CN112656696A - 一种分子马达脂质囊泡的组合物及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高分子马达的溶解性、长效性和促进吸收的作用的分子马达脂质囊泡的组合物及其制备方法、应用，分子马达脂质囊泡的组装结构为含有分子马达ATP合酶及其脂质双分子层，具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，亦称为囊泡，囊泡(niosolnes)过去亦称类脂质体，本发明的含分子马达的生物膜具有脂质双分子层结构，使其在化妆品领域应用时具有保湿、美白、抗衰老的作用，达到提高稳定性、提高分子马达的溶解性、长效性和促进吸收的作用，生产工艺简便，成本低廉，而且避免了因采用磷脂的脂质体需要纯化、易氧化降解等不足。

Description

一种分子马达脂质囊泡的组合物及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于生物和高分子材料领域，具体涉及一种提高分子马达的溶解性、长效性和促进药物或功效成分吸收的作用的分子马达脂质囊泡的组合物及其制备方法、应用。

背景技术

分子马达为由生物大分子构成，利用化学能进行机械做功的纳米***。通常是一类ATP合酶蛋白，是利用跨膜电化学梯度催化合成ATP的膜蛋白复合物家族，跨膜质子梯差驱使ATP合酶合成ATP。在生物体内，糖类和脂肪这些分解产物的小分子在线粒体中被氧化分解时可以释放出能量，这些能量绝大部分储存在一种叫做腺苷三磷酸(ATP)的分子内才能被生物利用。

分子马达同时也是一组跨膜蛋白，通常嵌入在线粒体、叶绿体以及细菌质膜上，而生物膜是生物最基本的结构与功能单位细胞，以脂质双分子层闭合囊泡为基本框架结构,其各层之间被水隔开,具有亲水和巯水性。ATP合酶(分子马达)是一种跨膜蛋白，它们的含量一般比较低且它们单独在存在时不稳定，容易结构变异失去活性，且其结构中存在疏水亚基，水溶性不太高，从而影响其使用。因此，通常在分子马达ATP合酶制备成带脂质囊泡，即带有类生物膜性的闭合结构或细胞区室的脂质结构有利于保持其活性及其使用。

将分子马达搭载脂双层膜已应用于作为药物的载体和传感器的研究，文献1ZL200410098929.9提及一种体外重构的分子马达脂质体，作为可调控分子马达微动力生物传感器。

天然存在的脂分子层膜，具有其他药物载体无法比拟的优势，比如红细胞膜应用于药物载体，由于具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且可以增加药物的稳定性、生物靶向性，延长药物的半衰期，并且具有缓释及减轻药物的毒副作用。此外，以磷脂和胆固醇为主的人工构建囊泡脂质体应用也较广泛。

然而传统双分子层膜，机械性能差，容易破碎，其寿命十分有限，在常温下，大多仅能维持几个小时(很少能超过8个小时)。并且其存在条件也十分苛刻，所以传统双分子层在实际应用中并没有多大进展。而人工的单纯磷脂双分子层脂质体,也称人工膜，同样不太稳定，均具有在体外易氧化、渗漏、储存性不好、易聚集沉淀等缺陷；在体内易被一些酶类物质降解和巨噬细胞吞噬而不能到达靶组织发挥有效作用等缺点，这些都限制了其应用。

发明内容

本发明的目的在于为了解决传统双分子层膜，机械性能差，容易破碎，寿命有限的缺陷而提供一种提高该脂质膜的稳定性和抗氧化性质，从而提升实际应用用途性能的分子马达脂质囊泡组合物。

本发明第二方面是为了提供该一种分子马达脂质囊泡的组合物的制备方法。

本发明第三方面还提供了由该种方法制备的分子马达脂质囊泡在化妆品领域的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种分子马达脂质囊泡组合物，所述组合物包括具有双分子层的分子马达脂质小体，带有电荷的聚合物，生物生长因子与抗氧化酶；

其中，带有电荷的聚合物，生物生长因子与抗氧化酶利用生物膜重构自组装嵌入双分子层脂质小体，该脂质小体嵌有分子马达。

本发明中，重组分子马达脂质囊泡的组装结构为含有分子马达ATP合酶及其脂质双分子层，具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，亦称为囊泡，囊泡(niosolnes)过去亦称类脂质体，是指由非离子表面活性剂(加或不加胆固醇)组成的、体内外性质与脂质体极其相似的一类载药***，而且避免了因采用磷脂的脂质体需要纯化、易氧化降解等不足。

