CN112661860B - 一种虎长效干扰素及其制备方法和在抗流感病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因药物领域，尤其涉及一种虎长效干扰素的制备及应用。本发明虎长效干扰素(SEQ ID NO.1)采用优化后的虎的干扰素基因(SEQ ID NO.2)和白蛋白(SEQ ID NO.3)重组的方式来延长干扰素的作用时间；本课题组采用的杆状病毒表达***本身的表达量高产品活性好，另外我们在原始基因的基础上进行针对性的序列优化后可以使表达量更进一步的提升，该方法具有大量生产的优势，产量高，可以有效降低其生产成本，并且对虎流感病毒有良好的保护效果和一定的预防效果。
Description
技术领域
本发明属于基因药物领域，尤其涉及一种虎长效干扰素及其制备方法和在抗流感病毒中的应用。
背景技术
流感，由流感病毒引起的全球性的严重传染病之一，每次流感的爆发都会给社会经济和人类健康带来巨大的损害。甲型流感病毒是属正黏科病毒，宿主范围广，包括人类、哺乳动物和禽类，可引发季节性流感和禽流感。1997年8月，香港报告了全球首个感染H5N1禽流感病毒死亡的病例；2002年我国就曾发现流感病毒对虎的感染(夏咸柱等，2003)；2004年泰国报道了H5N1亚型禽流感病毒对虎的致死性感染，近146只虎感染发病，发病虎临床常表现出高热、抽搐与肺炎等症状；近年在黑龙江等地发现东北虎感染流感致死病例；犬科动物、猫科动物和鼬科动物发现流感感染病例。特别是一些濒危的野生动物(如东北虎)，在感染高致病性的流感病毒时，往往因为得不到及时有效的救治而死亡。
干扰素是一种由脊椎动物产生的一种活性蛋白，它具有多种极具医疗价值的作用,如抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等作用,因此从发现之初到现在,对干扰素临床应用方面的研究一直在不断深入。虎的干扰素根据细胞来源和受体不同，可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型：Ⅰ型包括IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型；Ⅱ型只有IFN-γ，且只有一种亚型；Ⅲ型包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3共3个亚型。Ⅰ型干扰素的抗病毒作用最具有代表性，而且不论是天然产生的还是合成基因的重组IFN-α均能结合常见的细胞表面受体，并能诱导机体的抗病毒活性。
目前，在抗流感的研究领域中，由于干扰素见效快，效果显著而被选用，但是普通的干扰素半衰期短，不能发挥干扰素的全部疗效，严重限制其临床使用。在人类临床使用的干扰素中，常用融合蛋白重组干扰素的方式来延长干扰素的半衰期，也有相关文献在犬类中使用融合蛋白的形式来延长干扰素的半衰期，但是动物因为种类多，种间差异大，且干扰素的种属特异性高，所以交叉使用的可能很小。并且，对于野生濒危动物干扰素的研究却相对较少，本课题组立项研究一种高效、高活性、作用时间长的虎的干扰素。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明通过融合蛋白修饰的手段，提供一种延长干扰素作用时间的方法，该方法可以延长干扰素的半衰期，使干扰素在临床使用中发挥更大的效力，有效的解决了干扰素在虎的临床治疗中半衰期短无法提供高效保护的问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种长效干扰素蛋白IFN-α+ALB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：Pro Glu Phe Met Ala Leu Pro Ser Ser Phe Leu Val Ala Leu ValAla Leu Gly Cys Asn Ser Val Cys Cys Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His GlyLeu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Lys Arg Leu Pro Ala SerSer Cys Gln Lys Asp Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly AspGln Ser His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Thr Asn Gln Lys Ile PheHis Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu GluGlu Phe Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Ser Leu Glu Ala Cys Val Met GlnGlu Val Gly Glu Gly Glu Ala Pro Leu Thr AsnGlu Asp Ser Ile Leu Arg Asn TyrPhe Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys Ser Ser Pro Cys Ala Trp GluVal Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser Ile Ala Leu Gln LysArg Leu Arg Ser Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gly Leu Thr Arg Arg Glu AlaHis Gln Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Arg GlyLeu Val Leu Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His ValLys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Gly Cys Val Ala Asp Gln Ala AlaAla Asn Cys Glu Lys Ser Leu His Glu Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val AlaSer Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro GluArg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Gly Gln Leu ValThr Pro Glu Ala Asp Ala Met Cys Thr Ala Phe His Glu Asn Glu Gln Arg Phe LeuGly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu LeuLeu Tyr Tyr Ala Glu Glu Tyr Lys Gly Val Phe Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala