CN112661816B

CN112661816B - 用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒

Info

Publication number: CN112661816B
Application number: CN202110040788.9A
Authority: CN
Inventors: 段利华
Original assignee: Jiangxi Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Jiangxi Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: CN112661816A

Abstract

本发明涉及单抗血药浓度检测，具体涉及一种用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒。所述人工抗原包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。所述试剂盒包含所述人工抗原。本发明提供的人工抗原或试剂盒能够灵敏、准确地检测血清样品中利妥昔单抗的浓度，可用于提供准确的治疗药物监测数据，从而实现利妥昔单抗药物的精准治疗。

Description

用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒

技术领域

本发明涉及单抗的血药浓度检测，具体涉及一种用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒。

背景技术

随着单抗药物的深入研发和临床使用，临床问题也逐渐显现，不同个体对于单抗药物的响应程度有显著差异，初始治疗反应的比率在40％～90％，同样也有一部分初始治疗有反应的患者在治疗过程中出现响应丢失的情况，导致疾病进展。目前对于初始治疗无响应的具体机制仍然了解得不够清晰，影响因素也较多，比如表观遗传、病理机制、免疫原性等。治疗响应的个体差异及响应丢失被认为与血清中单抗药物浓度以及药物使用后免疫原性等因素相关，因此，基于治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring，TDM)进行剂量优化可为单抗药物精准治疗提供有效的手段。药物浓度检测是TDM实践的一个重要环节，对于单抗药物通常采用免疫学平台检测，目前采用最多的方法是酶联免疫法。用于单克隆抗体药物TDM的反应模式，在酶标板上包被单克隆抗体体内作用靶点的重组蛋白，加入单克隆抗体药物与抗原结合，再加入酶标记的抗人IgG抗体与抗原结合，加入酶催化底物TMB，加入终止液终止反应，即可根据吸光度测定来检测单抗药物浓度。

利妥昔单抗注射液(商品名：美罗华)作为最早应用于临床的CD20单抗类药物，广泛应用于CD20阳性的淋巴瘤患者。早在利妥昔单抗临床开发阶段，在低恶性度淋巴瘤患者中便观察到不同响应的患者体内的药物浓度有所差异，初次给药后达到临床缓解的患者体内的药物浓度(71.3μg.mL^-1)要高于无响应者(57.9μg.mL^-1)，经过4次给药后临床缓解患者体内的药物浓度(206.2μg.mL^-1)远高于未缓解群体(129.1μg.mL^-1)。因此，对利妥昔单抗进行准确治疗药物监测(TDM)对于利妥昔的治疗效果是非常重要的。

利妥昔单抗(rituximab)是人鼠嵌合抗体，由鼠抗CD20单抗的可变区Fab和人IgG1抗体稳定区Fc片段构成，含1328个氨基酸残基，相对分子量约144×10³Da。广泛用于B细胞淋巴瘤的治疗，由IDEC公司研发，是第一个获准用于临床治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单抗。除此之外，已获批准的适应症还包括类风湿性关节炎、类风湿性关节炎继发症、慢性淋巴细胞白血病、韦格纳肉芽肿和显微镜下多血管炎。利妥昔单抗自1997年被美国FDA批准上市后销量逐年增加，2018年销售额为67.52亿美元，名列全球抗肿瘤药物销量前茅。利妥昔的作用靶点为CD20，CD20是人类B淋巴细胞表面特有的标识，由297个氨基酸残基组成，相对分子质量约为33×10³Da，属于非糖基化磷蛋白，对B淋巴细胞的增殖和分化具有调节作用。CD20在循环的B细胞上普遍表达，具有四个跨膜螺旋，带有两个细胞外环ECL1和ECL2，第二个更长，并含有二硫键。

虽然利妥昔单抗已经成功应用于临床，但人们对于利妥昔作用于CD20的具体抗原位置以及利妥昔是如何激活补体以杀死B细胞仍然知之甚少。其中可以明确的是，利妥昔并非作用于CD20抗原的单个线性表位，而是作用于CD20的跨膜区域的多个抗原表位。2020年2月，Genentech在Science上发表的一篇文章中突破性地解析了全长CD20蛋白以及CD20蛋白与利妥昔单抗复合物的三维结构。文章证实利妥昔单抗对CD20的识别不止有一级表位ECL2，还可识别其二级表位ECL1/ECL2。其他体外研究结果证明，用原核或真核表达的CD20全长蛋白作为抗原，在体外无法与利妥昔单抗反应，因此无法用于利妥昔单抗的药物浓度监测(TDM)。

