CN112626063B - 一种利用cd138+生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方法及应用 - Google Patents

一种利用cd138+生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用CD138+生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方法。该方法包括以下步骤。步骤一，富集：利用浆细胞表面CD138+生物标记物富集小鼠浆细胞。步骤二，融合：收集富集后的小鼠浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞电融合。本发明利用浆细胞表面CD138+生物标记物富集小鼠浆细胞，大幅度提高浆细胞的纯度，从而获得大量分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，大大提升了筛选过程中特异性抗体的阳性率。同时大大降低了初始细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合的细胞数量，进而极大地减少铺板数量，减少了高通量筛选及人力、物力成本。

Description

一种利用CD138+生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方 法及应用
技术领域
本发明涉及浆细胞，杂交瘤细胞-单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种利用CD138+生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方法及其应用。
背景技术
杂交瘤-单克隆抗体技术由Kohler和Milstein于1975年发明，并于1984年获得诺贝尔生理及医学奖。传统杂交瘤技术主要流程是：1)用特异性抗原免疫小鼠；2)然后取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，两种细胞在体外融合后形成的新细胞，既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有B细胞分泌抗体的能力，该融合细胞称为杂交瘤细胞(hybridoma cell)；3)高通量，快速筛选大量杂交瘤以确定针对特异性抗原的阳性杂交瘤细胞。
杂交瘤-单克隆抗体技术平台具有独特优势，是目前新药抗体研发领域最主导，最常用的技术平台。该技术平台成熟、稳定、通量高，产生的新药抗体数量大、特异性强、亲和力高。
单克隆抗体被广泛应用于生命科学的各个领域包括：疾病的诊断及检测、疾病治疗特别在肿瘤治疗领域和自身免疫性疾病等等。目前临床使用的单克隆抗体药物主要从杂交瘤技术平台产生获得。
传统杂交瘤技术仍存在一些关键技术瓶颈，包括1)直接从免疫小鼠脾脏及***分离的混合细胞90％以上都是不分泌特异性抗体的干扰细胞，仅含量为0.1-6％左右的浆细胞才能够产生特异性抗体并形成杂交瘤；2)由于被用来融合的细胞量大，导致每次融合需要铺大量细胞培养板(通常至少有80-100 96孔板)、高通量筛选消耗大量耗材及昂贵试剂、研发人员工作时间，工作强度极大；3)含量极少且真正分泌特异性抗体的浆细胞受到其它无关细胞的严重干扰，产生大量的无效杂交瘤，极大地增加了研发项目的挑战性，甚至导致项目失败。
因此，减少原始细胞混合材料中其它细胞的干扰，提高真正分泌特异性抗体的浆细胞的利用度尤为重要。浆细胞杂交瘤融合提高杂交瘤阳性率，极大增加杂交瘤多样性，高质量保证研发项目成功具有非常重要的意义。在保证质量的同时，极大地减少铺板数量，减少高通量筛选及人力、物力成本。
传统小鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体是取免疫小鼠的脾脏和***组织经分离研磨获得的脾细胞和淋巴细胞再与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合获得既能够无限增殖又能够分泌抗体的小鼠杂交瘤细胞。因大量细胞经过融合需进行细胞培养及筛选，在此过程中往往涉及大量细胞培养板(传统杂交瘤通常至少有80-100块96孔板)、大量细胞培养基、多种筛选策略的高通量筛选、大量的耗材及昂贵试剂。且短时间内的筛选导致研发人员工作时间，工作强度极大。甚至有些项目含有极少的浆细胞成分(小于0.5％)，融合的特异性浆细胞受到其它混合组织细胞的严重干扰，产生大量的无效杂交瘤，极大地增加了研发项目的挑战性，甚至导致研发项目失败。