ATP酶是天然存在的纳米尺度能量转换装置，也是抗逆性较为优秀的模型，本发明所得到的生物膜是完整的或者是片段的，形态上为呈脂质双分子层结构，其组成成分主要是脂质和F0F1-ATP酶、SOD(嗜热SOD)、带电荷的聚合物、生物生长因子等蛋白质，另有少量糖类通过共价键结合在脂质或蛋白质上。

本发明中，带电荷的聚合物分布在双分子层结构的表面，以电荷同性相斥的原理，使得分子马达脂质囊泡组合物之间可以远离开，从而避免了团聚而形成沉淀的问题；

在双分子层结构的表面嵌入嗜热SOD，SOD作为超氧化物歧化酶，用于防止分子马达脂质囊泡组合物被氧化；

生物生长因子，能对皮肤细胞提供靶向作用，并且能够促进皮肤伤口，提升表皮细胞活力。

根据本发明的一个实施例，所述带有电荷的聚氨基酸为带有负电荷的氨基酸聚合物；所述氨基酸聚合物包括聚谷氨酸或聚天冬氨酸中的一种。

根据本发明的一个实施例，所述带有电荷的聚氨基酸为带有正电荷的氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物包括聚组氨酸、聚赖氨酸或聚精氨酸中的一种。

根据本发明的一个实施例，所述带有电荷的聚合物为带有负电荷的多聚唾液酸、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖中的一种。

根据本发明的一个实施例，所述生物生长因子包括EGF、NGF、KGF中的一种。

根据本发明的一个实施例，所述抗氧化酶为嗜热菌制得的SOD。

根据本发明的一个实施例，所述的嗜热菌包括嗜热栖热菌、嗜热链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸链球菌、嗜热侧孢霉、嗜热链霉菌中的一种。

更优选地，本发明利用生物膜重构自组装嵌入氨基酸、生物生长因子及SOD。

最优选地，本发明利用生物膜重构自组装嵌入聚谷氨酸、生物生长因子及SOD。

根据本发明的一个实施例，所述生物生长因子包括EGF、NGF、KGF中的一种。

更优选地，本发明的生物生长因子选择KGF-2。

一种上述的分子马达脂质囊泡组合物的制备方法，所述制备方法的步骤为：

1)菌体收集；

2)菌体破碎：将步骤1)得到的菌体破碎得到细胞破碎液；

3)制备耐热SOD：将步骤2)得到的细胞破碎液离心，得到沉淀物A与上清液B；将沉淀物A用缓冲液B形成悬浮溶液，酶解反应后离心得到上清液溶液，冻干得到SOD粉末；

4)F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜的制备：取步骤3)得到的上清液B多次离心得到沉淀物B，制备得到F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜；

5)自组装膜材***准备：取带有电荷的聚合物、生物生长因子及步骤3)得到的SOD粉末溶于无水甲氨酰中，加入亚胺，在冰浴下磁力搅拌，将十八胺溶于DMF中，缓慢滴入上述溶液中，充氮，反应；反应结束后，依次用过量的水醇混合液和去离子水透析，水系膜过滤，干燥，得到复合物；

6)重组装分子马达膜制备：将步骤4)得到的F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜与步骤5)得到的复合物配合，溶解在氯仿中，再加入同体积的PBS溶液，水浴孵育，减压除去氯仿，得到重组装分子马达膜。

根据本发明的一个优选实施例，所述缓冲液A中包括以下原料：1-80mM tris.HCl、0.1-5.0mMβ-巯基乙醇，0.l-2mM EDTA、0.1-0.5M蔗糖与1-10mM MgCl₂；缓冲液B中包括以下原料：1-20mM tris.HCl，0.1-5.0mMβ-巯基乙醇与0.1-2mM EDTA。