发明内容

为了准确监测利妥昔单抗的血药浓度，本发明利用肽模拟表位构建了一种人工抗原。将编码人工抗原的密码子优化后进行全基因合成，然后通过原核表达获得了重组蛋白。该人工抗原含有多个肽模拟序列，其结合利妥昔单抗的能力更高且特异性强。

一方面，本发明提供一种用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原，其特征在于，所述人工抗原包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，所述人工抗原还包含标签序列。所述标签序列可以是GST标签序列。

在本发明的一些实施例中，所述人工抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12所示。

本发明还请求保护编码所述用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原的基因。

在本发明的一些实施例中，所述基因包含SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，包含所述用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原。

在本发明的试剂盒的一些实施例中，所述人工抗原包被在酶标板上，其包被浓度为0.05～0.25μg/mL。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒还包含酶标二抗、样品稀释液、标准品、底物显色液、终止液和/或浓缩洗涤液。所述浓缩洗涤液在使用前稀释。

在本发明的试剂盒的一些实施例中，所述酶标二抗为HRP标记的鼠抗人IgG。

在本发明的试剂盒的一些实施例中，所述标准品为30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和10000ng/ml的利妥昔单抗溶液。

在本发明的试剂盒的一些实施例中，所述样品稀释液为含0.3M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L硫酸；所述浓缩洗涤液为pH 7.4，含0.05％(v/v)Proclin300、2.0％(v/v)吐温-20的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

还在另一方面，本发明提供所述用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：合成所述人工抗原的编码基因，构建表达载体，转化宿主菌后诱导蛋白表达。

在本发明的制备方法的一些实施例中，通过人工合成技术获得核苷酸序列如SEQID NO:4，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的基因，将合成的基因导入pGEX-6p-1载体中并转化大肠杆菌BL-21(DE3)，培养重组大肠杆菌并利用IPTG诱导蛋白表达，通过亲和层析法获得纯化的重组蛋白，即得本发明的人工抗原。

在法律允许的范围内，本发明还请求保护一种检测利妥昔单抗血药浓度的方法，采用本发明的试剂盒进行检测，包括如下步骤：

(1)向包被有所述人工抗原的酶标板中加入样品稀释液90μL，每孔加样品10μL，并在预留的孔中加入利妥昔标准品溶液各100μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应60分钟；

(2)甩干孔内液体，洗板5次，拍干；

(3)每孔中各加入HRP标记的鼠抗人IgG溶液100μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30分钟；

(4)甩干孔内液体，洗板5次，拍干；

(5)每孔加入底物显色液A液50μL，底物显色液B液50μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱中避光显色10分钟；

(6)每孔加入2mol/L硫酸终止液50μL，轻轻振荡混匀；

(7)将酶标仪波长设定在450/630nm处，测定每孔吸光度值；

(8)以标准品的吸光度值和浓度值绘制四参数拟合曲线，将样品的吸光度值代入曲线，计算各样品中的利妥昔单克隆抗体浓度。

本发明提供的人工抗原，在同一个蛋白中含有多个CD20肽模拟表位(多肽1、多肽2和多肽3)，克服了CD20全长蛋白在体外无法与利妥昔单抗反应的缺陷，与单个多肽相比，提高了在体外与利妥昔单抗结合的能力，且不受合成条件的影响，能够通过体外表达方法进行大量稳定制备。利用利妥昔单抗标准品溶液对人工抗原和多肽进行性能验证，结果表明多肽1、多肽2和多肽3的检出限均大于30ng/mL，而本发明的人工抗原的检测灵敏度在30ng/mL以下，其中氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人工抗原的线性范围最宽。本发明制备的用于利妥昔单抗血药浓度检测的试剂盒，采用本发明的人工抗原包被酶标板，用于酶联免疫法检测血清样品中利妥昔单抗的血药浓度，特异性高达99％。临床试验结果显示，采用本发明的试剂盒对服用了利妥昔单抗药物的病人血清样品进行检测，检测结果与商业化试剂盒的检测结果具有高度的一致性。