AspLys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Val Asp Ala Leu Arg Glu Lys Val Leu Ala SerSer Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala PheLys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala GluIle Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ile His Lys Glu Cys Cys His Gly AspLeu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn GlnAsp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly Lys Pro Val Leu Glu Lys SerHis Cys Ile Ser Glu Ala Glu Arg Asp Glu Leu Pro Ala Asp Leu Ala Pro Leu AlaAla Asp Phe Val Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp ValPhe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg ArgHis Pro Glu Tyr Ser Val SerLeu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala ThrAsp Asp Pro Pro Thr Cys Tyr Ala His Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val GluGlu Pro His Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu TyrGly Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser ThrPro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys ThrHis Pro Glu Ser Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu AsnArg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg Val Thr Lys Cys CysThr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gln Val Asp Glu ThrTyr Val Pro Lys Glu Phe Ser Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys ThrLeu ProGlu Ala Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala Leu Val Glu Leu Leu LysHis Lys Pro Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Gly SerPhe Val Asp LysCys Cys Ala Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Glu Glu GlyPro Lys Leu Val Ala Thr Thr Gln Ala Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser His HisHis His His His。
所述的干扰素是通过白蛋白修饰的融合干扰素蛋白，具体由依据昆虫细胞偏爱密码子优化后的虎IFN-α和IFN-α+ALB基因通过与pFastBac1载体连接，制得重组杆状病毒Bacmid质粒，并转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达纯化得到所述长效干扰素蛋白IFN-α+ALB。
所述依据昆虫细胞偏爱密码子优化后的虎IFN-α基因和IFN-α+ALB基因由金唯智生物公司合成。
其中，所述优化后的虎IFN-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示ccggaattcatggcacttccatcttctttcttagtagctctggtggcattgggttgtaactctgtttgctgccttggatgcgatcttccacagacacatggacttcttaaccgacgagcacttacacttcttggacagatgaaacgacttccagcatcttcttgccagaaagatcgaaacgatttcgcattcccacaggatgtctttggaggcgaccagtctcataaagcacaggcactttctgttgttcatgttacaaaccagaagatattccacttcttttgtacagaagcatcttcttctgcagcatggaacacaacacttcttgaagagttctgcacaggacttgatcgacagcttacatctcttgaagcatgcgttatgcaggaagttggagaaggagaagcaccacttacaaacgaagattctatccttcgaaactacttccagcgactttctctttaccttcaggagaagaagtcatcgccatgcgcatgggaagttgttcgagcagaaatcatgcgatctctttactactcttctatcgcacttcagaaacgacttcgatctgagaagggtggcggcggttcccaccatcatcatcatcattgagcggccgcaaaaggaaaa；或者对所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
所述IFN-α+ALB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示ccggaattcatggcacttccatcttctttcctagtggccctcgtggcattaggctgtaactctgtttgctgccttggatgcgatcttccacagacacatggattgttgaatcgcagagcgcttacacttcttggacagatgaaacgacttccagcatcttcttgccagaaagatcgaaacgatttcgcattcccacaggatgtgtttggaggtgatcaatctcataaagcacaggcactgtccgtggtccacgtcacaaaccagaagatatttcatttcttctgcacagaagcatcttcttctgcagcatggaacacaacacttcttgaagagttctgcacaggacttgatcgacagcttacatctcttgaagcatgcgttatgcaggaagttggagaaggagaagcaccacttacaaacgaagattctatccttcgaaactacttccagcgactttctctttaccttcaggagaagaagagctcaccatgcgcatgggaagttgttcgagcagaaatcatgcgatctctttactactcttctatcgcacttcagaaacgacttcgatctgagaagggcggaggcgggagccgcggattaacgcgacgagaagcacatcagtctgaaatcgcacatcgattcaacgatcttggagaagaacatttccgaggacttgttcttgttgcattctctcagtaccttcagcagtgcccattcgaagatcatgttaaacttgttaacgaagttacagagttcgcaaagggatgcgtcgcagatcaggcagcagcaaactgcgagaagagcctgcatgaattatttggcgataaactttgcacagttgcatctcttcgagataaatacggagaaatggcagattgctgcgagaagaaggagcccgaacgaaacgaatgcttccttcagcataaagatgataacccaggattcggacagcttgttacaccagaagcagatgcaatgtgcacagcattccatgagaatgagcagcgattccttggaaagtatctatacgaaatcgcaaggcgccacccgtacttctacgctccagaacttctttactacgcagaagaatacaaaggagtatttacggaatgctgcgaagcagcagataaagcagcatgccttacaccaaaggtcgacgcacttcgagagaaggtactcgctagctctgcaaaggagcgtcttaaatgcgcatctcttcagaaattcggagaacgagcattcaaagcatggtctgttgcacgactttctcagaaattcccaaaggctgacttcgcagaaatctctaaacttgttactgacctagcgaagatacacaaggagtgttgtcacggcgatcttcttgaatgcgcagatgatcgagcagatctggccaagtatatatgcgagaatcaagattctatctctacaaagctcaaagagtgttgtggtaaacctgtgttagagaagtcccactgcatctctgaagcagaacgagatgaacttccagccgacctagcacccttggcagcagatttcgttgaggacaaggaggtatgtaagaattatcaggaagcaaaggacgtcttcttgggtacttttctttacgaatactctcggcggcacccggagtattctgtttctcttcttcttcgacttgcaaaggagtatgaagcaacacttgagaaatgctgcgccactgacgatccaccaacatgctacgcacatgtgtttgacgagttcaaacctttagtagaggagcctcataaccttgttaagaccaattgcgaactgtttgagaaactaggtgaatacggattccagaacgcacttcttgttcgatacacaaagaaggtacctcaggtttctacaccaacgttagtagaggtatcgcgatctcttggaaaggtcggctctaagtgttgtacgcaccctgaatctgaacgactttcttgcgcagaagattacctcagtgtagtgcttaacaggctctgtgttcttcatgagaagacgcctgtttctgaacgagttacaaagtgttgtactgagagccttgttaaccgacgaccatgcttctctgcacttcaggttgatgaaacatacgttccaaaggagttcagtgctgaaacattcacattccatgcagatctttgcacacttccagaagcagagaagcaaataaagaagcaatccgcacttgttgaacttcttaaacataaaccaaaggcgaccgatgaacagcttaagaccgtcatgggagatttcggatctttcgttgataagtgttgtgccgctgaagacaaggaggcttgtttcgcagaagaaggaccaaagttggtggcaacaacacaggcagcacttgcaggcggtggtgggtcccaccaccatcatcatcattgagcggccgcaaaaggaaaa；或者对所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
所述的优化后的虎IFN-α基因和IFN-α+ALB基因与pFastBac1载体酶切的限制性内切酶为EcoRI和NotI。
所述的依据昆虫细胞偏爱密码子优化遵循：编码的氨基酸序列不变；将稀有密码子去除；将影响mRNA稳定性和核糖体结合的茎环结构破坏。
所述纯化的方式为镍柱亲和层析的方式。
为了实现上述目的，本发明还提供所述白蛋白修饰的融合干扰素蛋白IFN-α+ALB的制备方法，包括以下步骤。
步骤一、重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将优化后的虎IFN-α基因和融合修饰后的IFN-α+ALB基因与pFastBac1载体的基因进行多克隆位点分析，选择载体上提供而目的片段中没有的两个限制性内切酶位点：EcoRI和NotI，双酶切后将回收目的片段***到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，即得重组杆状病毒Bacmid质粒。
步骤二、重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒。
步骤三、蛋白的大量表达及纯化：将获得的重组杆状病毒按MOI＝3感染昆虫细胞，3天后收获上清，将获得的上清通过镍柱亲和层析的方式纯化，即可得到长效干扰素蛋白IFN-α+ALB。
所述步骤一中，具体操作为：分别取1μl pFastBac-IFN-α和1μl pFastBac-IFN-α+ALB分别加入到两支50μl DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1ml无抗性的LB培养基，37℃培养48h，挑取白斑菌落，加入LB培养基,37℃200rpm/min摇床培养12h，提取质粒DNA进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒。
所述步骤二中当昆虫细胞的细胞汇合达到80％以上时，进行转染。
所述步骤三中的纯化操作方法为将上清加入到镍柱中使其充分结合，然后用25mM的咪唑冲洗，再用250mM的咪唑洗脱。
所述昆虫细胞为Sf9细胞。
本发明提供的虎长效干扰素在虎抗流感方面的应用。
本发明的显著技术效果。
本课题组采用虎的干扰素基因和白蛋白重组的方式来延长干扰素的作用时间；同时，由于动物干扰素类制品大都采用原核表达生产，这种生产方式的产品活性和产量都不理想，而本课题组采用的杆状病毒表达***本身的表达量高产品活性好，另外我们在原始基因的基础上进行针对性的序列优化后可以使表达量更进一步的提升，该方法具有大量生产的优势，产量高，可以有效降低其生产成本，并且对虎流感病毒有良好的保护效果和一定的预防效果。
附图说明
