CN112630438A - 抗体组合物及其筛查髓系疾病及检测免疫检查点的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗体组合物及其筛查髓系疾病及检测免疫检查点的应用。所述抗体组合物包括抗CD15抗体、抗CD96抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD117抗体、抗CD9抗体、抗CD45抗体、抗CD38抗体、抗HLA‑DR抗体、抗CD13抗体、抗CD19抗体、抗CD4抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体、抗CD371抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD200抗体、抗CD14抗体、抗CD56抗体、抗CD71抗体、抗CD2抗体、抗CD123抗体和抗CD64抗体。本发明的抗体组合物可应用于筛查髓系疾病及检测免疫检查点。

Description

抗体组合物及其筛查髓系疾病及检测免疫检查点的应用
技术领域
本发明涉及一种抗体组合物及筛查髓系疾病及检测免疫检查点的应用，具体包括一种含有24种抗体的组合物及其在揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能及免疫检查点检测中的应用，属于血液病检测技术领域。
背景技术
髓系肿瘤是一组复杂的疾病，根据原始细胞的比例以及恶性克隆累及的亚系别、增殖为主还是病态造血为主，甚至发病的原因和遗传学因素，分为骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）、骨髓增生异常/增殖性肿瘤（Myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms，MDS/MPN）、急性髓系白血病（acute myeloid leukaemia, AML），以及一些根据病史和遗传学特殊分类的髓系肿瘤。根据流行病学的统计，中国白血病的自然发病率为3/10万～4/10万，其他髓系肿瘤发病率总计10万分之10以上，并且随着人均寿命的延长以及环境污染等因素，发病率有逐渐升高的趋势。急性髓系白血病（acute myeloid leukaemia, AML）是一种常见的血液***恶性肿瘤，占成人急性白血病的60%~70%。目前成人AML的完全缓解率60%~85%，但是传统的化疗和造血干细胞移植治疗，仍旧不能获得满意的长期生存，5年长期生存在30%～40%左右。MDS等其他髓系肿瘤缓解率和生存率更差，5年生存率只有10%。近年随着医学的进步，有一些新的诊疗策略应用于AML。如一些靶向小分子药物在临床试验中也取得了振奋人心的效果，而以嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptors T cell，CAR-T）和 抗体性药物如抗CD33药物SGN-CD33A 为代表的免疫治疗为急性髓系白血病的治疗研究提供了全新的思路。然而，尽管各种新的治疗方法层出不穷，迄今为止效果还是极为有限，远远比不上CD19-CAR-T 为代表的细胞免疫治疗在淋巴***肿瘤尤其是急性B淋巴细胞白血病中的效果。另一方面，髓系肿瘤因为其复杂性、白血病相关免疫表型的多样性、每种异常的低覆盖性、治疗后抗原改变的概率高等原因，微小残留病变检测的灵敏度和特异性也远远比不上急性T淋巴细胞和B淋巴细胞白血病。
免疫检查点是近年来新提出来的另外一种观点，机理是人体每时每刻都在发生基因突变和细胞恶变，治疗后缓解的患者，其实体内也存在微量的现有技术难以检测出来的肿瘤细胞，但是机体免疫细胞可以有效清除这些异常细胞因素。而机体免疫状态改变的时候，就会出现肿瘤的发病、进展和复发，免疫检查点的检测和调控，将有利于深入揭示肿瘤的发生发展机理，通过增强抗肿瘤免疫、减少免疫抑制，与化疗和靶向治疗联合治疗，是目前被广泛看好的一种治疗趋势。CD200、CD96是继PD1之后最近提出来的新的免疫检查点受体靶位，TIGIT/CD96与共刺激受体 CD226共同形成了类似CD28/CTLA-4 途径的传导通路，虽然TIGIT/CD96作为免疫检查点在T细胞和NK细胞生物学中的作用刚刚开始被认识到，之前已经报道CD96是一个高度灵敏和特异性的MRD标志，因此将其纳入方案，可以同时监测肿瘤细胞的CD96表达作为MRD指标，和T、NK细胞的CD96表达作为免疫检查点指标。CD200-CD200R在调节肿瘤微环境中起重要作用，同时也是一个MRD指标。
肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源，但是因为比例极低很难在常规方案中纳入。此外，髓系有很多种亚群，弱势亚群如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞等，比例低并且需要多种标志识别的弱势亚群，往往被忽略，而这些细胞在髓系肿瘤发病中的作用也需要进一步探索。肿瘤干细胞理论虽然从三十年前提出，但是长期以来常规方法很难同时监测这些低比例细胞群，故很难纳入临床检测。
因此急需一种复杂的、覆盖标志全面的、尤其是能够同时监测多种细胞的表达以及协同作用的技术。
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种能够对单个细胞实现定量分析的检测手段，具有快速、高精度、多参数等优点，是目前最先进的细胞定量分析方法之一。FCM在诊断学和治疗学领域发挥着越来越重要的作用，尤其是近年来CAR-T为代表的靶向治疗和免疫治疗的兴起，免疫与肿瘤相互关系的学说在肿瘤学领域的广泛应用，目前FCM不但是白血病、淋巴瘤等恶性疾病临床诊断的金标准，更是深入探索机制、寻找新疗法、新理论的不可或缺甚至是唯一可以快速实现目的的技术手段。
经查，目前尚未有关于FCM技术同时检测髓系肿瘤、肿瘤干细胞、弱势细胞群、免疫功能、免疫检查点的方案报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种将FCM同时应用于肿瘤与免疫的新技术。
本发明的一个方面提供了一种抗体组合物，其包括以下抗体：
抗CD15抗体、抗CD96抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD117抗体、抗CD9抗体、抗CD45抗体、抗CD38抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD13抗体、抗CD19抗体、抗CD4抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体、抗CD371抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD200抗体、抗CD14抗体、抗CD56抗体、抗CD71抗体、抗CD2抗体、抗CD123抗体和抗CD64抗体。