综上，本发明提供的人工抗原和试剂盒能够灵敏、准确地检测血清样品中利妥昔单抗的浓度，可用于提供准确的治疗药物监测数据，实现利妥昔单抗药物的精准治疗。

附图说明

图1.纯化的重组蛋白Rp1、Rp2、Rp3的SDS-PAGE电泳图。

图2.纯化的重组蛋白Rp1、Rp2、Rp3的Western Blot检测图。

图3.不同抗原(多肽1，2，3，蛋白Rp1、Rp2、Rp3)对利妥昔单抗的检测性能比较；其中，横坐标为利妥昔单抗标准品浓度(ng/ml)，纵坐标为抗原抗体反应物在450/630nm的吸光度值。

图4.本发明试剂盒与商业化试剂盒对利妥昔单抗血药浓度的检测结果比对；其中，横坐标为采用本发明试剂盒P1、试剂盒P2、试剂盒P3检测的利妥昔单抗血药浓度(μg/ml)，纵坐标为采用商品化试剂盒检测的利妥昔单抗血药浓度(μg/ml)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

主要试剂与耗材

载体pGEX-6p-1：购买自湖南丰晖生物科技有限公司，货号：YH005。

T-Vector pMD^TM 19(Simple)：购买自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：3271。

限制性内切酶：BamH I和Not I均购自NEB(北京)有限公司，货号为#R0136S和#R0189S。

T4 DNA连接酶：宝生物科技有限公司(大连)，货号：2011A。

普通琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号DP209)、质粒小提试剂盒(货号DP103-02)购自天根生化科技(北京)有限公司。

Trans5α感受态细胞(货号CD201-01)、大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞(货号CD601)、羊抗鼠二抗(货号HS201-01)购自北京全式金生物技术有限公司。

Sepharase 4B：Thermo Fisher，购自北京金石百优科技有限公司，货号：16100。

抗GST抗体：购自上海碧云天生物技术有限公司，货号：AG768。

Red-PAGE彩色快速凝胶配制试剂盒12％(Sevenbio，货号SW145-02)、5×蛋白上样缓冲溶液(Sevenbio，货号SW163-01)、封闭液(Sevenbio，货号SW162-02-02)、10×TBST(Sevenbio，货号SW111-02)购自赛文创新(北京)科技有限公司。

SuperSignal化学发光底物：购自赛默飞世尔科技公司，货号：7JU6896。

BCA-100蛋白质定量试剂盒：购自北京赛驰生物科技有限公司，货号：300001-B。

利妥昔单抗：美国罗氏公司，批号为H0278。

双组分TMB显色液(索莱宝，货号PR1210)、HRP标记的鼠抗人IgG(索莱宝，货号K0001M-HRP)购自北京索莱宝科技有限公司。

酶标板：Corning，货号：42592。

酶联物稀释液：由Biopanda诊断试剂公司生产，货号为EL0004。

下述实施例中的基因合成均委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。下述实施例中所使用的正常人血清样品和病人血清样品由江西省人民医院提供。

若未特别说明，以下实施例中所使用的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得。若未特别说明，以下实施例中所使用的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或制造厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1.用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原的表达与纯化

1.重组蛋白的序列设计

我们寻找到利用噬菌体肽库技术发现的肽模拟物序列，分别为多肽1：CALMIANSC，多肽2：CWWEWTIGC，多肽3：WPTWLE。我们将多肽1、多肽2、多肽3这三条多肽序列以柔性肽GGGGS相连，并进行不同的序列组合，得到了如下重组蛋白序列：