本领域亟需解决以上问题，制备出高质量、特异性、多样性的单克隆抗体并提高研发人员的工作效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种利用CD138+生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方法。本发明利用浆细胞上的CD138+生物标志物，对仅含有0.1-6％浆细胞的小鼠免疫组织细胞进行CD138+阳性富集，获得70-80％高纯度的浆细胞。去掉90％以上的不分泌抗体的其他无关细胞成分，极大地降低了对后续实验的干扰。
本发明要解决的技术问题之二在于提供采用上述方法制备获得杂交瘤。
本发明要解决的技术问题之三在于提供上述杂交瘤在制备单克隆抗体药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供一种利用CD138+生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方法，包括如下步骤：
(1)富集：通过小鼠CD138阳性选择试剂盒富集小鼠浆细胞；
(2)融合：收集富集后的小鼠浆细胞；分别将小鼠浆细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞悬液离心弃上清，洗涤后按照小鼠浆细胞和小鼠骨髓瘤细胞比例为1:1-1:3进行细胞电融合；
(3)培养：将融合后的细胞接入HAT培养基中于二氧化碳培养箱中培养；
(4)筛选：将融合后的细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养，7-14天后进行特异性抗体高通量筛选。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述富集的具体方法是：
(a)制备缓冲液，过滤除菌后按照1×108cells/mL的密度调节免疫组织混合细胞；
(b)在步骤(a)所得细胞悬液中按照体积比50μL/mL加入小鼠FcR阻断剂和小鼠CD138阳性选择混合物，混匀后孵育；
(c)在步骤(b)所得细胞悬液中按照体积比50μL/mL加入磁珠beads，混匀后孵育；
(d)将步骤(c)所得溶液用缓冲液补齐相应的体积混匀后放置磁体中，孵育后倒出无关细胞悬液；缓冲液洗涤管壁补齐相应的体积混匀后，再将溶液放置磁体中孵育，倒出无关细胞悬液后收集管壁富集的细胞。
作为本发明优选的技术方案，步骤(a)中，所述缓冲液含PBS(无Ca2+，Mg2+)，2％FBS，1mM EDTA。
作为本发明优选的技术方案，步骤(b)中，所述孵育具体方法为在2-8℃，孵育3-10分钟。
作为本发明优选的技术方案，步骤(c)中，所述孵育具体方法为在2-8℃，孵育3-10分钟。
作为本发明优选的技术方案，步骤(d)中，所述孵育具体方法是在室温孵育5-10分钟。
作为本发明优选的技术方案，在进行步骤(2)所述细胞电融合前，按每1-2×108cell加1mL pronase buffer处理小鼠浆细胞和小鼠骨髓瘤细胞，处理时间为5-60秒，加多于10倍体积的FBS干扰反应。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，培养箱中二氧化碳浓度为5％，培养温度为37℃，培养时间1-3小时。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，培养箱中二氧化碳浓度为5％，培养温度为37℃。
在本发明第二方面，还提供采用上述方法制备得到的杂交瘤。
在本发明第三方面，还提供所述的杂交瘤在制备单克隆抗体药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、利用CD138+生物标志物，能够使浆细胞的纯度从富集前仅占免疫组织总细胞的0.1-6％提高至富集后的70-80％，同时去掉90％以上的无关细胞成分，不仅获得了高纯度浆细胞，且不会浪费免疫材料，极大地降低了对后续实验的干扰，最终获得大量分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，大大提高了筛选过程中特异性抗体的阳性率，使杂交瘤的阳性率提高5-10倍。