本发明的抗体组合物，可应用于流式细胞术筛查髓系疾病及检测免疫检查点。
本发明中，除明确说明外，所述的筛查髓系疾病及检测免疫检查点包括：揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、弱势细胞群研究、靶向治疗靶点筛查、免疫功能检测、免疫检查点检测。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物中，各抗体均为单克隆抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物中，各抗体均为荧光素标记的抗体。优选地，抗CD15抗体、抗CD96抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD117抗体、抗CD9抗体、抗CD45抗体、抗CD38抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD13抗体、抗CD19抗体、抗CD4抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体、抗CD371抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD200抗体、抗CD14抗体、抗CD56抗体、抗CD71抗体、抗CD2抗体、抗CD123抗体、抗CD64抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PE-Dazzle594、PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PerCP、PerCP-eFluor、APC、APC-Cy7、BV421、AF532、BV605、BV480、BB515、AF700、BV570、AF647、Pacific Blue、BV750、BV650、BV510、BV785、BV711。本发明中通过对不同抗体搭配特定的荧光素，可以使得本发明的抗体组合物应用于流式细胞术筛查髓系疾病及检测免疫检查点时，各通道的所有荧光素都能达到优异的染色效果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物中，各抗体组分均可商购获得。各抗体应符合相关行业标准要求。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物为抗CD15抗体、抗CD96抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD117抗体、抗CD9抗体、抗CD45抗体、抗CD38抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD13抗体、抗CD19抗体、抗CD4抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体、抗CD371抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD200抗体、抗CD14抗体、抗CD56抗体、抗CD71抗体、抗CD2抗体、抗CD123抗体、抗CD64抗体按照以下体积比混合（在效价基本相当的情况下）的混合物：
抗CD15抗体 1，
抗CD96抗体 2.5，
抗CD33抗体 5，
抗CD34抗体 3.5，
抗CD117抗体 1.5，
抗CD9抗体 7，
抗CD45抗体 20，
抗CD38抗体 1.5，
抗HLA-DR抗体 1，
抗CD13抗体 2，
抗CD19抗体 1，
抗CD4抗体 3，
抗CD36抗体 0.5，
抗CD7抗体 1.5，
抗CD371抗体 0.3，
抗CD11c抗体 5，
抗CD11b抗体 1，
抗CD200抗体 5，
抗CD14抗体 1，
抗CD56抗体 2.5，
抗CD71抗体 0.25，
抗CD2抗体 1.5，
抗CD123抗体 2，
抗CD64抗体 1.5。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，其包括第一容器，第一容器容置本发明所述的抗体组合物。本发明的试剂盒可应用于流式细胞术筛查髓系疾病及检测免疫检查点。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒还可以包括其他用于应用于流式细胞术筛查髓系疾病及检测免疫检查点的试剂和耗材，例如还可包括：红细胞裂解液、缓冲液、与流式细胞仪配套使用的流式管中的一种或多种。这些试剂和耗材均可商购获得。优选本发明所提供的试剂盒还包括第二容器、第三容器等，分别用于容置红细胞裂解液、缓冲液等。
本发明的另一方面还提供了本发明所提供的抗体组合物在制备用于揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的试剂盒中的应用。
优选在本发明的应用中，揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的过程包括：
（1）将待测样本加入到流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×106/管- 1×107/管；所述待测样本为骨髓或外周血；
（2）将步骤（1）处理得到的样本，与本发明所述抗体组合物混匀后，室温避光孵育；
（3）向步骤（2）孵育后的流式管中加入1×溶血素，室温避光孵育；
（4）将步骤（3）孵育后的流式管离心去上清；
（5）向步骤（4）流式管中加入PBS缓冲液混匀，离心去上清，用PBS缓冲液重悬细胞；
（6）对步骤（5）重悬细胞进行流式细胞上机检测，分析结果。
根据本发明的具体实施方案，除本发明的抗体组合物外，其余各试剂的用量可参照本领域现有技术的常规用量或是按照商家的推荐剂量。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物的加入量为50-100μl/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（1）中，每管样本量体积通常不超过160μl。
根据本发明的具体实施方案，步骤（2）中，孵育10-30分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（3）中，孵育5-20分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（4）中，离心条件可为300-450g离心5-10分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（4）中，离心前加入的PBS缓冲液（洗涤用）的加入量为2-3ml/管，重悬用PBS缓冲液的加入量为0.5-1ml/管。
本发明的另一方面还提供了一种用于揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的装置，该装置包括检测单元和分析单元，其中：
所述检测单元包括用于通过流式细胞术检测待测个体骨髓或外周血样本的试剂材料，获得样本的检测结果；所述试剂材料包括本发明所述的抗体组合物；
所述分析单元用于分析检测单元的检测结果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的装置中，通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：
利用本发明所述的抗体组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品（具体处理过程可参照前述记载）；进行流式细胞上机检测。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的装置中，其中流式细胞上机检测时按照以下方式设门分析：
设置P1门去除黏连细胞；
P1门内细胞设置活细胞门P2门；
单个活细胞门P2门内，同时进行多种设门，检测多群细胞的表达情况：
P2门内，CD45/SSC设门检测淋巴细胞、单核细胞、分化阶段粒细胞、有核红细胞、嗜酸性粒细胞；
P2门内，使用CD117/SSC、CD34/SSC设置不成熟髓细胞门，检测分析髓系幼稚细胞的分化过程；
P2门内检测弱势细胞群：设置HLA-DR/CD123二维点图检测浆样树突状细胞与嗜碱性粒细胞、设置CD117/SSC二维点图检测肥大细胞、设置CD45/SSC二维点图检测嗜酸性粒细胞、设置CD13/CD11c二维点图并结合HLA-DR检测髓样树突状细胞；
P2门内，CD19/SSC设B细胞门，检测B细胞发育；
P2门内，使用CD7/SSC设置T细胞和NK细胞门；CD7阳性的T细胞和NK细胞门内再进行以下检测：检测CD56表达情况以检测调节性NK细胞、杀伤性NK细胞、T细胞；CD56-/CD7+T细胞门内再进行以下检测：检测CD4表达情况以检测CD4+T细胞、CD4-T细胞、活化T细胞；
其中流式细胞上机检测时选择性还进一步包括：进行两个以上个体的样本的检测，以筛查免疫检查点和/或髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点；其中：
筛查免疫检查点包括：P2门内CD117/SSC设门或CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC设门检测髓系原始细胞，以及在P2门内CD7/SSC设置T细胞和NK细胞门内检测NK细胞、T细胞的CD96、CD200表达情况，筛查免疫检查点；
筛查髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点包括：P2门内CD117/SSC设门或CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC设门检测髓系肿瘤细胞表达，并统计恶性表达标志出现概率，筛查髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的用于揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的装置中，其中流式细胞上机检测时按照以下方式设门分析：
（1）设置P1门去除黏连细胞；
（2）P1门内细胞设置活细胞门（P2门）；
（3）单个活细胞门（P2门）内，同时进行多种设门，检测多群细胞的表达情况：
① P2门内，CD45/SSC设门设置淋巴细胞（lym）、单核细胞（mono）、分化阶段粒细胞（gra）、有核红细胞（P14）门、嗜酸性粒细胞（eo）；可以检测分析上述各群细胞表达的标志。
② P2门内，同时使用CD117/SSC、CD34/SSC设置不成熟髓细胞门，检测髓系幼稚细胞的分化过程；MRD主要两种方法进行方案设计和结果判断： 白血病相关免疫表型（leukemia associated immunophenotyping，LAIP），即肿瘤细胞异常获得正常不表达的标志或者丢失正常表达标志；与正常差异性表达（Different-from Normal，DFN），该过程可以设计合理方案让几个正常表达抗原组成发育模式，如果与正常该阶段细胞相比，待测标本这些抗原表达强度或者组成模式发生改变，为DFN。本发明中，具体可按照以下方式的至少一种进行判断：
在髓系肿瘤时，检测分析恶性髓系原始细胞可能出现的异常：如常见的伴系表达（即恶性髓系幼稚细胞表达了正常不应该表达的淋系标志：CD7、CD56、CD19、CD2、CD9、CD4等是常见的AML窜系表达标志）、早期标志与分化标志异时相共表达（髓系细胞从原始到成熟阶段的发育过程遵循特定的规律，某一阶段表达特定的标志，随着发育成熟，早期标志消失发育阶段标志出现并达到一定强度，如果这种关系发生紊乱，提示恶性：如早期标志CD34、CD117与发育和成熟阶段标志如CD15、CD11b、CD64、CD11c、CD14、CD36等共表达）、正常髓系原始细胞表达标志荧光强度改变以及导致的相应组合发育模式改变（正常髓细胞各个阶段表达标志如CD45、CD117、CD34、CD33、CD13、HLA-DR、CD38、CD123、CD200、CD371、CD71等，不但有正常的顺序性，强度也有顺序性变化，髓系肿瘤经常会出现正常表达标志强度的改变，如增强、减弱或者丢失，从而导致CD117阳性细胞门内的组合：CD34/CD117、CD34/CD33、CD33/CD13、CD34/CD13、CD34/CD38、CD34/CD123、CD34/HLA-DR、CD34/CD371、CD34/CD200等两两标志构成的发育模式发生改变）、异常获得其他标志（如正常髓系原始细胞不表达CD96，获得为异常）等。
上述检测分析的组合中，CD38-/CD34+为最早期髓系干细胞，该群细胞在正常情况下是髓系干细胞，髓系肿瘤时可能为肿瘤干细胞。比例虽然低，但是可能是肿瘤复发的根源，因此需要重视。
③ P2门内检测下述弱势克隆：
设置HLA-DR/CD123二维点图， HLA-DR+/CD123bri细胞群为浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，PDC），HLA-DR-/CD123bri为嗜碱性粒细胞(basophil,baso)。
CD117/SSC二维点图中，CD117bri的为肥大细胞。
CD45/SSC二维点图中，CD45bri/SSC大的为嗜酸性粒细胞(eosinophil, eo)。
设置CD13/CD11c二维点图，两个标志均强表达，结合HLA-DR阳性，判断为髓样树突状细胞（myeloid dendritic cell，MDC）。