P1：CALMIANSCGGGGSCWWEWTIGCGGGGSWPTWLE(SEQ ID NO:1)；

P2：CWWEWTIGCGGGGSCALMIANSCGGGGSWPTWLE(SEQ ID NO:2)；

P3：CALMIANSCGGGGSWPTWLEGGGGSCWWEWTIGC(SEQ ID NO:3)。

2.基因合成与载体构建

用于原核表达的大肠杆菌菌株BL-21(DE3)对密码子有一定的偏好性，因此我们首先对重组蛋白P1，P2和P3的基因编码序列进行了密码子优化，优化的基因编码序列如下：

rP1序列(5’-3’)：

tgcgcgctgatgattgcgaacagctgcggcggcggcggcagctgctggtgggaatggaccattggctgcggcggcggcggcagctggccgacatggctggaa(SEQ ID NO:4)；

rP2序列(5’-3’)：

tgctggtgggaatggaccattggctgcggcggcggcggcagctgcgcgctgatgattgcgaacagctgcggcggcggcggcagctggccgacatggctggaa(SEQ ID NO:5)；

rP3序列(5’-3’)：

tgcgcgctgatgattgcgaacagctgcggcggcggcggcagctggccgacatggctggaaggcggcggcggcagctgctggtgggaatggaccattggctgc(SEQ ID NO:6)。

由于重组蛋白较小，我们选择带有GST标签的载体pGEX-6p-1用于目标蛋白的表达。对pGEX-6p-1的酶切位点进行分析后，选择BamH I和Not I作为重组蛋白编码基因连入载体的酶切位点，因此我们在重组蛋白的基因序列的5’端和3’端分别引入酶切位点BamH I(5’-GGATCC-3’)和Not I(5’-GCGGCCGC-3’)及其各自的保护碱基。然后委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行全基因合成，并将合成的基因序列连入T-Vector pMD^TM 19(Simple)载体，得到的重组载体经过测序分析显示其序列完全正确。我们将连有编码各重组蛋白的核苷酸序列的重组载体分别命名为rP1-T、rP2-T、rP3-T。克隆至T载体的三个核苷酸序列分别如下，酶切位点用下划线标记：

带酶切位点的rP1序列(5’-3’)：

cgcggatcctgcgcgctgatgattgcgaacagctgcggcggcggcggcagctgctggtgggaatggaccattggctgcggcggcggcggcagctggccgacatggctggaagcggccgctaaactat(SEQ ID NO:7)；

带酶切位点的rP2序列(5’-3’)：

cgcggatcctgctggtgggaatggaccattggctgcggcggcggcggcagctgcgcgctgatgattgcgaacagctgcggcggcggcggcagctggccgacatggctggaagcggccgctaaactat(SEQ ID NO:8)；

带酶切位点的rP3序列(5’-3’)：

cgcggatcctgcgcgctgatgattgcgaacagctgcggcggcggcggcagctggccgacatggctggaaggcggcggcggcagctgctggtgggaatggaccattggctgcgcggccgctaaactat(SEQ ID NO:9)。

我们用限制性内切酶BamH I和Not I从rP1-T、rP2-T、rP3-T载体上切下大小均为102bp的rP1、rP2、rP3片段。同时，用限制性内切酶BamH I(NEB，#R0136S)和Not I(NEB，#R0189S)对pGEX-6p-1载体进行线性化。

酶切体系：

酶切条件：37℃酶切3h。采用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根，DP209)，按照试剂盒说明书上的操作步骤分别回收102bp的rP1、rP2、rP3片段。然后使用T4 DNA连接酶(Takara，2011A)将三个酶切DNA片段分别连接至pGEX-6p-1线性载体中。连接体系如下：

16℃连接过夜，得到连接产物。用热激法将连接产物分别转化到Trans5α感受态细胞(北京全式金，CD201-01)中，方法如下：向感受态细胞中加入10μL连接产物，冰上静置30min；于45℃热激45s后，快速将离心管转移到冰上静置2min；加入500μL无抗生素、无菌的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床培养45min，复苏细胞；吸取100μL菌液，涂布于100μg/mLAmp⁺抗性LB平板培养基上，37℃过夜培养。挑选阳性单克隆进行测序。测序结果表明rP1、rP2、rP3片段均分别成功连入表达载体中。将表达重组蛋白的原核表达载体分别命名为pGEX-Rp1，pGEX-Rp2，pGEX-Rp3。表达的蛋白序列如下所示，其中三个表位用下划线标记，各表位之间用柔性肽GGGGS连接，其他氨基酸序列为标签蛋白GST序列。

