Rhodamine以200μg/mL的浓度溶解在去离子水中。取100μL BPEA的稀释液溶液与160μL DSPE-PEG2000溶液混合均匀。然后在2000rpm的转速下，将0.2mL的BPEA与DSPE-PEG2000的混合溶液逐滴滴加到5mL BSA-Rhodamine的水溶液中，形成BPEA/BSA-Rhodamine纳米复合物。用超滤管除去溶液中的二甲基亚砜。将HeLa细胞以20万个/孔的密度接种在6孔板中。细胞培养箱中培养过夜后，去除培养基。再将BPEA/BSA-Rhodamine纳米复合物用培养基稀释至其中BSA-Rhodamine的浓度为50μg/mL后，加入到6孔板中，孵育细胞。在孵育细胞6h后，用无菌PBS(pH 7.4)洗涤细胞3次。最后用荧光显微镜观察并采集荧光图像。

结果：图8显示，游离BSA-Rhodamine孵育细胞5h后，用荧光显微镜没有观察到明显的红色荧光。而BPEA@BSA-Rhodamine NCs孵育细胞5h后，能够观察到明显的红色荧光。说明BPEA@BSA-Rhodamine NCs能够将BSA-Rhodamine顺利的地送到细胞内。将培养基中BPEA@BSA-Rhdamineo NCs的浓度增加到原来的两倍后，细胞中的红色荧光强度相比于浓度较低组明显增强。提高纳米复合物的浓度也利益与增加细胞对蛋白的摄取。

实施例6：负载胰岛素的聚酯酰胺颗粒的制备方法及其对1型糖尿病小鼠血糖的控制能力测试

实验方法：第一步，准备BPEA/insulin纳米复合物。步骤如下：配制浓度为0.01mol/L的盐酸。将胰岛素溶解在0.01mol/L的盐酸溶液中，胰岛素浓度为200μg/mL。将实施例2制备的BPEA溶解在二甲基亚砜中，浓度为20mg/mL。将稳定剂DSPE-PEG2000溶解于二甲基亚砜中，浓度为20mg/mL。取100μL BPEA溶液与160μL DSPE-PEG2000溶液混合均匀。然后在2000rpm的转速下，再将0.2mL BPEA与DSPE-PEG2000的混合溶液逐滴滴加入搅拌的5mL胰岛素的盐酸溶液中。用超滤管除去溶液中的二甲基亚砜。第二步，进行1型糖尿病小鼠降血糖能力测试。分别以3单位/Kg和6单位/Kg的剂量通过颈部皮下注射将BPEA/insulin纳米复合物注射进入小鼠体内。在设定的每个时间点，用血糖仪监测小鼠的血糖浓度。注射剂量为3单位/Kg的游离胰岛素组作为对照组。

结果如图9所示，游离的胰岛素通过颈部皮下注射进入糖尿病小鼠体内后，小鼠的血糖浓度迅速下降。在注射胰岛素后的1h后，血糖浓度达到最低，约5.0mmol/L。1h之后，小鼠的血糖浓度迅速升高。在注射2h后血糖浓度就超过正常的血糖浓度值。注射4h后，小鼠的血糖浓度就恢复到初始值。因此，游离胰岛素对血糖的控制见效快，但是持续时间短。在短时间血糖就会失控反弹。如果要控制好小鼠的血糖浓度在正常范围内，就需要频繁的注射给药。频繁给药会给患者造成严重的痛苦和不便。然而，糖尿病小鼠在注射BPEA与胰岛素形成的纳米复合物后，小鼠的血糖浓度也能迅速降低。在注射纳米复合物后1.5h，小鼠的血糖浓度降到最低，浓度约11.6mmol/L。随后，小鼠的血糖浓度缓慢上升。在注射后的8h后，血糖浓度升高为15.6mmol/L。此时的血糖浓度仍在正常范围内。在注射后的24h，小鼠的血糖基本恢复到初始值。相比于游离胰岛素，BPEA与胰岛素形成的纳米复合物能够有效延长胰岛素的有效作用时间。显著提高小鼠正常血糖浓度的持续时间。说明与BPEA形成复合物后，能够有效实现胰岛素在体内的缓释。