④ P2门内，CD19/SSC设B细胞门，检测B细胞发育，B细胞门内表达CD9/CD38/CD45弱表达的为早期B细胞，根据正常B细胞从幼稚到成熟遵循一定的规律，即CD45、CD19表达逐渐增强，CD9、CD38同步减弱消失，SSC先减小再增大的延续性过程，可以大致判断是否存在正常增生的B祖细胞，还是恶性幼稚B细胞克隆。虽然大多数肿瘤是一个系别，但是<5%的急性白血病是混合白血病，此外，慢性粒细胞白血病在加速急变期也可能为B系加速急变。而正常增生的B系祖细胞是骨髓增生良好的一个标志，骨髓增生异常综合征等髓系肿瘤因为骨髓增生受抑制，可能会出现B系祖细胞减少。
⑤ P2门内，使用CD7/SSC设置T和NK细胞门，CD7阳性的T和NK细胞门内再进行下述区分：
通过CD56表达的情况，分为三群细胞：CD56bri 调节性NK细胞；CD56dim杀伤性NK细胞；CD56-/CD7+为T细胞。
CD56-/CD7+T细胞门内，再进行下述区分：根据CD4表达可以将CD56-CD7+T细胞又区分为CD4+T细胞和CD4-（主要为CD8+）T细胞；CD56-/CD7+的T细胞门内，表达CD38+/HLA-DR+的为活化T细胞。
（4）个体检测后，进行两个以上个体（或群体）样本的共同检测分析：筛查免疫检查点的统计和髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点。
免疫检查点的检测：检测上述（3）②中CD117/SSC设门（CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC设门）的髓系原始细胞以及（3）⑤中各群NK、T细胞的CD96、CD200表达情况。在本发明的一些具体实施方案中，对22例正常标本和42例髓系肿瘤标本进行研究，发现CD96作为免疫检查点，于正常标本相比，髓系肿瘤患者标本中，多种细胞群存在表达差异：CD56dim的杀伤性NK细胞CD96表达增强、CD56bri的调节性NK细胞CD96表达减弱，以及恶性髓系原始细胞的CD96表达增强有显著性差异（P值分别为0.007，0.023，0.000）。CD200作为免疫检查点，于正常标本相比，髓系肿瘤标本中，多种细胞群存在表达差异：T细胞、CD4+T细胞、CD38+/HLA-DR+的活化T细胞、CD56弱表达的杀伤性NK细胞、CD56强表达的调节性NK细胞，以及恶性髓系原始细胞，上述细胞群的CD200表达均明显增强，有显著性差异（P值分别为0.000，0.000，0.000, 0.000，0.020，0.000）。
靶向治疗的潜在靶点筛查：使用上述（3）②即CD117/SSC（在CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC）在检测每个患者的髓系肿瘤表达过程中，统计所有的检测患者，如果发现某个恶性表达标志在髓系肿瘤的患者中出现概率高（看CD117阳性的肿瘤细胞，如果CD117阴性使用CD34或者其他标志锁定），并且正常细胞表达少以及重要细胞不表达（通过（3）①中P2门内CD45/SSC设门检测分析的所有血细胞群的表达情况获得），则该标志最有希望成为髓系肿瘤靶向治疗的潜在靶点。在本发明过程中，在所有检测患者中，髓系肿瘤表达概率高的标志有CD13（90%）、CD33（98%）、CD34（90%）、CD117（96%）、CD38（100%）、HLA-DR（85%）、CD371（84%），但是只有CD38、CD34、CD117在其他细胞中表达少，而从重要性来说，CD34、CD117覆盖所有髓系早期细胞，而CD38有CD38阴性的早期细胞，所以CD38是本研究中选定的最有希望的髓系靶向治疗标志。
本发明的技术可以实现：（1）详细检测分析髓系各种亚群的发育模式。包括分化阶段粒细胞、单核细胞、有核红细胞、髓系原始细胞。（2）髓系原始细胞中又包括数十个组合的详细分化及表达模式。（3）同时检测分析髓系干细胞。同时检测正常干祖细胞和肿瘤干细胞。（4）同时检测分析多种弱势细胞群，研究其在肿瘤发生发展中的作用。（5）同时研究免疫功能，淋巴细胞亚群及B细胞发育。（6）筛查有希望的靶向治疗靶点。（7）同时进行免疫检查点检测，将肿瘤与免疫结合起来。
综上所述，本发明将髓系正常发育模式研究、肿瘤监测、靶点筛查、肿瘤干细胞研究、免疫检查点、淋巴细胞亚群、髓系弱势细胞群的研究结合起来，提出了一套完美的24色FCM解决方案，深入研究正常髓系发育，从而更加灵敏、特异性地发现异常，精确诊断，指导治疗，进行微小残留病（Minimal Residue Disease，MRD）检测随访疗效，筛查靶向治疗的有希望靶点和肿瘤干细胞，同时探索免疫功能、免疫检查点与肿瘤的相关性，如果广泛推广，有望同时解决长期困扰血液界和药物研发领域的多项难题，为攻克髓系肿瘤这个发病率最高、治疗和监测难度最大的肿瘤，提高髓系肿瘤的整体生存率产生深远影响。
附图说明
图1A和图1B显示正常骨髓标本，使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析，24种抗原构成的正常髓系发育以及主要细胞群的各种抗原表达情况。
图2显示正常骨髓标本，使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析正常髓系发育。其中，图片A为全部髓系发育模式，图片B为分化阶段粒细胞发育模式，图片C为单核细胞发育模式，图片D为有核红细胞的表达情况。
图3A、图3B和图3C显示正常骨髓标本使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析正常髓系幼稚细胞分化模式。其中使用CD117/SSC、CD34/SSC设置不成熟髓细胞门，使用数十个组合检测分析正常髓系幼稚细胞的分化过程。
图4A、图4B和图4C显示髓系肿瘤标本（AML治疗后MRD检测）使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析髓系肿瘤的恶性髓系幼稚细胞分化模式。
图5显示使用kaluza软件检测分析正常与恶性髓系干细胞。其中，图片A为正常对照的CD38-/CD34+最早期髓系干细胞，在原始细胞门中分布占比较低。图片B为髓系肿瘤患者标本，恶性髓系幼稚细胞CD38-/CD34+的肿瘤干细胞略增多。
图6A和图6B显示正常骨髓标本使用spectroflow软件分析多种标志组合，检测常规极少注意的弱势细胞群。
图7显示正常骨髓标本kaluza软件分析淋巴细胞免疫功能检测。
图8显示kaluza软件进行免疫检查点的检测。其中，图片A-图片F为正常骨髓标本，图片G-图片L为髓系肿瘤（AML MRD）标本。
图9显示正常和髓系肿瘤患者各群细胞免疫检查点CD96的表达差异。
图10显示正常和髓系肿瘤患者各群细胞免疫检查点CD200的表达差异。
图11A和图11B显示正常骨髓标本用flowjo和kaluza软件多维检测分析髓系原始细胞表达情况。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1 试剂的配制
本实施例使用的抗体组合为：