图1重组质粒的酶切鉴定和菌液PCR鉴定结果。
图2为重组质粒转染细胞后的上清基因组鉴定结果。
图3为所得蛋白的考马斯亮蓝染色鉴定和WesternBolt鉴定。
图4为所得蛋白通过MDCK-H5N1测定的体外活性影响结果。
图5为两种干扰素在小鼠体内半衰期相对结果。
图6为针对流感病毒(A/Tiger/Heilongjiang/HDHZ/2016)的攻毒保护。
具体实施方法
下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1融合蛋白昆虫细胞表达杆粒的构建与鉴定。
1材料。
E.coli DH5α感受态细胞购自Takara生物公司，E.coli DH10Bac感受态细胞由本实验室制备与保存，昆虫杆状病毒***载体pFastBac1购自Invitrogen公司，基因测序及引物合成等技术服务由金唯智公司及库美生物提供，限制性酶切酶FastDigest EcoRI和FastDigest NotI采购自Thermo Fisher Scientific。
E.coli DH10Bac感受态细胞制备方法如下：DH10Bac菌株划线LB平板，37℃培养20-24h，挑取单菌落接种到含5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200-220rpm，摇床振荡培养过夜。取1mL菌液接种于含100mL液体培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200-220rpm，摇床振荡培养3h，至OD值达到0.35-0.4。将菌液转移到无菌用冰预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使菌液冷却至0℃。4℃离心10min，4000rpm，回收细胞。弃去上清液，用移液枪吸净残液。每50mL菌液回收物用30mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬。4℃离心10min，4000rpm，回收细胞。弃去上清液，用移液枪吸净残液。每50mL菌液回收物用2mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含10％－20％甘油)重悬每份细胞沉淀。每管100μL分装感受态细胞于1.5mL离心管中，保存于-80℃冰箱备用。
2方法。
2.1优化的IFN-α和IFN-α+ALB由金唯智生物公司合成。
2.2本发明采用的是虎的干扰素基因和白蛋白基因融合后连接到pFastBac 1载体上，进行蛋白的表达。将得到的基因根据EcoRI和NotI酶切位点克隆到pFastBac1质粒中，转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂板过夜培养，筛选阳性菌，提质粒PCR、测序和酶切鉴定，得到正确的pFastBac-IFN-α和pFastBac-IFN-α+ALB质粒。再将质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，涂在含有卡那霉素、四环素、庆大霉素以及x-gal和IPTG的LB平板上，筛选阳性菌落，提取重组杆粒。鉴定IFN-α片段的PCR上游引物为CCGGAATTCATGGC ACTT、下游引物为TGCGGCCGCTC AATGATG；鉴定IFN-α+ALB片段的PCR上游引物为CGGAATTCA TGGCACTTC、下游引物为TGCGGCCGCTCAA TGAT。
2.3融合蛋白的大量表达。
将鉴定阳性的2种重组质粒用Lipofectamine 3000转染试剂转入sf9昆虫细胞，收取P3代细胞的上清使用基因组提取试剂盒提取上清基因组，并分别使用鉴定IFN-α片段的PCR上下游引物(上游引物为CCGGAATTCATGGCACTT、下游引物为TGCGGCCGCTC AATGATG)和鉴定IFN-α+ALB片段的PCR上下游引物(上游引物为CGGAATTCATGGCACTTC、下游引物为TGCGGCCGCTCAAT GAT)，鉴定基因的表达。鉴定正确后以MOI＝3接入第三代重组杆状病毒，杆状病毒感染悬浮细胞3天后收获，在4℃离心机中4000rpm离心10min收取细胞培养上清，将细胞沉淀反复冻融几次后4000rpm离心10min也收取细胞裂解上清。
2.4蛋白的镍柱层析纯化及验证。
将收集的细胞上清经镍柱纯化，用咪唑洗脱后，使用10％的SDS-PAGE凝胶进行考马斯亮蓝染色来检测蛋白的纯度，用Western Blot对洗脱的蛋白进行特异性验证。
3结果。
筛选的阳性克隆酶切鉴定及菌液PCR鉴定结果都如图1所示，其中pFastBac-IFN-α和pFastBac-IFN-α+ALB，其中pFastBac 1载体大小为4700bp、IFNα的片段大小为：630bp、IFNα+ALB的大小为2400bp；图中显示杆状病毒质粒构建正确，成功构建pFastBac-IFN-α和pFastBac-IFN-α+ALB；其中，A.重组质粒pFastBac-IFN-α的酶切鉴定1.Marker；2.pFastBac-IFN-α1#.；3.pFastBac-IFN-α2#；4.pFastBac-IFN-α3#；B.重组质粒pFastBac-IFN-α+ALB的酶切鉴定1.Marker；2.pFastBac-IFN-α+ALB 1#.；3.pFastBac-IFN-α+ALB 2#；C.重组质粒pFastBac-IFN-α的菌液PCR鉴定1.Marker；2.pFastBac-IFN-α1#.；3.pFastBac-IFN-α2#；4.pFastBac-IFN-α3#；D.重组质粒pFastBac-IFN-α+ALB的菌液PCR鉴定1.Marker；2.pFastBac-IFN-α+ALB；1#.；3.pFastBac-IFN-α+ALB 2#；4.pFastBac-IFN-α+ALB 3#。
鉴定正确后，大量表达，在细胞上清中也检测到了相应的基因，重组质粒转染细胞后的上清基因组鉴定结果见图2；结果显示细胞成功表达了杆状病毒质粒pFastBac-IFN-α和pFastBac-IFN-α+ALB；其中，A.pFastBac-IFN-α+ALB转染后细胞上清鉴定1.Marker；2.pFast Bac-IFN-α+ALB 1#.；3.pFastBac-IFN-α+ALB 2#；4.pFastBac-IFN-α+ALB 3#；B.pFastBac-IFN-α转染后细胞上清鉴定1.Marker；2.pFast Bac-IFN-α1#.；3.pFastBac-IFN-α2#。