一种分子马达脂质囊泡组合物的应用，上述的的分子马达脂质囊泡组合物在化妆品领域的应用。

本发明通过组装后，重组装分子马达膜有如下几个提升：

1)分子马达在脂质体作用下，提升分子马达的稳定性，并且该结构能在胞外环境下合成ATP，为细胞提供能量，提升细胞活力；

2)SOD(嗜热SOD)、聚谷氨酸：提升脂质囊泡的抗氧化力，防止脂质过氧化；

3)聚谷氨酸带大理负电，同性静电相斥，防止脂质凝聚沉淀；

4)KGF为角质细胞生长因子，能对皮肤细胞提供靶向作用，并且能够促进皮肤伤口，提升表皮细胞活力。

利用SOD、聚谷氨酸、KGF，将天然的分子马达脂质体双分层膜重构得到更加稳定、皮肤靶向的皮肤用途的分子马达生物膜，具体的方法是：通过生物菌破壁，制备具有双分子层的分子马达脂质小体，利用生物膜重构自组装的特点嵌入KGF、SOD(嗜热SOD)、聚谷氨酸，得到稳定、高效、靶向的重组分子马达脂质囊泡。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的重构自组装的分子马达囊泡，在脂质膜上含有ATP合成酶、抗氧化剂SOD、靶向的表皮生长因子KGF、以及提供抗凝聚的带负电的高效保湿剂聚谷氨酸(保湿能力是玻尿酸的4倍)，本发明制备的生物膜囊泡具有为细胞提供能量而提高细腻活力、靶向性地促进细胞生长和促伤口愈合、高效保湿、产品稳定等特点，本发明制备的生物膜囊泡具有脂质双分子层结构，使其在化妆品领域应用时具有保湿、美白、抗衰老的作用，达到提高稳定性、提高溶解性、长效性和促进吸收的作用。

附图说明

图1是本发明分子马达脂质囊泡组合物的示意图。

图中，1.分子马达脂质小体；2.生物生长因子；3.抗氧化酶；4.带有电荷的聚合物。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中所用的试剂均可从市场购得，所用的设备亦均可从市场购得。

参见图1，本发明提供了一种分子马达脂质囊泡组合物，所述组合物包括具有双分子层的分子马达脂质小体1，带有电荷的聚合物4，生物生长因子2与抗氧化酶3；

其中，带有电荷的聚合物，生物生长因子与抗氧化酶利用生物膜重构自组装嵌入双分子层脂质小体，该脂质小体嵌有分子马达。

本发明还提供了一种分子马达脂质囊泡的制备方法，所述制备方法的步骤为：

1)菌体收集；

步骤1)中所用的菌体包括嗜热栖热菌、嗜热链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸链球菌、嗜热侧孢霉、嗜热链霉菌中的一种。

优选地，所述嗜热菌为嗜热栖热菌。

2)菌体破碎：将步骤1)得到的菌体破碎得到细胞破碎液；

步骤2)中所用的菌体破碎可以采用机械法，例如：高压匀浆破碎法，振荡珠击破碎法，高速搅拌珠研磨破碎法，超声波破碎法，撞击破碎法；或者采用非机械法，例如渗透压冲击破碎法，冻融破碎法，酶溶破碎法，化学破碎法。

本发明中为了提高提升脂质囊泡的抗氧化力，防止脂质过氧化，采用了具有超氧化物歧化酶SOD。

3)制备耐热SOD：将步骤2)得到的细胞破碎液离心，得到沉淀物A与上清液B；将沉淀物A用缓冲液B形成悬浮溶液，反应后离心得到上清液溶液，冻干得到SOD粉末；

4)F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜的制备：取步骤3)得到的上清液B多次离心得到沉淀物B，制备得到F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜；

5)自组装膜材***准备：取带电荷的聚合物、生物生长因子及步骤3)得到的SOD粉末、溶于无水甲氨酰中，加入亚胺，在冰浴下磁力搅拌，将十八胺溶于DMF中，缓慢滴入上述溶液中，充氮，反应；反应结束后，依次用过量的水醇混合液和去离子水透析，水系膜过滤，干燥，得到复合物；

根据本发明的一个实施例，所述带有电荷的聚氨基酸为带有负电荷的氨基酸聚合物；所述氨基酸聚合物包括聚谷氨酸或聚天冬氨酸中的一种。

根据本发明的一个实施例，所述带有电荷的聚氨基酸为带有正电荷的氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物包括聚组氨酸、聚赖氨酸或聚精氨酸中的一种。

根据本发明的一个实施例，所述带有电荷的聚合物为带有负电荷的多聚唾液酸、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖中的一种。

更优选地，所述带有电荷的聚合物为聚谷氨酸。

根据本发明的一个实施例，所述生物生长因子包括EGF、NGF、KGF中的一种。

更优选地，本发明的生物生长因子选择KGF-2。

根据本发明的一个实施例，所述抗氧化酶为嗜热菌制得的SOD。

根据本发明的一个实施例，所述的嗜热菌包括嗜热栖热菌、嗜热链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸链球菌、嗜热侧孢霉、嗜热链霉菌中的一种。

6)重组装分子马达膜制备：将步骤4)得到的F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜与步骤5)得到的复合物配合，溶解在氯仿中，再加入同体积的PBS溶液，旋转蒸发仪水浴孵育，减压除去氯仿，得到重组装分子马达膜。