抗CD15-FITC抗体、抗CD96-PE抗体、抗CD33-PE-Dazzle594抗体、抗CD34-PE-Cyanine7抗体、抗-CD117-PE-Cy5抗体、抗CD9-PerCP-Cy5.5抗体、抗CD45-PerCP抗体、抗CD38-PerCP-eFluor710抗体、抗HLA-DR-APC 抗体、抗CD13 APC-Cy7抗体、抗CD19-BV421抗体、抗CD4-AF532抗体、抗CD36-BV605抗体、抗CD7-BV480抗体、抗CD371-BB515抗体、抗CD11c-AF700抗体、抗CD11b-BV570抗体、抗CD200-AF647抗体、抗CD14-Pacific Blue抗体、抗CD56-BV750抗体、抗CD71-BV650抗体、抗CD2-BV510抗体、抗CD123-BV785 抗体、抗CD64-BV711抗体，取以上24种单克隆抗体试剂按表1所述体积比混合装于第一容器中。
本实施例中的抗体为可商购获得，其中，CD15-FITC、CD96-PE 、CD9-PerCP-Cy5.5、CD45-PerCP、HLA-DR-APC、CD19-BV421、CD36-BV605、CD371-BB515、CD7-BV480为美国BectonDickinson公司产品；CD33-PE/Dazzle594、CD34-PE/Cyanine7、CD117-PE-Cy5、CD11c-AF700、CD11b-BV570、CD200-AF647、CD14-Pacific Blue、CD56-BV750、CD71-BV650、CD2-BV510、CD123-BV785、CD64-BV711为美国Biolegend公司抗体；CD38-PerCP-eFluor710和CD4-AF532为美国eBioscience公司产品；CD13-APC-Cy7为中国四正柏公司产品。
任选再配红细胞裂解液装于第二容器中，PBS缓冲液装于第三容器中，红细胞裂解液、PBS缓冲液为可商购获得，其中，细胞裂解液为美国Becton Dickinson公司产品，PBS缓冲液为Beckman Coulter公司产品。
实施例2 标本的处理
按照细胞计数结果，将肝素或EDTA抗凝的骨髓样本，加入到流式管1中，保证加入的细胞量约为2×106个，再按表1流式管中加入不同荧光素标记的24种胞膜单克隆抗体试剂，与细胞悬液充分混匀后常温避光孵育15分钟，加入3ml 1×溶血素，避光孵育10分钟裂解红细胞，1500rpm离心5分钟去上清后，加入3ml PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用0.5mlPBS缓冲液重悬细胞，即为处理好的标本，可供上机检测。
表1 抗体混合物及用量
Figure 582195DEST_PATH_IMAGE002
实施例3 标本的检测与分析
将实施例2处理好的标本，在美国cytek公司3激光38通道流式细胞仪上机检测，获取每管10万细胞后，使用多种流式软件分析数据：spectroflow、flowjo、kaluza。
其中流式细胞上机检测分析过程包括使用二维点图及降维图。
二维点图分析过程及检测分析指标：
（1）使用前向角光散射面积（forward scatter Area，FSC-A）和前向角光散射高度（forward scatter height，FSC-H）设置P1门，去除黏连细胞，P1门内为单个细胞。
（2）P1门内细胞使用FSC-A和侧向角光散射面积（side scatter area，SSC-A）设置活细胞门（P2门）。
（3）分析P2门内细胞，同时进行下述设门：
①P2门内，CD45/SSC设门设置淋巴细胞（lym）、单核细胞（mono）、分化阶段粒细胞（gra）、有核红细胞（P14）、嗜酸性粒细胞（eo）门，检测分析上述各群细胞表达的标志。正常病例检测分析粒细胞分化、单核细胞分化、有核红细胞分化模式，髓系肿瘤可能会出现上述三种细胞群之一或者更多细胞群的分化模式异常，以及其他检测标志的异常表达。CD38bri为浆细胞，CD45-/CD71bri/CD36+为有核红细胞。
②P2门内，同时使用CD117/SSC、CD34/SSC设置髓系幼稚细胞门，检测分析正常髓系幼稚细胞的分化过程；在髓系肿瘤时，检测分析恶性髓系幼稚细胞可能出现的各种异常：CD34/CD117的关系，异常表达淋系标志，异常表达成熟阶段标志，异常获得正常不表达的标志，正常表达标志荧光强度改变以及相关的组合表达模式改变等，这些是髓系肿瘤诊断依据，以及MRD监测依据。更具体地，如常见的伴系表达（即恶性髓系幼稚细胞表达了正常不应该表达的淋系标志：CD7、CD56、CD19、CD2、CD9、CD4等是常见的AML窜系表达标志）、早期标志与分化标志异时相共表达（髓系细胞从原始到成熟阶段的发育过程遵循特定的规律，某一阶段表达特定的标志，随着发育成熟，早期标志消失发育阶段标志出现并达到一定强度，如果这种关系发生紊乱，提示恶性：如早期标志CD34、CD117与发育和成熟阶段标志如CD15、CD11b、CD64、CD11c、CD14、CD36等共表达）、正常髓系原始细胞表达标志荧光强度改变以及导致的相应组合发育模式改变（正常髓细胞各个阶段表达标志如CD45、CD117、CD34、CD33、CD13、HLA-DR、CD38、CD123、CD200、CD371、CD71等，不但有正常的顺序性，强度也有顺序性变化，髓系肿瘤经常会出现正常表达标志强度的改变，如增强、减弱或者丢失，从而导致CD117阳性细胞门内的组合：CD34/CD117、CD34/CD33、CD33/CD13、CD34/CD13、CD34/CD38、CD34/CD123、CD34/HLA-DR、CD34/CD371、CD34/CD200等两两标志构成的发育模式发生改变）、异常获得其他标志（如正常髓系原始细胞不表达CD96，获得为异常）等。
同时可以检测分析CD117/SSC设门获得的髓系幼稚细胞门内，CD38-/CD34+为最早期髓系干细胞，髓系肿瘤患者的髓系原始细胞CD38-/CD34+常为肿瘤干细胞。
③同时在单个活细胞（P2）门内，检测常规极少注意的弱势细胞群：
设置HLA-DR/CD123二维点图，HLA-DR+/CD123bri细胞群为浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，PDC），HLA-DR-/CD123bri为嗜碱性粒细胞(basophil,baso)。
CD117/SSC二维点图中，CD117bri的为肥大细胞。
CD45/SSC二维点图中，CD45bri/SSC大的为嗜酸性粒细胞(eosinophil, eo)。
CD13/CD11c二维点图中，两个标志均强表达，结合HLA-DR阳性判断髓样树突状细胞（myeloid dendritic cell，MDC）。