所得蛋白的考马斯亮蓝染色鉴定和WesternBolt鉴定结果，见图3；其中，A.干扰素IFN-α蛋白(SEQ ID NO.4所示：Pro Glu Phe Met Ala Leu Pro Ser Ser Phe Leu Val AlaLeu Val Ala Leu Gly Cys Asn Ser Val Cys Cys Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln ThrHis Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Lys Arg Leu ProAla Ser Ser Cys Gln Lys Asp Arg AsnAsp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe GlyGly Asp Gln Ser His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Thr Asn Gln LysIle Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr LeuLeu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Ser Leu Glu Ala Cys ValMet Gln Glu Val Gly Glu Gly Glu Ala Pro Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ile Leu ArgAsn Tyr Phe Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys Ser Ser Pro Cys AlaTrp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser Ile Ala LeuGln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His)SDS-PAGE验证；B.重组扰素IFN-α+ALB蛋白SDS-PAGE验证；C.干扰素IFN-α蛋白WesternBolt鉴定，一抗为兔多抗；D.重组扰素IFN-α+ALB蛋白WesternBolt鉴定，一抗为兔多抗。在纯化的蛋白验证结果中我们也可以明确看到我们所需的蛋白，且Western Blot结果表示其具有良好的特异性。说明IFN-α和IFN-α+ALB两种蛋白表达正确。
实施例2长效干扰素的体外及体内活性鉴定。
1材料。
6-8周龄的BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华公司。小鼠(2,5-OAS)ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物，CCK-8检测试剂购自碧云天生物。
2方法。
2.1用MDCK细胞测定在体外对细胞活性的影响。
在MDCK细胞长至合适密度后，将猫干扰素标准品、优化后的IFN-α和优化后的IFN-α+ALB分别倍比稀释后加入细胞板中，培养48h，用H5病毒按100TCID50攻毒，继续培养60-72小时后，用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测细胞活性。
2.2小鼠体内半衰期的测定。
60只雌性小鼠分别腹腔注射IFNα、IFNα+ALB，以注射用水稀释至1mL，给小鼠经腹腔注射0.4mg/只，分别于注射后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h时随机选3只小鼠摘眼采血，3000rpm 5min离心收集血清。再使用小鼠2,5寡腺苷酸合成酶(2,5-OAS)酶联免疫分析(ELISA)检测试剂盒检测血清中的2,5寡腺苷酸合成酶含量。
2.3小鼠体内的预防及治疗效果评价。
小鼠H5N1(虎流感野毒株)攻毒试验，70只小鼠共分七组，每组10只小鼠，分别设置：IFN-α组：第一组攻毒前4h给药400μg，第二组攻毒后8h给药400μg，第三组为攻毒后24h之后给药400μg；IFN-α+ALB组：第四组攻毒前4h给药400μg，第五组攻毒后8h给药400μg，第六组为攻毒后24h之后给药400μg；第七组给PBS做为对照组。每只小鼠腹腔给药，首次给药后间隔时间24h，注射2次，以5倍MLD50采用滴鼻方式进行攻毒。攻毒后每天测定小鼠的体重和存活率。所有动物试验条件和试验程序都遵从国际疼痛研究协会的道德准则，并且该试验程序经过了中国人民解放军动物护理和实用委员会的批准，所有实验均在军事兽医研究所生物安全防护三级实验室(BSL-3)中进行操作。
3结果。
3.1体外细胞活性影响结果。
通过MDCK-H5N1***进行体外活性实验，见图4，其中，图中分组1-9分别为稀释倍数41、42、43、44、45、46、47、48、49，10为空白细胞对照，11为病毒阳性对照。活性检测结果显示：随着稀释梯度的不断增加三种干扰素制品对细胞活性的影响逐渐降低，其中普通干扰素制品对细胞的救治效果要远低于猫干扰素标准品和我们的长效干扰素制品，同时说明我们的长效干扰素制品的活性单位和猫干扰素标准品的活性单位基本持平。
根据标准品可测算蛋白的活性单位。
根据公式：
(其中Pr为标准品效价；Ds为待测样品的预稀释倍数；Es为待测样品相当于标准品半效价的稀释倍数；Dr；为标准品的预稀释倍数；Er为标准品半稀释倍数)
最终测定IFN-α＝3.75×105IU/ml。
IFN-α+ALB＝6.65×105IU/ml。
3.2两种干扰素在小鼠体内半衰期对比结果。
干扰素影响小鼠2,5寡腺苷酸合成酶(2,5-OAS)的表达，我们通过ELISA试剂盒测定小鼠血清中2,5寡腺苷酸合成酶(2,5-OAS)的量的多少，将得到的ELISA实验结果进行汇总，两者的相对比较得到图5，图中结果显示：普通的IFN-α干扰素在小鼠腹腔注射后随时间的推移呈递增趋势，在12小时达到最高值，而后衰减至第36小时后趋近于正常水平；而通过我们白蛋白修饰的干扰素在对小鼠注射后，在24小时达到最大值后，在96小时衰减至正常值。通过比较分析，我们所制备的融合蛋白干扰素与普通的干扰素相比体内活性有大幅提高且半衰期延长约3-5倍。
3.3小鼠体内预防及治疗效果评价结果。
以5MLD50的病毒((A/Tiger/Heilongjiang/HDHZ/2016))攻击病毒对照组和实验组，并分别在攻毒前4h，攻毒后8小时和攻毒后24小时分别给药，每天观察小鼠的体重变化和生存情况，得到如下结果见图6，图中A为攻毒后各组的小鼠体重变化率，从整体来看各组的体重变化率区别不大；图中B为攻毒后各组小鼠的死亡变化率，融合蛋白干扰素组预防的存活率为60％，攻毒8小时后治疗的存活率为40％，攻毒24小时后治疗的存活率为30％，而普通干扰素组预防的存活率为40％，攻毒8小时后治疗的存活率为30％，攻毒24小时后治疗无存活。通过体重变化率和存活率的结果来看，我们的融合蛋白干扰素组较普通干扰素组有较好的保护效果。
序列表
<110> 河南大学；军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 一种虎长效干扰素及其制备方法和在抗流感病毒中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> PRT
<213> IFN-α+ALBm
<400> 1
Pro Glu Phe Met Ala Leu Pro Ser Ser Phe Leu Val Ala Leu Val Ala
1 5 10 15
Leu Gly Cys Asn Ser Val Cys Cys Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr
20 25 30
His Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Lys
35 40 45
Arg Leu Pro Ala Ser Ser Cys Gln Lys Asp Arg Asn Asp Phe Ala Phe
50 55 60
Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly Asp Gln Ser His Lys Ala Gln Ala Leu
65 70 75 80
Ser Val Val His Val Thr Asn Gln Lys Ile Phe His Phe Phe Cys Thr
85 90 95
Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Glu Phe
100 105 110
Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Ser Leu Glu Ala Cys Val Met
115 120 125
Gln Glu Val Gly Glu Gly Glu Ala Pro Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ile
130 135 140
Leu Arg Asn Tyr Phe Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser
165 170 175
Leu Tyr Tyr Ser Ser Ile Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gly Leu Thr Arg Arg Glu Ala His Gln Ser
195 200 205
Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Arg Gly
210 215 220
Leu Val Leu Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu
225 230 235 240
Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Gly Cys
245 250 255
Val Ala Asp Gln Ala Ala Ala Asn Cys Glu Lys Ser Leu His Glu Leu
260 265 270
Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly
275 280 285
Glu Met Ala Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys
290 295 300
Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Gly Gln Leu Val Thr
305 310 315 320
Pro Glu Ala Asp Ala Met Cys Thr Ala Phe His Glu Asn Glu Gln Arg
325 330 335
Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe
340 345 350
Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Glu Tyr Lys Gly Val Phe
355 360 365
Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys
370 375 380
Val Asp Ala Leu Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Lys Glu Arg
385 390 395 400
Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala
405 410 415
Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala
420 425 430
Glu Ile Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ile His Lys Glu Cys
435 440 445
Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala
450 455 460
Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu
465 470 475 480
Cys Cys Gly Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ser Glu Ala
485 490 495
Glu Arg Asp Glu Leu Pro Ala Asp Leu Ala Pro Leu Ala Ala Asp Phe
500 505 510
Val Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val
515 520 525
Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr
530 535 540
Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu
545 550 555 560
Glu Lys Cys Cys Ala Thr Asp Asp Pro Pro Thr Cys Tyr Ala His Val
565 570 575
Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro His Asn Leu Val Lys
580 585 590
Thr Asn Cys Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn
595 600 605
Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro
610 615 620
Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys
625 630 635 640
Cys Thr His Pro Glu Ser Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu
645 650 655
Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val
660 665 670
Ser Glu Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg
675 680 685
Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gln Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu
690 695 700
Phe Ser Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro
705 710 715 720
Glu Ala Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala Leu Val Glu Leu Leu