实施例7：基于肌醇的氨基酸基枝化聚酯酰胺的合成：

其他条件与实施例1相同，不同之处在于合成聚酯酰胺聚合物的单体配方不同。具体方法：基于肌醇的支化型聚酯酰胺(BPEA)是用单体Arg-6，Phe-ino和N4在三乙胺的催化下发生缩聚反应合成得到。具体合成方法如下：将Arg-6(0.774g)，Phe-ino(0.888g)和N4(0.338g)搅拌作用下加热到75℃使其溶解在10mL DMSO中。然后将0.3mL三乙胺作为催化剂加入反应体系中搅拌均匀。缩聚反应在75℃进行48h后，将产物溶解在甲醇中，然后用预冷的乙酸乙酯是产物沉淀出来。反复溶解沉淀三次得纯化的BPEA，再真空干燥24h后密封保存。纯化后的聚合物BPEA通过1H NMR鉴定其化学结构，结果如图1，命名为BPEA-2。GPC测试结果显示其分子量为4627。

实施例8：基于肌醇的氨基酸基枝化聚酯酰胺的合成：

其他条件与实施例1相同，不同之处在于合成聚酯酰胺聚合物的单体配方不同。具体方法：基于肌醇的支化型聚酯酰胺(BPEA)是用单体Arg-6，Phe-ino和N4在三乙胺的催化下发生缩聚反应合成得到。具体合成方法如下：将Arg-6(0.774g)，Phe-ino(0.444g)和N4(0.338g)搅拌作用下加热到75℃使其溶解在10mL DMSO中。然后将0.3mL三乙胺作为催化剂加入反应体系中搅拌均匀。缩聚反应在75℃进行48h后，将产物溶解在甲醇中，然后用预冷的乙酸乙酯是产物沉淀出来。反复溶解沉淀三次得纯化的BPEA，再真空干燥24h后密封保存。纯化后的聚合物BPEA通过1H NMR鉴定其化学结构，结果如图1，命名为BPEA-1。GPC测试结果显示其分子量为4551。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、将精氨酸，二元醇和对甲苯磺酸一水合物分散到溶剂中，进行酯化反应，初产物纯化，得到单体A；

S2、将苯丙氨酸，肌醇和对甲苯磺酸一水合物分散到溶剂中，反应，初产物纯化，得到单体B；

S3、冰浴状态下，将二元酰氯，三乙胺溶解在溶剂中，然后将溶解在预冷的溶剂中的对硝基苯酚逐滴加入到体系中，反应；换到常温状态下，继续反应；初产物纯化，得到单体C；

S4、将单体A，单体B和单体C加热溶解在溶剂中，加入三乙胺，搅拌均匀，进行缩聚反应；初产物纯化，即获得所述的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺；

步骤S1中所述的精氨酸，二元醇和对甲苯磺酸一水合物的配比为摩尔比1～4:1～2:4～10；

步骤S2中所述的苯丙氨酸，肌醇和对甲苯磺酸一水合物的配比为摩尔比5～14:1～2:7～30；

步骤S3中所述的二元酰氯，三乙胺，对硝基苯酚的配比为摩尔比15～25:40～50:38～45；

步骤S4中所述的单体A，单体B，单体C，三乙胺的配比为0.5～1g:0.1～2g:0.1～0.5g:0.1～0.3mL。

2.根据权利要求1所述的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺的制备方法，其特征在于：

步骤S1中所述的二元醇选自1,4-丁二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇或1,10-癸二醇中的一种或几种；