④P2门内，CD19/SSC设B细胞门，检测B细胞发育，B细胞门内表达CD9/CD38/CD45弱表达的为早期B细胞，根据正常B细胞从幼稚到成熟遵循一定的规律，即CD45、CD19表达逐渐增强，CD9、CD38同步减弱消失，SSC先减小再增大的延续性过程，可以大致判断是否存在正常增生的B祖细胞，还是恶性幼稚B细胞克隆。虽然大多数肿瘤是一个系别，但是<5%的急性白血病是混合白血病，此外，慢性粒细胞白血病在加速急变期也可能为B系加速急变。而正常增生的B系祖细胞是骨髓增生良好的一个标志，骨髓增生异常综合征等髓系肿瘤因为骨髓增生受抑制，可能会出现B系祖细胞减少。
⑤P2门内，使用CD7/SSC设置T和NK细胞门，CD7阳性的T和NK细胞门内再进行下述区分：
通过CD56表达的情况，分为三群细胞：CD56bri 调节性NK细胞；CD56dim杀伤性NK细胞；CD56-/CD7+为T细胞。
CD56-/CD7+T细胞门内，再进行下述区分：根据CD4表达可以将CD56-CD7+T细胞又区分为CD4+T细胞和CD4-（主要为CD8+）T细胞；CD56-/CD7+的T细胞门内，表达CD38+/HLA-DR+的为活化T细胞。
（4）个体检测分析后，进行两个以上个体（或群体）的共同检测分析：免疫检查点的统计和髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点筛查。
免疫检查点的检测：检测分析上述（3）②中CD117/SSC设门（CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC设门）的髓系原始细胞以及（3）⑤中各群NK、T细胞的CD96、CD200表达情况。
靶向治疗的潜在靶点筛查：使用上述（3）②即CD117/SSC（在CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC）在检测每个患者的髓系肿瘤表达过程中，统计所有的检测患者，如果发现某个恶性表达标志在髓系肿瘤的患者中出现概率高（看CD117阳性的肿瘤细胞，如果CD117阴性使用CD34或者其他标志锁定），并且正常细胞表达少以及重要细胞不表达（通过（3）①中P2门内CD45/SSC设门检测分析的所有血细胞群的表达情况获得），则该标志最有希望成为髓系肿瘤靶向治疗的潜在靶点。
分析过程中，髓系异常的判断标准可参见表2。
表2 髓系异常的判断标准
Figure 968177DEST_PATH_IMAGE004
需要注意：①根据2017版WHO或者其他专业诊断标准（如2012年欧洲白血病工作组发布的共识）进行；②感染和应激状态骨髓，会出现髓细胞活化，表现为髓系原始、粒细胞、单核细胞均可能出现CD56表达上调，所以需要结合临床表现，包括并且注意正常值与背景；③模式改变包括发育阶段分布改变和/或抗原表达水平改变；④因为溶血素对红细胞影响，红系比例可能会低估；⑤下述原因影响粒细胞的判断如标本稀释、标本制备过程与储存不当（细胞凋亡时CD11b表达减低）、遗传学多态性、其他疾病（夜间阵发性睡眠性血红蛋白尿时，异常克隆会出现CD14表达丢失）。
髓系幼稚细胞的检测是髓系肿瘤诊断与治疗后监测的重点：常规使用CD117/SSC、CD34/SSC设置不成熟髓细胞门，检测分析正常髓系幼稚细胞的比例、分化过程、异常表达。如果髓系幼稚细胞比例明显升高，是判断髓系肿瘤极为重要的依据，正常情况下极少出现超过5%，但是感染、化疗后、G-CSF刺激后骨髓增殖可能出现髓系原始细胞比例升高，但是这些情况下，分化模式是正常的、延续性的。5-10%的髓系肿瘤不表达CD34和CD117，使用CD45/HLA-DR辅助判断。
髓系幼稚细胞门内，注意检测分析早期干细胞：CD38-/CD34+的最早期髓系干细胞，髓系原始细胞CD38-/CD34+常为肿瘤干细胞。多年来学者们普遍认为肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源。
靶向治疗的靶点筛查：在检测髓系肿瘤表达过程中，肿瘤细胞出现概率高、正常细胞表达少、重要细胞不表达的标志，则最有希望成为髓系肿瘤靶向治疗的潜在靶点。综合阳性率和正常细胞表达情况，本发明的研究可发现CD38是相对理想的靶点。其他标志物，包括目前国际上临床试验中的CD371、CD117、CD33、CD96、CD123都因为覆盖率偏低或者正常表达细胞过多或者重要细胞表达等因素，导致潜在副作用偏大等原因，前瞻性预测可能会在临床使用中遇到各种问题。
分析过程中，抗原表达阳性率情况参见表3。
表3 抗原表达阳性率情况
Figure DEST_PATH_IMAGE006
同时检测常规极少注意的弱势细胞群：浆样树突状细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、髓样树突状细胞。同时检测B细胞、浆细胞，判断有无同时伴发的恶性B系克隆，此外，B祖细胞减少或者无，也是MDS等髓系肿瘤的辅助判断指标之一。
同时进行免疫检查点的监测：本发明方案可以将淋巴细胞详细区分，既能够同时监测淋巴细胞亚群代表的免疫状态，同时可以监测原始细胞和各群淋巴细胞的免疫检查点表达情况。比较正常与肿瘤患者的差异，有可能会作为辅助诊断、预后判断、指导治疗、免疫调节的重要依据。
图1A至图11B显示了本实施例的方法检测标本的部分示例与对照示例。
图1A和图1B：正常骨髓标本，使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析正常髓系发育以及主要细胞群表达。FSC-A/FSC-H设置P1门去除黏连细胞。P1门内细胞使用FSC-A/SSC-A设置活细胞门（P2门）。分析P2门内细胞，SSC-A/CD45设门设置淋巴细胞（lym）、单核细胞（mono）、分化阶段粒细胞（gra）、有核红细胞（P14）、嗜酸性粒细胞（eo）门。研究正常骨髓标本中，主要细胞群24种抗原的表达情况。
图2：正常骨髓标本，使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析正常髓系发育，其中，图片A为全部髓系发育模式，图片B为分化阶段粒细胞发育模式，图片C为单核细胞发育模式，图片D为有核红细胞的表达情况。
图3A、图3B和图3C：正常骨髓标本，使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析正常髓系幼稚细胞分化模式。使用CD117/SSC、CD34/SSC设置不成熟髓细胞门，使用检测标志两两组合，形成数十个组合检测分析正常髓系幼稚细胞的分化过程。
图4A、图4B和图4C：髓系肿瘤标本（AML治疗后MRD检测），使用spectroflow软件分析多种标志组合检测分析髓系肿瘤的恶性髓系幼稚细胞分化模式。使用CD117/SSC、CD34/SSC设置不成熟髓细胞门，使用数十个组合检测分析恶性髓系幼稚细胞的异常表达。主要异常为异常表达CD56、CD96、CD11c、CD36、CD64、CD9、CD15， CD34、CD200、CD371、HLA-DR表达强度增强, CD13、CD33表达减弱，以及这些标志组合的二维点图表达模式改变。