蛋白Rp1：

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLIEGRGIPRNSCALMIANSCGGGGSCWWEWTIGCGGGGSWPTWLEVDSSGRIVTD(SEQ ID NO:10)

蛋白Rp2：

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLIEGRGIPRNSCWWEWTIGCGGGGSCALMIANSCGGGGSWPTWLEVDSSGRIVTD(SEQ ID NO:11)

蛋白Rp3：

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLIEGRGIPRNSCALMIANSCGGGGSWPTWLEGGGGSCWWEWTIGCVDSSGRIVTD(SEQ ID NO:12)

3.蛋白诱导表达与纯化

(1)质粒提取与转化

使用质粒小提试剂盒(天根，DP103-02)，按照试剂盒说明书的操作步骤提取重组质粒pGEX-Rp1，pGEX-Rp2，pGEX-Rp3。用热激法将三种重组质粒分别转入大肠杆菌BL-21(DE3)细胞(北京全式金，CD601)中，转化方法同前，获得重组菌。

(2)蛋白表达

将重组菌接种到100μg/mL Amp⁺抗性的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养。待OD₆₀₀≈0.8时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃诱导表达3h。将菌液分装至高速离心瓶中，8000rpm离心5min，收集菌体。使用JY92－II型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)裂解重组菌，200W，15s×10次。将裂解产物于10000rpm离心10min，取细胞裂解液上清进行SDS-PAGE检测。

我们利用ExPASy软件(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测带有GST标签的重组蛋白(Rp1、Rp2、Rp3)的分子量约为31kDa。SDS-PAGE结果显示，3种重组蛋白在1mM的IPTG诱导3小时后都得到很好的表达，可清晰看见经过诱导的各重组质粒表达产物在31kDa左右有一条浓染蛋白带，因此经诱导的重组质粒表达产物大小与预期蛋白大小相符合。

(3)重组融合蛋白的亲和层析纯化

重悬Sepharase 4B(Thermo Fisher)，取1mL装柱，使用4mL平衡液(pH 8.0，50mMTris，150mM NaCl)平衡。滤去平衡液，打开柱底盖，取出琼脂珠，置于一干净的3mL离心管中，加入上述重组大肠杆菌的细胞裂解液上清1mL，轻轻混匀，置于室温下5～10min，其间混匀数次，500rpm离心10min，去上清。加入2mL Tris-HCl缓冲液重悬，置于室温下5～10min，其间混匀数次，500rpm离心10min，去上清；重复1次。离心管内加入200μL谷胱甘肽洗脱液(50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0)，轻轻混匀，置于室温下5～10min，其间混匀数次，500rpm离心10min，收集上清，透析除去谷胱甘肽，得纯化的重组蛋白(Rp1、Rp2、Rp3)，-80℃保存备用。

使用SDS-PAGE电泳检测纯化的重组蛋白，结果如图1所示，经亲和层析后重组蛋白的条带单一，分子量约为31kDa。使用抗GST抗体对纯化的重组蛋白做Western Blot检测。步骤如下：使用Red-PAGE彩色快速凝胶配制试剂盒12％(Sevenbio，SW145-02)配制凝胶。取20μL重组蛋白加入5μL 5×蛋白上样缓冲溶液(Sevenbio，SW163-01)至沸水中煮沸5min。上样后进行电泳，浓缩胶用60V电压，分离胶用80V电压电泳至溴酚兰刚跑出胶即可终止电泳，进行转膜。转膜用350mA电流转移40min后将膜取出，室温下用封闭液(Sevenbio，SW162-02-02)封闭1h后，用1:1000的抗GST抗体(上海碧云天，AG768)杂交，室温1h后，用ddH₂O稀释10×TBST(Sevenbio，SW111-02)，然后清洗膜3次，每次5min。加入1:5000羊抗鼠二抗(北京全式金，HS201-01)室温1h后，再次用1×TBST清洗膜3次，膜上加入SuperSignal化学发光底物(Thermo Fisher，7JU6896)进行检测。结果如图2所示，在目标区域出现了分子量约为31KDa的条带，为目的重组融合蛋白质。

