CN112626256A

CN112626256A - 一种芝麻苗期耐旱性分子标记及其应用

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Publication number: CN112626256A
Application number: CN202011580678.3A
Authority: CN
Inventors: 梁俊超; 孙建; 乐美旺; 颜廷献; 颜小文; 饶月亮; 周红英
Original assignee: INSTITUTE OF CROPS JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF CROPS JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112626256B

Abstract

本发明涉及芝麻分子育种技术领域，具体涉及一种芝麻苗期耐旱性分子标记及其应用。本发明提供引物对甲和/或引物对乙；所述引物对甲由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成，所述引物对乙由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成。一种PCR试剂，该PCR试剂包括引物对甲和/或引物对乙。耐旱性是一种非常复杂的综合性状，受环境因素影响较大，传统育种方法的选择效率低下。引物对甲和/或引物对乙可提高芝麻苗期耐旱性的选择效率，加快芝麻耐旱性品种的选育。

Description

一种芝麻苗期耐旱性分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及芝麻分子育种技术领域，具体涉及一种芝麻苗期耐旱性分子标记及其应用。

背景技术

芝麻是世界上最重要的油料作物之一，芝麻种子富含蛋白质、维生素以及芝麻素和芝麻酚林等特有的抗氧化物，是深受消费者喜爱的健康食品。相比于其他油料作物，虽然芝麻是较为抗旱的一种，但过度干旱严重影响芝麻生长和产量形成。近年来，在我国北方干旱和半干旱地区以及南方丘陵红壤地区季节性或地域性旱害频繁发生，已成为限制芝麻生产的主要因素之一。芝麻的根系不是很发达，苗期和花期对干旱胁迫非常敏感，芝麻播种期夏旱时有发生，影响芝麻出苗以及出苗后植株的长势，提高苗期的耐旱性对芝麻稳产具有重要意义。通过遗传改良培育耐旱性芝麻品种是缓解旱害最有效的措施。

已有的研究表明与增强植物耐旱性有关的性状大都是多基因控制的复杂数量性状，比如苗期的根长、根生物量、胚芽鞘长和茎长，以及成株期的株高、根长以及产量相关性状等。植物的根在吸收与转运水分和营养元素过程中起到至关重要的作用，发达的根系可显著提高植株的耐旱性，相对根长性状(胁迫处理下的根长/对照处理下的根长)常被用于衡量植株的耐旱性。目前，虽然已有研究人员利用全基因组关联分析的方法鉴定到一些与芝麻苗期或花期耐旱性状相关的位点，但仍未有芝麻根部性状遗传研究的报道，也未有相关分子标记的报道。因此，挖掘芝麻在干旱胁迫下根部性状的相关主效QTL，开发与主效基因位点紧密连锁的分子标记对芝麻耐旱育种具有很大的潜在应用价值，提高对耐旱性状的选择效率。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中传统育种方法的选择耐旱性芝麻效率低下缺陷，从而提供一种引物对甲和/或引物对乙，PCR试剂，试剂盒，可提高芝麻苗期耐旱性的选择效率，加快芝麻耐旱性品种的选育。

引物对甲和/或引物对乙；所述引物对甲由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成，所述引物对乙由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成。

一种PCR试剂，该PCR试剂包括上述引物对甲和/或引物对乙。

一种试剂盒，包括上述的引物对甲和/或引物对乙，或上述的PCR试剂；SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子均独立包装。

本发明还提供一种预测待测芝麻苗期耐旱性高低和/或芝麻相对根长的方法，包括如下步骤：以待测芝麻品种A和B的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果待测芝麻品种A用引物对甲进行PCR扩增的扩增产物具有205bp(可选的，为205bp)的DNA片段，且用引物对乙进行PCR扩增的扩增产物具有171bp的DNA片段；待测芝麻品种B用引物对甲进行PCR扩增的扩增产物具有184bp(可选的，为184bp)的DNA片段,且用引物对乙进行PCR扩增的扩增产物具有164bp的DNA片段；待测芝麻品种A的耐旱性较待测芝麻品种B高，和/或，待测芝麻品种A的相对根长较待测芝麻品种B长；相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。

本发明还提供芝麻苗期耐旱性相关分子标记，为如下任一一种：

(I)由DNA分子1和DNA分子2组成；

(II)DNA分子1或DNA分子2；

DNA分子1是以芝麻的基因组DNA为模板，采用上述的引物对甲进行扩增得到的DNA分子；DNA分子2是以芝麻的基因组DNA为模板，采用上述的引物对乙进行扩增得到的DNA分子；

DNA分子1的长度为205bp或184bp；

DNA分子2的长度为164bp或171bp。

述的芝麻苗期耐相关旱性分子标记在如下1)-10)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定芝麻耐旱性；