725 730 735
Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Gly
740 745 750
Asp Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Glu Asp Lys Glu
755 760 765
Ala Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Thr Thr Gln Ala
770 775 780
Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
785 790 795
<210> 2
<211> 630
<212> DNA
<213> IFN-α
<400> 2
ccggaattca tggcacttcc atcttctttc ttagtagctc tggtggcatt gggttgtaac 60
tctgtttgct gccttggatg cgatcttcca cagacacatg gacttcttaa ccgacgagca 120
cttacacttc ttggacagat gaaacgactt ccagcatctt cttgccagaa agatcgaaac 180
gatttcgcat tcccacagga tgtctttgga ggcgaccagt ctcataaagc acaggcactt 240
tctgttgttc atgttacaaa ccagaagata ttccacttct tttgtacaga agcatcttct 300
tctgcagcat ggaacacaac acttcttgaa gagttctgca caggacttga tcgacagctt 360
acatctcttg aagcatgcgt tatgcaggaa gttggagaag gagaagcacc acttacaaac 420
gaagattcta tccttcgaaa ctacttccag cgactttctc tttaccttca ggagaagaag 480
tcatcgccat gcgcatggga agttgttcga gcagaaatca tgcgatctct ttactactct 540
tctatcgcac ttcagaaacg acttcgatct gagaagggtg gcggcggttc ccaccatcat 600
catcatcatt gagcggccgc aaaaggaaaa 630
<210> 3
<211> 2415
<212> DNA
<213> IFN-α+ALB
<400> 3
ccggaattca tggcacttcc atcttctttc ctagtggccc tcgtggcatt aggctgtaac 60
tctgtttgct gccttggatg cgatcttcca cagacacatg gattgttgaa tcgcagagcg 120
cttacacttc ttggacagat gaaacgactt ccagcatctt cttgccagaa agatcgaaac 180
gatttcgcat tcccacagga tgtgtttgga ggtgatcaat ctcataaagc acaggcactg 240
tccgtggtcc acgtcacaaa ccagaagata tttcatttct tctgcacaga agcatcttct 300
tctgcagcat ggaacacaac acttcttgaa gagttctgca caggacttga tcgacagctt 360
acatctcttg aagcatgcgt tatgcaggaa gttggagaag gagaagcacc acttacaaac 420
gaagattcta tccttcgaaa ctacttccag cgactttctc tttaccttca ggagaagaag 480
agctcaccat gcgcatggga agttgttcga gcagaaatca tgcgatctct ttactactct 540
tctatcgcac ttcagaaacg acttcgatct gagaagggcg gaggcgggag ccgcggatta 600
acgcgacgag aagcacatca gtctgaaatc gcacatcgat tcaacgatct tggagaagaa 660
catttccgag gacttgttct tgttgcattc tctcagtacc ttcagcagtg cccattcgaa 720
gatcatgtta aacttgttaa cgaagttaca gagttcgcaa agggatgcgt cgcagatcag 780
gcagcagcaa actgcgagaa gagcctgcat gaattatttg gcgataaact ttgcacagtt 840
gcatctcttc gagataaata cggagaaatg gcagattgct gcgagaagaa ggagcccgaa 900
cgaaacgaat gcttccttca gcataaagat gataacccag gattcggaca gcttgttaca 960
ccagaagcag atgcaatgtg cacagcattc catgagaatg agcagcgatt ccttggaaag 1020
tatctatacg aaatcgcaag gcgccacccg tacttctacg ctccagaact tctttactac 1080
gcagaagaat acaaaggagt atttacggaa tgctgcgaag cagcagataa agcagcatgc 1140
cttacaccaa aggtcgacgc acttcgagag aaggtactcg ctagctctgc aaaggagcgt 1200
cttaaatgcg catctcttca gaaattcgga gaacgagcat tcaaagcatg gtctgttgca 1260
cgactttctc agaaattccc aaaggctgac ttcgcagaaa tctctaaact tgttactgac 1320
ctagcgaaga tacacaagga gtgttgtcac ggcgatcttc ttgaatgcgc agatgatcga 1380
gcagatctgg ccaagtatat atgcgagaat caagattcta tctctacaaa gctcaaagag 1440
tgttgtggta aacctgtgtt agagaagtcc cactgcatct ctgaagcaga acgagatgaa 1500
cttccagccg acctagcacc cttggcagca gatttcgttg aggacaagga ggtatgtaag 1560
aattatcagg aagcaaagga cgtcttcttg ggtacttttc tttacgaata ctctcggcgg 1620
cacccggagt attctgtttc tcttcttctt cgacttgcaa aggagtatga agcaacactt 1680
gagaaatgct gcgccactga cgatccacca acatgctacg cacatgtgtt tgacgagttc 1740