2、利用高纯度浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，最大限度充分利用具有抗体分泌功能的浆细胞，使得更多的浆细胞都能形成分泌抗体的“有效”杂交瘤细胞，使杂交瘤的阳性率提高5-10倍，并明显提高杂交瘤特异性、多样性(包括抗体亚型多样性，抗原结合表位多样性)。极大地提高了阳性杂交瘤的产量和质量。
3、原始混合细胞进行浆细胞富集，能够充分利用组织中的有效浆细胞，剔除90％以上的无关细胞成分，极大地降低了初始细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合的细胞数量，进而极大地降低细胞融合铺板数量由传统至少80-100块96孔板降低至10-30 96孔板，极大降低后续细胞筛选花费的人力、物力、时间成本超过70％，大大提高研发人员的工作效率和工作质量。
4.浆细胞融合的细胞铺板密度比传统杂交瘤融合铺板密度低5-6倍，平均每个融合板孔中约1-2个杂交瘤细胞团，筛选过程中保证了真实特异性抗体的阳性率和多样性。
附图说明
图1是本发明实施例1中利用CD138+生物标记物富集小鼠浆细胞的流程图。
图2是本发明实施例1中Balb/c免疫小鼠脾脏组织B淋巴细胞群浆细胞富集前后占比示意图。
图3是本发明实施例1中Balb/c免疫小鼠淋巴、脾脏组织B淋巴细胞群浆细胞富集前后占比示意图。
图4是本发明实施例2传统杂交瘤与浆细胞杂交瘤阳性杂交瘤对比示意图。
图5是本发明实施例2传统杂交瘤与浆细胞杂交瘤阳性杂交瘤对比示意图。
图6是发明实施例4传统杂交瘤融合和浆细胞融合不同细胞密度铺板阳性杂交瘤对比示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
实施例1：小鼠浆细胞富集
目前市场上针对小鼠浆细胞富集的试剂盒屈指可数，主要有：STEMCELLEasySep.Mouse CD138 Positive Selection Kit(Catalog#18957)和Miltenyi BiotecCD138+Plasma Cell Isolation Kit(no.130-092-530)，本发明浆细胞富集使用的是前者。
浆细胞富集工艺材料：
试剂名称 规格 储存
Mouse CD138Positive Selection Cocktail 1×1mL 2-8℃
Dextran RapidSpheres 1×1mL 2-8℃
Mouse FcR Blocker 2×0.5mL 2-8℃
见：STEMCELL EasySep.Mouse CD138 Positive Selection Kit(Catalog#18957)
图2和图3分别取免疫后的不同Balb/c小鼠的脾脏或脾脏和***组织，经玻璃棒研磨分离免疫组织混合细胞，按照如下步骤操作：
1、制备Recommended Medium：
含PBS(无Ca2+，Mg2+)，2％FBS，1mM EDTA，0.22μm滤膜过滤除菌。
2、用Recommended Medium按照1×108cells/mL的密度调整免疫组织混合细胞，混合后的细胞悬液加入干净的聚苯乙烯圆底管中(e.g.STEMCELL Catalog#38008)。
3、举例如上述1×108cells/mL按照50μL/mL依次添加Mouse FcR Blocker，MouseCD138 Positive Selection Cocktail于上述样品中，混匀，冰上或2-8℃，孵育3-10分钟，优选5分钟(见图1中第一步“2-8℃孵育5分钟”)。
4、涡旋震荡RapidSpheres至少30秒，按照50μL/mL加入样品中。混匀，冰上或2-8℃，孵育3-10分钟，优选5分钟(见图1中第二步“2-8℃孵育5分钟”)。
5、加Recommended Medium定容至相应的体积(对于<4mL的样品，加至5mL；对于≥4mL的样品，加至10mL)。
6、将聚苯乙烯圆底管***磁体中，室温孵育5-10分钟(见图1中“将管放置磁体中，室温孵育5-10分钟”)。
7、手托住磁体并拇指轻扣聚苯乙烯圆底管壁(圆底管勿拿出磁体)，轻轻倒出无关细胞悬液，重复步骤5和步骤6，洗涤管壁，再次将聚苯乙烯圆底管***磁体，室温孵育5-10分钟(见图1中“再次将管放置磁体中，室温孵育5-10分钟”)，轻轻倒出细胞悬液，将聚苯乙烯圆底管拿出磁体，收集细胞。