本发明分子马达生物膜具有脂质双分子层结构，使其在化妆品领域应用时具有保湿、美白、抗衰老的作用，达到提高稳定性、提高溶解性、长效性和促进吸收的作用。

实施例1

本实施例提供了一种分子马达脂质囊泡的制备方法，其制备方法包括：

1)菌体收集：把嗜热链球菌接入培养基中，于75℃培养至对数生长期后期，收集菌体；

2)菌体的破碎：在步骤1)所获得的菌体经-80℃冷冻保存后，取500g菌体放入1升缓冲液(80mM tris.HCl，PH8.0，其中含1.0mMβ-巯基乙醇，0.lmM EDTA 0.25M蔗糖，4mMMgCl₂)的溶液悬浮,用超声波处理菌液以达到破碎；

3)离心，制备耐热SOD：将细胞破碎液高速(20000g)离心30min，得到沉淀物A及上清液B。将沉淀物A用500mL缓冲液(15mM tris.HCl，PH7.6，其中含1.0mMβ-巯基乙醇，0.lmMEDTA)在中加入20M MgCl₂溶液8mL和DNaseI 10mg，置室温条件下反应30分钟,让DNase分解DNA后,经8500rpm离心，得上清液(即为SOD溶液)，冻干，即为SOD；

4)分子马达脂质小体生物膜制备：采用差速离心法制备，取上清液B，在4℃下经8500rpm离心，取上清液C，在180000×g,4℃下，超速度离心90min；取下部沉淀，用10倍的0.1M的PBS缓冲溶液稀释，用Percoll层液在50000×g,4℃下离心，吸取下层，即为F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜；

5)自组装膜材***料准备：取步骤3)得到的SOD粉20mg，KGF-2 2μg，聚谷氨酸100mg溶于10mL无水甲氨酰中，加入100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和80mg的N-羟基琥珀酰亚胺，在冰浴下磁力搅拌2小时，取72mg十八胺溶于5mLDMF,缓慢滴入聚谷氨酸上述溶液中，充氮，30℃反应28H.反结束后，装入透析袋(截留分子量3500)，过量的水醇混合液依次透析1天，去离子水透析1天，0.45μm水系膜过滤，干燥，得到聚谷氨酸复合物；

6)重组装分子马达膜制备：采用逆相蒸发法重组装分子马达生物膜，将步骤4)中得到的分子马达生物膜与步骤5)中得到的聚谷氨酸复合物2：1配合，再溶解在4倍体积的氯仿中，再加入同体积的PBS溶液，在旋转蒸发仪上，50℃，80rpm，水浴孵育20min，减压除去氯仿，即为重组装分子马达膜。

实施例2

本实施例与实施例1相同，唯一不同之处在于，用多聚赖氨酸替代聚谷氨酸。

实施例3

本实施例与实施例1相同，唯一不同之处在于，用生长因子EGF替代KGF。

对比例1

使用常规方法制得脂质体，其中，磷脂与胆固醇的质量比为5:1。

对实施例1-3的分子马达脂质体与对比例1的脂质体进行测试，结果见表1。

表1.测试结果

由表1可见，本发明实施例1-3制备得到的分子马达脂质体的稳定性和抗氧化性质均优于对比例1的脂质体，这是由于分子马达在脂质体作用下，提升分子马达的稳定性，并且该结构能在胞外环境下合成ATP，为细胞提供能量，提升细胞活力，SOD(嗜热SOD)、聚谷氨酸：提升脂质囊泡的抗氧化力，防止脂质过氧化，聚谷氨酸带大理负电，同性静电相斥，防止脂质凝聚沉淀，因此本发明的含分子马达的生物膜具有脂质双分子层结构，使其在化妆品领域应用时具有保湿、美白、抗衰老的作用，达到提高稳定性、提高分子马达的溶解性、长效性和促进吸收的作用。

实施例4

化妆品添加剂有益效果(保湿)

(1)随机挑选十人，每人在左右手背正中挑选10cm×10cm的位置，任意一边的手涂抹实施例1中获得的复溶于500μL体积PBS中的重组装分子马达膜，一边涂抹同体积的PBS作为对照；

(2)两只手相同位置连续涂抹两周后，用皮肤水份测试仪测试两边皮肤的含水量；

(3)结果显示，涂抹重组装分子马达膜的手背平均皮肤含水量为51％，涂抹PBS的手背平均皮肤含水量为43％，重组装分子马达膜作为化妆品添加剂能有效的进行皮肤保湿。

实施例5

化妆品添加剂有益效果(美白)