aaacctttag tagaggagcc tcataacctt gttaagacca attgcgaact gtttgagaaa 1800
ctaggtgaat acggattcca gaacgcactt cttgttcgat acacaaagaa ggtacctcag 1860
gtttctacac caacgttagt agaggtatcg cgatctcttg gaaaggtcgg ctctaagtgt 1920
tgtacgcacc ctgaatctga acgactttct tgcgcagaag attacctcag tgtagtgctt 1980
aacaggctct gtgttcttca tgagaagacg cctgtttctg aacgagttac aaagtgttgt 2040
actgagagcc ttgttaaccg acgaccatgc ttctctgcac ttcaggttga tgaaacatac 2100
gttccaaagg agttcagtgc tgaaacattc acattccatg cagatctttg cacacttcca 2160
gaagcagaga agcaaataaa gaagcaatcc gcacttgttg aacttcttaa acataaacca 2220
aaggcgaccg atgaacagct taagaccgtc atgggagatt tcggatcttt cgttgataag 2280
tgttgtgccg ctgaagacaa ggaggcttgt ttcgcagaag aaggaccaaa gttggtggca 2340
acaacacagg cagcacttgc aggcggtggt gggtcccacc accatcatca tcattgagcg 2400
gccgcaaaag gaaaa 2415
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> IFN-α
<400> 4
Pro Glu Phe Met Ala Leu Pro Ser Ser Phe Leu Val Ala Leu Val Ala
1 5 10 15
Leu Gly Cys Asn Ser Val Cys Cys Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr
20 25 30
His Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Lys
35 40 45
Arg Leu Pro Ala Ser Ser Cys Gln Lys Asp Arg Asn Asp Phe Ala Phe
50 55 60
Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly Asp Gln Ser His Lys Ala Gln Ala Leu
65 70 75 80
Ser Val Val His Val Thr Asn Gln Lys Ile Phe His Phe Phe Cys Thr
85 90 95
Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Glu Phe
100 105 110
Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Ser Leu Glu Ala Cys Val Met
115 120 125
Gln Glu Val Gly Glu Gly Glu Ala Pro Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ile
130 135 140
Leu Arg Asn Tyr Phe Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser
165 170 175
Leu Tyr Tyr Ser Ser Ile Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
195 200
Claims (5)
1.一种长效干扰素蛋白IFN-α+ALB，其特征在于，所述IFN-α+ALB的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；所述IFN-α+ALB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述长效干扰素蛋白IFN-α+ALB的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将IFN-α+ALB基因与pFastBac1载体的基因进行多克隆位点分析，选择载体上提供而目的片段中没有的两个限制性内切酶位点：EcoRI和NotI，双酶切后将回收目的片段***到昆虫细胞表达载体 pFastBac1中，得到质粒pFastBac-IFN-α+ALB；然后，将质粒加入到DH10Bac感受态细胞中，经过冰浴，42℃热激，再次冰浴后，加入无抗性的LB培养基，37℃培养48h，挑取白斑菌落，加入LB培养基，37℃摇床培养12h，提取质粒DNA进行PCR 鉴定，鉴定正确的阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；
步骤二、重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；
步骤三、蛋白的大量表达及纯化：将获得的重组杆状病毒按MOI=3感染昆虫细胞，3天后收获上清，将获得的上清通过镍柱亲和层析的方式纯化，即可得到长效干扰素蛋白IFN-α+ALB。
3.如权利要求2所述的长效干扰素蛋白IFN-α+ALB的制备方法，其特征在于，所述步骤二中当昆虫细胞的细胞汇合达到 80％以上时，进行转染。
4.如权利要求2所述的长效干扰素蛋白IFN-α+ALB的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的纯化操作方法为将上清加入到镍柱中使其充分结合，然后用25mM的咪唑冲洗，再用250mM的咪唑洗脱。
5.如权利要求1所述的长效干扰素蛋白IFN-α+ALB在制备老虎抗流感病毒药物中的应用。
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| CN202011554908.9A CN112661860B (zh) | 2020-12-25 | 2020-12-25 | 一种虎长效干扰素及其制备方法和在抗流感病毒中的应用 |
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2020
- 2020-12-25 CN CN202011554908.9A patent/CN112661860B/zh active Active
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| 虎α干扰素与虎白蛋白融合蛋白的表达与鉴定;陈明涛等;《中国病原生物学杂志》;20210731;第16卷(第7期);第783-791页 * |
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