2)制备鉴定或辅助鉴定芝麻耐旱性的产品；

3)检测或辅助检测芝麻相对根长；

4)制备检测或辅助检测芝麻相对根长的产品；

5)检测或辅助检测待测芝麻材料是否含有耐旱主效基因位点qRRL12；

6)制备检测或辅助检测待测芝麻材料是否含有耐旱主效基因位点qRRL12的产品；

7)筛选或辅助筛选苗期耐旱芝麻；

8)制备筛选或辅助筛选苗期耐旱芝麻的产品；

9)预测芝麻相对根长表型；

10)制备预测芝麻或芝麻植株相对根长表型的产品；

相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。

引物对甲和/或引物对乙、PCR试剂或试剂盒在如下1)-7)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定芝麻耐旱性；

2)检测或辅助检测芝麻相对根长；

3)检测或辅助检测芝麻是否含有上述耐旱性分子标记；

4)制备检测或辅助检测芝麻是否含有上述耐旱性分子标记的产品；

6)筛选或辅助筛选苗期耐旱芝麻；

7)预测相对根长表型；

相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。

可选的，利用引物对甲和引物对乙对待测芝麻材料的基因组DNA进行PCR扩增，如果用引物对甲扩增得到205bp的片段，且用引物对乙扩增得到171bp的片段，则待测芝麻材料含有耐旱主效基因位点qRRL12。

可选的，所述胁迫为干旱胁迫；所述干旱胁迫为PEG胁迫。

可选的，所述芝麻为金黄麻、湖北竹山白或现有未命名的芝麻材料。

可选的，上述基因组模板为苗期芝麻基因组模板。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的引物对甲和/或引物对乙；所述引物对甲由SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的单链DNA分子组成，所述引物对乙由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成。耐旱性是一种非常复杂的综合性状，受环境因素影响较大，传统育种方法的选择效率低下。引物对甲和/或引物对乙可提高芝麻苗期耐旱性的选择效率，加快芝麻耐旱性品种的选育。

2、本发明提供一种预测待测芝麻苗期耐旱性高低和/或芝麻相对根长的方法，包括如下步骤：以待测芝麻品种A和B的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果待测芝麻品种A用引物对甲进行PCR扩增的扩增产物具有205bp的DNA片段，且用引物对乙进行PCR扩增的扩增产物具有171bp的DNA片段；待测芝麻品种B用引物对甲进行PCR扩增的扩增产物具有184bp的DNA片段,且用引物对乙进行PCR扩增的扩增产物具有164bp的DNA片段；待测芝麻品种A的耐旱性较待测芝麻品种B高，和/或，待测芝麻品种A的相对根长较待测芝麻品种B长；相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。该方法能够快速、简便预测芝麻苗期耐旱性高低和/或芝麻相对根长。

3、本发明提供了芝麻苗期耐旱性分子标记，为如下任一一种：(I)由DNA分子1和DNA分子2组成；(II)DNA分子1或DNA分子2；DNA分子1是以芝麻的基因组DNA为模板，采用上述的引物对甲进行扩增得到的DNA分子；DNA分子2是以芝麻的基因组DNA为模板，采用上述的引物对乙进行扩增得到的DNA分子；DNA分子1的长度为205bp或184bp；DNA分子2的长度为164bp或171bp。本发明首次提供了与芝麻相对根长相关的耐旱性主效基因位点连锁的共显性分子标记，标记扩增简便且稳定，通过对连锁分子标记DNA分子1和DNA分子2的扩增，可快速检测出带有qRRL12位点的材料，预测相对根长表型，筛选出苗期较为耐旱的材料用于品种改良。

4、本发明提供引物对甲和/或引物对乙、PCR试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测芝麻材料是否含有耐旱主效基因位点qRRL12中的应用；本发明获得的与qRRL12连锁的分子标记，通过引物对甲和/或引物对乙、PCR试剂或试剂盒能快速确定材料中是否存在qRRL12位点，并且可用于该位点的分子标记辅助选择。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ZMG009在亲本和芝麻耐旱性鉴定材料中的扩增产物电泳图；M为分子量标记，1-16为待检芝麻材料，17和18分别为亲本金黄麻和湖北竹山白，箭头所指为多态带；

图2为ZMG010在亲本和芝麻耐旱性鉴定材料中的扩增产物电泳图；M为分子量标记，1-16为待检芝麻材料，17和18分别为亲本金黄麻和湖北竹山白，箭头所指为多态带；

图3为qRRL12位点不同基因型材料相对根长的比较；Z和J分别表示qRRL12位点为湖北竹山白和金黄麻基因型的材料；***表示在0.001的水平上差异显著；纵坐标为相对根长。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