(1)以0.5mmol/L L-DOPA为底物，在1mL 0.05mol/L磷酸缓冲液的测活体系中，先加20μL实施例1中获得的重组装分子马达膜(溶于DMSO溶液)于1.5mL的梨形管中，再加400μL预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，用缓冲溶液将体积补充到970μL，然后加30μL酪氨酸酶水溶液，立刻混匀，以PBS为对照，在30℃恒温下测定1min内波长为475nm时的吸光值随时间的增长直线，从直线斜率求得酶活力；

(2)结果表明，重组装分子马达膜对酪氨酸酶的抑制活性为39％，而对照组的酪氨酸酶的抑制活性几乎不明显，重组装分子马达膜作为化妆品添加剂能有效的促进美白。

实施例6

化妆品添加剂有益效果(抗衰老)

(1)随机挑选四十五岁至五十五岁年龄段十人，每人在左右手背正中挑选10cm×10cm的位置，任意一边的手涂抹实施例1中获得的复溶于500μL体积PBS中的重组装分子马达膜，一边涂抹同体积的PBS作为对照；

(2)两只手相同位置连续涂抹四周后，用皮肤弹性测试仪测试两边皮肤的抗衰老状况；

(3)结果显示，涂抹重组装分子马达膜的手背平均皮肤弹性为35％，涂抹PBS的手背平均皮肤弹性为27％，重组装分子马达膜作为化妆品添加剂能有效的抗衰老。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分子马达脂质囊泡组合物，其特征在于，所述组合物包括具有双分子层的分子马达质小体，带有电荷的聚合物，生物生长因子与抗氧化酶；

其中，带有电荷的聚合物，生物生长因子与抗氧化酶利用生物膜重构自组装嵌入双分子层脂质小体，该脂质小体嵌有分子马达。

2.根据权利要求1所述的一种分子马达脂质囊泡组合物，其特征在于，所述带有电荷的聚氨基酸为带有负电荷的氨基酸聚合物；所述氨基酸聚合物包括聚谷氨酸或聚天冬氨酸中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种分子马达脂质囊泡组合物，其特征在于，所述带有电荷的聚氨基酸为带有正电荷的氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物包括聚组氨酸、聚赖氨酸或聚精氨酸中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种分子马达脂质囊泡组合物，其特征在于，所述带有电荷的聚合物为带有负电荷的多聚唾液酸、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种分子马达脂质囊泡组合物，其特征在于，所述生物生长因子包括EGF、NGF、KGF中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种分子马达脂质囊泡组合物，其特征在于，所述抗氧化酶为嗜热菌制得的SOD。

7.根据权利要求6所述的一种分子马达脂质囊泡组合物，其特征在于，所述的嗜热菌包括嗜热栖热菌、嗜热链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热乳酸链球菌、嗜热侧孢霉、嗜热链霉菌中的一种。

8.一种如权利要求1所述的分子马达脂质囊泡组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤为：

1)菌体收集；

2)菌体破碎：将步骤1)得到的菌体破碎得到细胞破碎液；

3)制备耐热SOD：将步骤2)得到的细胞破碎液离心，得到沉淀物A与上清液B；将沉淀物A用缓冲液B形成悬浮溶液，并加入MgCl₂溶液与DNaseI，反应后离心得到上清液溶液，冻干得到SOD粉末；

4)F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜的制备：取步骤3)得到的上清液B多次离心得到沉淀物B，制备得到F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜；

5)自组装膜材***准备：取带有电荷的聚合物、生物生长因子及步骤3)得到的SOD粉末溶于无水甲氨酰中，加入亚胺，在冰浴下磁力搅拌，将十八胺溶于DMF中，缓慢滴入上述溶液中，充氮，反应；反应结束后，依次用过量的水醇混合液和去离子水透析，水系膜过滤，干燥，得到复合物；

6)重组装分子马达膜制备：将步骤4)得到的F0F1-ATP酶分子马达脂质小体生物膜与步骤5)得到的复合物配合，溶解在氯仿中，再加入同体积的PBS溶液，水浴孵育，减压除去氯仿，得到重组装分子马达膜。

9.根据权利要求8所述的一种分子马达脂质囊泡组合物的制备方法，其特征在于，所述缓冲液A中包括以下原料：1-80mM tris.HCl、0.1-5.0mMβ-巯基乙醇，0.l-2mM EDTA、0.1-0.5M蔗糖与1-10mM MgCl₂；缓冲液B中包括以下原料：1-20mM tris.HCl，0.1-5.0mMβ-巯基乙醇与0.1-2mM EDTA。

10.一种分子马达脂质囊泡组合物的应用，其特征在于，权利要求1-9任一项所述的分子马达脂质囊泡在化妆品领域的应用。

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