按照BCA-100蛋白质定量试剂盒(北京赛驰生物，300001-B)操作说明书进行试验，对纯化的重组蛋白进行定量测定，方法如下：以BCA-100蛋白质定量试剂盒标准蛋白所测平均OD值为纵坐标，各孔的蛋白质浓度(mg/mL)为横坐标制作标准蛋白曲线，经线性回归拟合得回归方程，将样品的OD值代入，计算出三种重组蛋白的浓度。用PBS(pH 7.0)将三种重组蛋白(Rp1、Rp2、Rp3)的浓度均调整到1mg/mL。

实施例2.重组蛋白的性能检测

1、溶液配制

pH 7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液：称取7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄和1.8g K₂HPO₄，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。保存于4℃冰箱中即可。

标准品：用pH 7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液将利妥昔单抗(美国罗氏，批号H0278)分别稀释为终浓度30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和10000ng/ml，得到6个浓度的标准品(S1-S6)。

洗涤液：含0.05％Tween20(v/v)的0.01M pH 7.4PBS缓冲液。

封闭液：每100ml磷酸盐缓冲液(pH 7.4，0.01mol/L)中加入2g牛血清白蛋白。

底物显色液：双组分TMB显色液(索莱宝，PR1210)。

包被缓冲液(pH9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液)：取3.34克无水碳酸氢钠和1克无水碳酸钠，加蒸馏水充分搅拌，调节pH值到9.6，定容至500ml即可。

2、酶标板的包被

实验组：使用实施例1纯化的重组蛋白Rp1、Rp2、Rp3分别包被酶标板(Corning，42592)。包被方法为：用包被缓冲液(pH9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液)将纯化的重组蛋白(1mg/mL)进行1：10000稀释(即包被浓度为0.1μg/mL)，加入到酶标板孔中，每孔100μL，37℃反应2小时，甩掉包被液后，拍干，每孔加入200μL的封闭液(含2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)，37℃反应2小时，甩掉封闭液，拍干，干燥，用铝箔袋真空包装保存。

对照组：用人工合成的多肽1(CALMIANSC)、多肽2(CWWEWTIGC)和多肽3(WPTWLE)分别包被酶标板，包被方法同实验组，包被浓度为0.1μg/mL。

3、灵敏度检测

(1)向包被了蛋白或多肽的酶标板中加入标准品S1-S6各100μL，未服用药物的正常人血清10份(K1-K10)各100μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应60分钟。

(2)甩干孔内液体，用洗涤液洗板5次，拍干。

(3)每孔中各加入辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG(索莱宝，K0001M-HRP)(用封闭液按照1:10000稀释)100μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30分钟。

(4)甩干孔内液体，用洗涤液洗板5次，拍干。

(5)每孔加入底物显色液A液(过氧化脲)50μL，底物显色液B液(四甲基联苯胺，TMB)50μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10分钟。

(6)每孔加入2mol/L硫酸终止液50μL，轻轻振荡混匀。

(7)将酶标仪(Thermo Scientific，Multiskan FC)波长设定在450/630nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

4、检测结果

检测数据如表1、表2和图3所示。从表1可以看出这六种抗原的吸光度的检测限分别为0.093、0.085、0.083、0.073、0.043、0.066。从表2可以看出多肽1、多肽2和多肽3对利妥昔单抗的检出限均大于30ng/mL，重组蛋白Rp1、Rp2和Rp3的检测灵敏度都在30ng/mL以下。蛋白Rp2的线性范围最宽，性能最好，最适合作为利妥昔单抗检测的抗原使用。

实施例3.用于利妥昔单抗浓度检测的试剂盒(一)试剂盒的组成

1、包被有重组蛋白的酶标板：包被蛋白为实施例1纯化的重组蛋白Rp1/Rp2/Rp3，包被浓度可以为0.05～0.25μg/mL；

2、HRP标记的鼠抗人IgG：其工作浓度可以为1:5000～1:80000稀释液；

3、样品稀释液：含0.3M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)；

4、标准品S1-S6：分别为30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和10000ng/ml的利妥昔单抗溶液；