金黄麻在孙建,乐美旺,饶月亮,颜廷献,颜小文,周红英.芽期Al～(3+)胁迫对芝麻幼苗生长的影响及种质资源耐铝毒性评价[J].中国油料作物学报,2014,36(05):602-609.中公开过；

湖北竹山白在刘爱丽,王林海,黎冬华,周瑢,江诗洋,张秀荣.不同耐湿基因型芝麻响应湿害胁迫的生理指标变化的研究[J].核农学报,2019,33(02):372-378.中公开过。

15％PEG：75g PEG-6000+100mL蒸馏水溶解，定容到500mL。

实施例1、芝麻苗期耐旱主效基因位点qRRL12连锁分子标记的获得

一、芝麻耐旱主效基因位点qRRL12的定位

1、高密度遗传图谱构建

利用金黄麻和湖北竹山白为亲本构建的F₉重组自交系群体，结合基因组重测序技术，进行高密度遗传图谱构建。采用上海生工公司的植物基因组DNA提取试剂盒((B518261,Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai)提取180个F₉家系和亲本DNA，按照Illumina公司提供的标准方法进行文库构建和高通量测序，测序平台为Illumina Hiseq 2000，亲本测序深度为10×，群体家系平均测序深度为4×。经过数据过滤、参考基因组比对、变异分析和群体基因型分型后，以最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≤0.2，相对杂合率≤0.2，缺失基因型比例<0.5为筛选条件筛选多态标记用于遗传图谱构建。共获得466,911个SNPs和72,981个InDels，分布于13条染色体上。芝麻参考基因组下载自芝麻基因组数据库(http://www.sesame-bioinfo.org/Sinbase2.0/)。

将筛选得到的539,802(466,911个SNPs+72,981个InDels)个多态标记按其所在染色***置区分连锁群，根据相邻标记之间的等位基因连锁关系推断亲本的基因型，与实际测序得到的亲本基因型进行比较发现一致性均符合预期。基于推断的亲本基因型，确定每个等位基因的来源，然后使用基于隐马尔科夫模型(Hidden Markov Model,HMM)的算法填补缺失的基因型(Xie et al.2010)，计算遗传图距，然后按连锁群进行遗传图谱构建。最终1354个标记位点被成功定位于13个染色体上，覆盖538,090个多态标记。

2、苗期相对根长性状调查

耐旱性胁迫，利用15％的PEG6000溶液(配置方法见上文)对亲本以及包含180个家系的湖北竹山白×金黄麻F₉重组自交系群体进行发芽胁迫处理，并设置水作为对照，发芽五天后，量取根长表型数据，每个家系测20株，胁迫处理试验重复两次，每次每个家系每个处理设置三次重复。按如下公式计算每个材料的相对根长，相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。胁迫处理试验在植物培养箱内进行。数据比较分析发现，亲本湖北竹山白在PEG胁迫处理下的相对根长显著高于金黄麻。群体家系平均相对根长的变异分布表现出超亲分离现象，说明该性状为复合多基因遗传模式，并且相对根长表现出较高的遗传力，达到75％。

3、耐旱性QTL的定位

利用Window QTL Cartographer Version 2.5软件的复合区间作图(compositeinterval mapping,CIM)功能对相对根长性状进行QTL定位。以LOD值大于或等于2.5作为QTL检测的标准。结果在芝麻12号染色体上检测到一个主效基因位点qRRL12，该位点在两次独立重复试验中均能检测到，定位在InDel标记c12b031-8和c12b036-9之间，平均LOD值达到7.81，解释13.37％的表型变异。来自湖北竹山白的qRRL12等位位点具有增加相对根长的效应。

二、耐旱主效基因位点qRRL12连锁分子标记的开发

利用InDel标记c12b031-8和c12b036-9所在基因组的旁侧500bp序列各设计了一对特异引物，分别为ZMG009F(5’-caaaccctcgttggaagtgg-3’，SEQ ID NO.1)和ZMG009R(5’-gcttgaacctagatatgatgtctg-3’，SEQ ID NO.2)与ZMG010F(5’-gcatctcttcattcaatatagatg-3’，SEQ ID NO.3)和ZMG010R(5’-cacgaccaagaccttgattc-3’，SEQ ID NO.4)，利用这两对引物可以扩增出相应InDel标记片段，其中ZMG009在湖北竹山白中的扩增片段长度为205bp，在金黄麻中的扩增片段长度为184bp；ZMG010在湖北竹山白中的扩增片段长度为171bp，在金黄麻中的扩增片段长度为164bp。