图5：使用kaluza软件检测分析正常与恶性髓系干细胞。其中，图片A为正常对照标本，CD38-/CD34+的最早期髓系干细胞分布占比较低。图片B为髓系肿瘤患者标本，恶性髓系幼稚细胞CD38-/CD34+的肿瘤干细胞略增多。
图6A和图6B：正常骨髓标本，使用spectroflow软件分析多种标志组合，检测常规极少注意的弱势细胞群：设置HLA-DR/CD123二维点图，HLA-DR+/CD123bri细胞群为浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，PDC），HLA-DR-/CD123bri为嗜碱性粒细胞(basophil, baso)。CD117/SSC二维点图中，CD117bri的为肥大细胞。CD45/SSC二维点图中，CD45bri/SSC大的为嗜酸性粒细胞(eosinophil, eo)。CD13/CD11c双强表达，结合HLA-DR判断髓样树突状细胞（myeloid dendritic cell，MDC）。同时使用CD19/SSC设B细胞门，检测分析CD9/CD38等常用标志物组合，检测B细胞发育，判断有无同时伴发的恶性B系克隆，以及通过正常B祖细胞判断骨髓增生情况。
图7：正常骨髓标本，kaluza软件分析淋巴细胞免疫功能检测，CD45/SSC检测分析淋巴细胞门内T、B、NK的占比，CD7/SSC设置T和NK细胞门，根据CD56表达情况将T和NK细胞大致分为：CD56bri调节性NK细胞，CD56dim杀伤性NK细胞，CD56-/CD7+T细胞。CD56-/CD7+T细胞内，根据CD4表达可以将CD56-/CD7+T细胞区分为CD4+T细胞和CD4-（主要为CD8+）T细胞，根据CD38/HLA-DR表达情况选择出双阳性的活化T细胞。
图8：kaluza软件进行免疫检查点的检测。其中，图片A-图片F为正常骨髓标本，图片G-图片L为髓系肿瘤（AML MRD）标本。相邻的两个图片为同一群细胞的CD96/CD7和CD200/CD7表达情况。图片A、图片G分别为正常和恶性CD117+髓系幼稚细胞免疫检查点CD96、CD200表达；图片B、图片H分别为正常和髓系肿瘤患者T细胞免疫检查点CD96、CD200表达；图片C、图片I分别为正常和髓系肿瘤患者CD4+T细胞免疫检查点CD96、CD200表达；图片D、图片J分别为正常和髓系肿瘤患者活化T细胞免疫检查点CD96、CD200表达；图片E、图片K分别为正常和髓系肿瘤患者CD56briNK细胞免疫检查点CD96、CD200表达；图片F、图片L分别为正常和髓系肿瘤患者CD56dimNK细胞免疫检查点CD96、CD200表达。
图9：免疫检查点CD96的表达差异。22例正常标本和42例髓系肿瘤标本进行研究，发现CD96作为免疫检查点，在正常标本和髓系肿瘤标本中，多种细胞群存在表达差异：与正常标本相比，肿瘤患者标本中，CD56弱表达的杀伤性NK细胞CD96表达增强、CD56强表达的调节性NK细胞CD96表达减弱，恶性髓系原始细胞CD96表达增强，均有显著性差异（P值分别为0.007，0.023，0.000）。
图10：免疫检查点CD200的表达差异。22例正常标本和42例髓系肿瘤标本进行研究，发现CD200作为免疫检查点，在正常标本和髓系肿瘤标本中，多种细胞群存在表达差异：与正常标本相比，髓系肿瘤患者标本中，T细胞、CD4+T细胞、活化T细胞、CD56弱表达的杀伤性NK细胞、CD56强表达的调节性NK细胞，以及恶性髓系原始细胞的CD200表达均明显增强，有显著性差异（P值分别为0.000，0.000，0.000, 0.000，0.020，0.000）。
图11A和图11B：正常骨髓标本，用flowjo和kaluza软件多维检测分析髓系原始细胞表达情况。图11A为CD117+髓系幼稚细胞群经trimap降维分析，trimap图中所示CD117+髓系幼稚细胞的CD34+抗原逐渐减弱，并分别向两个方向分化，主要为CD117+CD71+CD33-向有核红阶段发育的细胞，CD117+CD33+CD71-向粒单系发育的髓系原始细胞。图11B使用kaluza分析软件雷达图，依然可以检测分析一致的发育模式。
本发明中，对22例正常标本和42例髓系肿瘤标本进行研究，发现CD96作为免疫检查点，于正常标本相比，髓系肿瘤患者标本中，多种细胞群存在表达差异：CD56dim的杀伤性NK细胞CD96表达增强、CD56bri的调节性NK细胞CD96表达减弱，以及恶性髓系原始细胞的CD96表达增强有显著性差异（P值分别为0.007，0.023，0.000）。CD200作为免疫检查点，于正常标本相比，髓系肿瘤标本中，多种细胞群存在表达差异：T细胞、CD4+T细胞、CD38+/HLA-DR+的活化T细胞、CD56弱表达的杀伤性NK细胞、CD56强表达的调节性NK细胞，以及恶性髓系原始细胞，上述细胞群的CD200表达均明显增强，有显著性差异（P值分别为0.000，0.000，0.000, 0.000，0.020，0.000）。CD96、CD200 都是最新发现的重要免疫检查点。检测分析髓系原始、各群NK、T细胞的CD96、CD200表达情况，比较正常与肿瘤患者的差异，有可能会作为辅助诊断、预后判断、指导治疗、免疫调节的重要依据。
在本发明检测过程中，在所有检测患者中，髓系肿瘤表达概率高的标志有CD13（90%）、CD33（98%）、CD34（90%）、CD117（96%）、CD38（100%）、HLA-DR（85%）、CD371（84%），但是只有CD38、CD34、CD117在其他细胞中表达少，而从重要性来说，CD34、CD117覆盖所有髓系早期细胞，而CD38有CD38阴性的早期细胞，所以CD38是本发明具体实施例中选定的最有希望的髓系靶向治疗标志。

Claims (10)

1.一种抗体组合物，其包括以下抗体：
抗CD15抗体、抗CD96抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD117抗体、抗CD9抗体、抗CD45抗体、抗CD38抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD13抗体、抗CD19抗体、抗CD4抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体、抗CD371抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD200抗体、抗CD14抗体、抗CD56抗体、抗CD71抗体、抗CD2抗体、抗CD123抗体和抗CD64抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体组合物，该抗体组合物中的各抗体均为单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体组合物，其中，各抗体均为荧光素标记的抗体；