步骤S1、步骤S2中所述的溶剂均为甲苯；

步骤S3中所述的二元酰氯选自乙二酰氯、丁二酰氯或辛二酰氯中的一种或几种；

步骤S3中所述的溶剂均为丙酮；

步骤S4中所述的溶剂为二甲基亚砜。

3.根据权利要求1所述的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺的制备方法，其特征在于：

步骤S1中所述的酯化反应的条件为温度120～140℃、时间20～30h，反应过程中通过分水器去除产生的水分；初产物纯化的具体操作为：酯化反应完成后，待反应体系降至室温，去除体系中的溶剂，再在产物中加入异丙醇，升温搅拌至其溶解，再降温沉降，反复纯化3～5次，干燥，即可；

步骤S2中所述的反应的条件为温度120～140℃、时间20～30h，反应过程中通过分水器去除产生的水分；初产物纯化的具体操作为：反应完成后，待反应体系降至室温，去除体系中的溶剂，再将产物萃取，洗涤，干燥，即可；

步骤S3中滴加对硝基苯酚后反应的时间为1～2h，换到常温状态后的继续反应的时间为20～30h；初产物纯化的具体操作为：反应完成后，初产物通过在水中反复沉降3～5次，干燥，在丙酮和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中重结晶3～5次，再干燥，即可；

步骤S4中所述的加热的温度为70～80℃；缩聚反应的条件为温度70～80℃、时间45～55h；初产物纯化的具体操作为：将初产物溶解在甲醇中，然后用预冷的乙酸乙酯将产物沉淀出来，反复溶解沉淀3～5次，干燥，即可。

4.一种基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺，其特征在于：通过权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到。

5.根据权利要求4所述的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺，其特征在于：所述的聚酯酰胺的化学结构如式(Ⅰ)所示：

式中，n、x、y均表示聚合度，其中，n的取值范围为1～20，x与y的取值范围均为1～12。

6.权利要求5所述的基于肌醇和精氨酸的聚酯酰胺在制备药物纳米递送载体或制备纳米载药体系中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述的药物包括抗肿瘤药物，疏水性抗氧化剂，维生素类抗氧化剂，类胡萝卜素抗氧化剂，黄酮类化合物，酶类抗氧化剂，蛋白类抗氧化剂，水溶性蛋白类药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述的抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱、阿霉素、姜黄素；所述的水溶性蛋白类药物包括胰岛素、血清白蛋白、干扰素、组织纤溶酶原激活物、***、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素、免疫抑制剂、抗体、抗原多肽。

9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于：

当所述的应用为在制备药物纳米递送载体中的应用时，所述的应用的具体操作为：将所述的聚酯酰胺与稳定剂均溶解于有机溶剂中，在搅拌状态下将得到的混合溶液逐滴滴加至水中自组装成纳米粒，即可；

所述的聚酯酰胺、稳定剂、有机溶剂的配比为5g：0.1～10g:50～1000mL；

所述的稳定剂为DSPE-PEG 2000；

所述的有机溶剂为二甲基亚砜；

当所述的药物为抗肿瘤药物或疏水性抗氧化剂时，具体操作为：将所述的聚酯酰胺、稳定剂与药物溶解于有机溶剂中，在搅拌状态下将得到的混合溶液逐滴滴加至水中自组装成纳米粒，即可；其中，聚酯酰胺和药物的质量比为5：0.1～10；

当所述的药物为水溶性蛋白类药物时，具体操作为：将所述的聚酯酰胺溶于有机溶剂中，配成浓度为0.05～40mg/mL的溶液M，将稳定剂溶解于有机溶剂中，配成浓度为0.05～40mg/mL的溶液N，将溶液M和溶液N按1:1～2的体积比混合均匀，得到溶液L；将所述的药物溶于合适的溶剂***中，配成浓度为150～250μg/mL的药物溶液；再在1500～2500rpm转速下将所述的溶液L逐滴滴加至药物溶液中自组装成纳米粒，即可。

10.一种纳米载药体系，其特征在于：通过权利要求9中所述的应用的具体操作制备得到。

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