标记PCR的反应体系为10μL：10×buffer(含Mg²⁺)1μL，2.5mM dNTP1μL，正、反向引物各0.2μM，1U/μL Taq聚合酶(R001B,Takara Biomedical Technology)0.1μL，10ng/μLDNA模板1μL，补水至10μL。

PCR扩增在Bio-Rad thermal cycler T100扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，循环36次；最后72℃延伸5min。扩增产物在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳后对凝胶进行银染显色并拍照记录。

实例2qRRL12分子标记的应用

以金黄麻和湖北竹山白以及本课题组从江西省境内收集的16份芝麻材料(编号为1-16)叶片的基因组DNA为模板，利用上述开发的标记引物ZMG009F和ZMG009R以及ZMG010F和ZMG010R进行PCR扩增和扩增产物的电泳，其中在金黄麻和9份芝麻材料(编号为4,6,7，8,10,13,14,15,16)中，ZMG009F和ZMG009R能扩增出片段大小为184bp的条带，且ZMG010F和ZMG010R能扩增出片段大小为164bp的条带；在湖北竹山白和另外7份芝麻材料(编号为1,2,3,5,9,11,12)中，ZMG009F和ZMG009R能扩增出205bp的条带，且ZMG010F和ZMG010R能扩增出171bp的条带(图1；图2)。利用上述方法调查材料的相对根长，发现与湖北竹山白扩增条带相同的7份材料的相对根长显著大于与金黄麻扩增条带相同的9份材料(图3)。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江西省农业科学院作物研究所

<120> 一种芝麻苗期耐旱性分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaaccctcg ttggaagtgg 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcttgaacct agatatgatg tctg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcatctcttc attcaatata gatg 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cacgaccaag accttgattc 20

Claims

1.引物对甲和/或引物对乙；所述引物对甲由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成，所述引物对乙由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成。

2.一种PCR试剂，其特征在于，该PCR试剂包括权利要求1所述引物对甲和/或引物对乙。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对甲和/或引物对乙，或权利要求2所述的PCR试剂；SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子均独立包装。

4.一种预测待测芝麻苗期耐旱性高低和/或芝麻相对根长的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测芝麻品种A和B的基因组DNA为模板，分别用权利要求1所述引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果待测芝麻品种A用引物对甲进行PCR扩增的扩增产物具有205bp的DNA片段，且用引物对乙进行PCR扩增的扩增产物具有171bp的DNA片段；待测芝麻品种B用引物对甲进行PCR扩增的扩增产物具有184bp的DNA片段,且用引物对乙进行PCR扩增的扩增产物具有164bp的DNA片段；待测芝麻品种A的耐旱性较待测芝麻品种B高，和/或，待测芝麻品种A的相对根长较待测芝麻品种B长；相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。

5.芝麻苗期耐旱性相关分子标记，其特征在于，为如下任一一种：

(I)由DNA分子1和DNA分子2组成；

(II)DNA分子1或DNA分子2；

DNA分子1是以芝麻的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对甲进行扩增得到的DNA分子；

DNA分子2是以芝麻的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对乙进行扩增得到的DNA分子；

DNA分子1的长度为205bp或184bp；

DNA分子2的长度为164bp或171bp。

6.权利要求5所述的芝麻苗期耐旱性相关分子标记在如下1)-10)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定芝麻耐旱性；

2)制备鉴定或辅助鉴定芝麻耐旱性的产品；

3)检测或辅助检测芝麻相对根长；

4)制备检测或辅助检测芝麻相对根长的产品；

7)筛选或辅助筛选苗期耐旱芝麻；

8)制备筛选或辅助筛选苗期耐旱芝麻的产品；

9)预测芝麻相对根长表型；

10)制备预测芝麻或芝麻植株相对根长表型的产品；

相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。

7.权利要求1所述引物对甲和/或引物对乙、权利要求2所述PCR试剂或权利要求3所述试剂盒在如下1)-7)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定芝麻耐旱性；

2)检测或辅助检测芝麻相对根长；

3)检测或辅助检测芝麻是否含有权利要求6所述耐旱性分子标记；

4)制备检测或辅助检测芝麻是否含有权利要求6所述耐旱性分子标记的产品；

6)筛选或辅助筛选苗期耐旱芝麻；

7)预测芝麻相对根长表型；

相对根长＝胁迫处理下的根长/对照处理的根长。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用权利要求1中的引物对甲和引物对乙对待测芝麻材料的基因组DNA进行PCR扩增，如果用引物对甲扩增得到205bp的片段，且用引物对乙扩增得到171bp的片段，则待测芝麻材料含有耐旱主效基因位点qRRL12。

9.根据权利要求4所述的方法，权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述胁迫为干旱胁迫；所述干旱胁迫为PEG胁迫。