抗CD15抗体、抗CD96抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD117抗体、抗CD9抗体、抗CD45抗体、抗CD38抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD13抗体、抗CD19抗体、抗CD4抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体、抗CD371抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD200抗体、抗CD14抗体、抗CD56抗体、抗CD71抗体、抗CD2抗体、抗CD123抗体、抗CD64抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PE-Dazzle594、PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PerCP、PerCP-eFluor、APC、APC-Cy7、BV421、AF532、BV605、BV480、BB515、AF700、BV570、AF647、Pacific Blue、BV750、BV650、BV510、BV785、BV711。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体组合物，该抗体组合物为抗CD15抗体、抗CD96抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD117抗体、抗CD9抗体、抗CD45抗体、抗CD38抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD13抗体、抗CD19抗体、抗CD4抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体、抗CD371抗体、抗CD11c抗体、抗CD11b抗体、抗CD200抗体、抗CD14抗体、抗CD56抗体、抗CD71抗体、抗CD2抗体、抗CD123抗体、抗CD64抗体按照以下体积比混合的混合物：
抗CD15抗体 1，
抗CD96抗体 2.5，
抗CD33抗体 5，
抗CD34抗体 3.5，
抗CD117抗体 1.5，
抗CD9抗体 7，
抗CD45抗体 20，
抗CD38抗体 1.5，
抗HLA-DR抗体 1，
抗CD13抗体 2，
抗CD19抗体 1，
抗CD4抗体 3，
抗CD36抗体 0.5，
抗CD7抗体 1.5，
抗CD371抗体 0.3，
抗CD11c抗体 5，
抗CD11b抗体 1，
抗CD200抗体 5，
抗CD14抗体 1，
抗CD56抗体 2.5，
抗CD71抗体 0.25，
抗CD2抗体 1.5，
抗CD123抗体 2，
抗CD64抗体 1.5。
5.一种试剂盒，其包括第一容器，第一容器容置权利要求1-4任一项所述的抗体组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，该试剂盒还包括：红细胞裂解液、缓冲液、与流式细胞仪配套使用的流式管中的一种或多种。
7.权利要求1-4任一项所述的抗体组合物在制备用于揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的过程包括：
（1）将待测样本加入到流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×106/管- 1×107/管；所述待测样本为骨髓或外周血；
（2）将步骤（1）处理得到的样本，与权利要求1-4任一项所述抗体组合物混匀后，室温避光孵育；
（3）向步骤（2）孵育后的流式管中加入1×溶血素，室温避光孵育；
（4）将步骤（3）孵育后的流式管离心去上清；
（5）向步骤（4）流式管中加入PBS缓冲液混匀，离心去上清，用PBS缓冲液重悬细胞；
（6）对步骤（5）重悬细胞进行流式细胞上机检测，分析结果。
9.一种用于揭示正常髓系发育、髓系肿瘤诊断、肿瘤干细胞研究、靶向治疗靶点筛查、弱势细胞群研究、免疫功能检测、免疫检查点检测的装置，该装置包括检测单元和分析单元，其中：
所述检测单元包括用于通过流式细胞术检测待测个体骨髓或外周血样本的试剂材料，获得样本的检测结果；所述试剂材料包括权利要求1-4任一项所述的抗体组合物；
所述分析单元用于分析检测单元的检测结果。
10.根据权利要求9所述的装置，其中：
通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：利用权利要求1-4任一项所述的抗体组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品；进行流式细胞上机检测；
其中流式细胞上机检测时按照以下方式设门分析：
设置P1门去除黏连细胞；
P1门内细胞设置活细胞门P2门；
单个活细胞门P2门内，同时进行多种设门，检测多群细胞的表达情况：
P2门内，CD45/SSC设门检测淋巴细胞、单核细胞、分化阶段粒细胞、有核红细胞、嗜酸性粒细胞；
P2门内，使用CD117/SSC、CD34/SSC设置不成熟髓细胞门，检测分析髓系幼稚细胞的分化过程；
P2门内检测弱势细胞群：设置HLA-DR/CD123二维点图检测浆样树突状细胞与嗜碱性粒细胞、设置CD117/SSC二维点图检测肥大细胞、设置CD45/SSC二维点图检测嗜酸性粒细胞、设置CD13/CD11c二维点图并结合HLA-DR检测髓样树突状细胞；
P2门内，CD19/SSC设B细胞门，检测B细胞发育；
P2门内，使用CD7/SSC设置T细胞和NK细胞门；CD7阳性的T细胞和NK细胞门内再进行以下检测：检测CD56表达情况以检测调节性NK细胞、杀伤性NK细胞、T细胞；CD56-/CD7+T细胞门内再进行以下检测：检测CD4表达情况以检测CD4+T细胞、CD4-T细胞、活化T细胞；
其中流式细胞上机检测时选择性还进一步包括：进行两个以上个体的样本的检测，以筛查免疫检查点和/或髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点；其中：
筛查免疫检查点包括：P2门内CD117/SSC设门或CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC设门检测髓系原始细胞，以及在P2门内CD7/SSC设置T细胞和NK细胞门内检测NK细胞、T细胞的CD96、CD200表达情况，筛查免疫检查点；
筛查髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点包括：P2门内CD117/SSC设门或CD117阴性肿瘤使用CD34/SSC设门检测髓系肿瘤细胞表达，并统计恶性表达标志出现概率，筛查髓系肿瘤潜在靶向治疗的靶点。
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