5、底物显色液：由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲；底物显色液B液为四甲基联苯胺；

6、终止液：2mol/L硫酸；

7、20×浓缩洗涤液：pH值为7.4，含有终浓度为0.05％的Proclin300(v/v)、终浓度为2.0％(v/v)的吐温-20、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。

(二)试剂盒的制备

包被酶标板：使用实施例1纯化的重组蛋白Rp1、Rp2和Rp3分别包被酶标板。包被方法为：用包被缓冲液(pH值为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液)将重组蛋白(1mg/mL)进行1：10000稀释，加入到酶标板孔中，每孔100μL，37℃反应2小时；甩掉包被液后，拍干，每孔加入200μL的封闭液(含2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)，37℃反应2小时；甩掉封闭液，拍干，干燥，用铝箔袋真空包装保存。

准备酶标抗体：HRP标记的鼠抗人IgG需经亲和层析纯化，种属特异性强，纯度大于95％，效价不低于1:2000。HRP标记的鼠抗人IgG(索莱宝，货号K0001M-HRP)，使用时选择商品化酶联物稀释液(Biopanda，货号EL0004)进行稀释。

配制样品稀释液：含0.3M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，配方为：称取17.5gNaCl，1g KCl，1.2g KH₂PO₄和9g K₂HPO₄，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。

配制标准品：使用商品化的利妥昔单抗药品(美国罗氏公司生产，批号为H0278)制备标准品。用pH值为7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液将利妥昔单抗稀释为终浓度30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和10000ng/ml，得到标准品S1-S6。

配制浓缩洗涤液：先配制pH 7.4，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。然后加入Proclin300至终浓度为0.05％(v/v)，加入吐温-20至终浓度为2.0％(v/v)。使用时用蒸馏水稀释20倍。

试剂盒组装：

试剂盒P1：将包被有重组蛋白Rp1的酶标板、HRP标记的鼠抗人IgG、样品稀释液、标准品S1-S6、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液以及试剂盒使用说明书，全部装入试剂盒中。

试剂盒P2：将包被有重组蛋白Rp2的酶标板、HRP标记的鼠抗人IgG、样品稀释液、标准品S1-S6、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液以及试剂盒使用说明书，全部装入试剂盒中。

试剂盒P3：将包被有重组蛋白Rp3的酶标板、HRP标记的鼠抗人IgG、样品稀释液、标准品S1-S6、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液以及试剂盒使用说明书，全部装入试剂盒中。

试剂盒使用方法：

(1)向包被有重组蛋白的酶标板中加入样品稀释液90μL，每孔加样品10μL，并在预留的孔中加入标准品S1-S6各100μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应60分钟；

(2)甩干孔内液体，1×洗涤液洗板5次，拍干；

(3)每孔中各加入HRP标记的鼠抗人IgG(用酶联物稀释液按照1：20000稀释)100μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30分钟；

(4)甩干孔内液体，1×洗涤液洗板5次，拍干；

(5)每孔加入底物显色液A液50μL，底物显色液B液50μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10分钟；

(6)每孔加入2mol/L硫酸终止液50μL，轻轻振荡混匀；

(7)将酶标仪波长设定在450/630nm处，测定每孔吸光度值(OD值)；

(8)以标准品的吸光度值和标识浓度值为标准，进行四参数拟合曲线，将各检测孔的吸光度值带入曲线，求取各样品中的利妥昔单克隆抗体浓度。

实施例4.本发明试剂盒的临床试验评价

以下实验中使用的正常人血清样品来自健康体检人群，病人血清样品来自正在服用利妥昔单抗药物的临床患者。

1、本发明试剂盒与商业化试剂盒的检测性能比较

分别使用实施例3制备的试剂盒P1、P2和P3和商业化试剂盒(Theradiag，货号LTR002-48)检测45例服用利妥昔单抗药物的病人血清样品，测试试剂盒的性能。检测方法参照实施例3中的试剂盒使用方法。检测结果如图4所示，试剂盒P2与商业化试剂盒的结果符合性最好，线性回归后R²＝0.9853，好于试剂盒P1和试剂盒P3。试剂盒P1和P3与商业化试剂盒的线性回归系数分别为0.8657和0.8843。

2、本发明试剂盒的特异性验证

用实施例3制备的试剂盒P2对100例正常人血清样品进行检测，测试试剂盒的特异性。检测结果如表3所示，100例正常人血清样品中，99个样品中利妥昔单抗的血药浓度小于30ng/mL，为未检出状态；只有1个样品中利妥昔单抗的血药浓度为42ng/ml，属于弱阳性样本。

本发明试剂盒的特异性高达99％。

序列表

<110> 江西省人民医院

<120> 用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒

<130> P200867-JXR

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Ala Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Cys Trp

1 5 10 15

Trp Glu Trp Thr Ile Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Trp Pro Thr Trp

20 25 30

Leu Glu

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Trp Trp Glu Trp Thr Ile Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ala

1 5 10 15

Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Trp Pro Thr Trp

20 25 30

Leu Glu

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Ala Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Trp Pro

1 5 10 15

Thr Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Trp Trp Glu Trp Thr Ile

20 25 30

Gly Cys

<210> 4

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcgcgctga tgattgcgaa cagctgcggc ggcggcggca gctgctggtg ggaatggacc 60

attggctgcg gcggcggcgg cagctggccg acatggctgg aa 102

<210> 5

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgctggtggg aatggaccat tggctgcggc ggcggcggca gctgcgcgct gatgattgcg 60

aacagctgcg gcggcggcgg cagctggccg acatggctgg aa 102

<210> 6

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcgcgctga tgattgcgaa cagctgcggc ggcggcggca gctggccgac atggctggaa 60

ggcggcggcg gcagctgctg gtgggaatgg accattggct gc 102

<210> 7

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcct gcgcgctgat gattgcgaac agctgcggcg gcggcggcag ctgctggtgg 60

gaatggacca ttggctgcgg cggcggcggc agctggccga catggctgga agcggccgct 120

aaactat 127

<210> 8

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcggatcct gctggtggga atggaccatt ggctgcggcg gcggcggcag ctgcgcgctg 60

atgattgcga acagctgcgg cggcggcggc agctggccga catggctgga agcggccgct 120

aaactat 127

<210> 9

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcggatcct gcgcgctgat gattgcgaac agctgcggcg gcggcggcag ctggccgaca 60

tggctggaag gcggcggcgg cagctgctgg tgggaatgga ccattggctg cgcggccgct 120

aaactat 127

<210> 10

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly

210 215 220

Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Cys Ala Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Cys Trp Trp Glu Trp Thr Ile Gly Cys Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Trp Pro Thr Trp Leu Glu Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile

260 265 270

Val Thr Asp

275

<210> 11

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly

210 215 220

Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Cys Trp Trp Glu Trp Thr Ile Gly Cys

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ala Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Trp Pro Thr Trp Leu Glu Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile

260 265 270

Val Thr Asp

275

<210> 12

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly

210 215 220

Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Cys Ala Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Trp Pro Thr Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Cys Trp Trp Glu Trp Thr Ile Gly Cys Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile

260 265 270

Val Thr Asp

275

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Cys Ala Leu Met Ile Ala Asn Ser Cys

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Cys Trp Trp Glu Trp Thr Ile Gly Cys

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Trp Pro Thr Trp Leu Glu

1 5

Claims

1.用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原，其特征在于，所述人工抗原包含SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原，其特征在于，所述人工抗原还包含标签序列。

3.根据权利要求2所述的用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原，其特征在于，所述人工抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

4.编码权利要求1所述的用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因包含SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

6.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述的用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述人工抗原包被在酶标板上，其包被浓度为0.05～0.25μg/mL。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含酶标二抗、样品稀释液、标准品、底物显色液、终止液和/或浓缩洗涤液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的鼠抗人IgG；所述标准品为30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和10000ng/ml的利妥昔单抗溶液；所述样品稀释液为含0.3M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L硫酸；所述浓缩洗涤液为pH 7.4，含0.05％(v/v)Proclin300、2.0％(v/v)吐温-20的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

10.权利要求1-3任一所述的用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：合成所述人工抗原的编码基因，构建表达载体，转化宿主菌后诱导蛋白表达。