富集后的细胞经FACS染色，检测特异性CD138+细胞。两次富集结果显示：利用CD138+生物标志物，能够使浆细胞的纯度从富集前仅占免疫组织总细胞的1.8-4.4％提高至富集后70-80％，大大提高了浆细胞的纯度。结果见图2和图3。
实施例2：小鼠浆细胞融合及筛选
取免疫小鼠的脾脏组织，经玻璃棒研磨后，一部分细胞经红细胞裂解液处理后与小鼠骨髓瘤细胞进行传统杂交瘤融合(传统杂交瘤融合中，经红细胞裂解液处理后的混合细胞、小鼠骨髓瘤细胞中细胞洗涤、计数、pronase buffer处理及融合步骤可参考以下步骤)。一部分细胞用小鼠Mouse CD138阳性试剂盒(如上实施例1步骤)进行浆细胞富集。然后用富集后的浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合。
浆细胞融合工艺材料：
Figure BDA0002845651520000061
细胞融合方式以电融合举例，具体步骤如下：
1、按照实施例1步骤进行小鼠浆细胞富集。用DMEM基础培养基收集聚苯乙烯圆底管壁富集后的浆细胞转于15mL离心管中，重悬细胞并计数，离心2000rpm，3-10分钟。
2、弃上清，按每1-2×108细胞加1mL pronase buffer处理细胞10-60s，加多于10倍体积的FBS干扰反应。补加DMEM基础培养基至合适体积，不超过离心管体积，再经70目滤网过滤除去团块，离心，2000rpm，3-10分钟。
3、弃上清，加DMEM培养基洗涤细胞，离心2000rpm，3-10分钟。
4、弃上清，加细胞电融合缓冲液重悬细胞团并进行细胞计数。离心2000rpm，3-10分钟。
5、加细胞电融合缓冲液将细胞调整为1-8×106cell/mL。
6、收集培养的小鼠骨髓瘤细胞(取对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞，收集细胞悬液，计数)，离心，1000rpm，3-10分钟。
7、弃上清，加DMEM基础培养基重悬细胞，离心，1000rpm，3-10分钟。
8、弃上清，pronase buffer处理小鼠骨髓瘤细胞参考上述第2步操作，离心1000rpm，3-10分钟。
9、弃上清，加DMEM基础培养基洗涤细胞两次，离心1000rpm，3-10分钟。
10、弃上清，加细胞电融合缓冲液重悬细胞团并进行细胞计数。离心1000rpm，3-10分钟。
11、加细胞电融合缓冲液将细胞调整为1-10×106cell/mL。
12、按照浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞的比例(1:1-1:3)进行细胞电融合操作。
13、融合后的细胞转至装有新鲜HAT培养基的容器中，并将容器放置二氧化碳细胞培养箱中(5％CO2，37℃)。
14、培养1-3个小时后，将融合后的细胞铺于96孔细胞培养板中，置二氧化碳细胞培养箱(5％CO2，37℃)中继续培养，7-14天后进行特异性抗体高通量筛选。
浆细胞杂交瘤融合比传统杂交瘤融合可以最大限度提高浆细胞的利用度，使得更多的浆细胞都能够有机会和小鼠骨髓瘤细胞融合形成分泌抗体的“有效”杂交瘤细胞，进而提高了特异性抗体的阳性率。用富集的浆细胞与小鼠骨髓瘤进行杂交瘤融合不仅能够制备出高质量、特异性的抗体，还能去除90％以上的无关原始混合细胞成分，充分利用组织中的有效浆细胞，极大地降低了初始细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合的细胞数量，极大地降低细胞融合铺板数量由传统至少80-100块96孔板降低至10-30 96孔板。大幅度降低筛选过程中的人力、物力、时间成本，极大地提高了工作效率和工作质量。结果见图4和图5，图4代表项目1，用项目1的靶点抗原蛋白免疫小鼠，图5代表项目2，用项目2的靶点抗原蛋白免疫小鼠，项目1和项目2采用不同的抗原免疫不同小鼠后，待免疫小鼠针对特定的抗原产生较强的免疫反应后，取相应免疫小鼠的脾脏及***细胞进行浆细胞富集后并小鼠骨髓瘤细胞进行电融合，设定对应免疫组织细胞的传统杂交瘤融合作对照组。
实施例3：小鼠浆细胞融合vs传统杂交瘤融合阳性杂交瘤抗体表位结合多样性、亚型多样性比较
1、如实施例2项目2(对应图5)中筛选的阳性杂交瘤所分泌的抗体进行亚型检测，结果表明浆细胞融合筛选出的阳性杂交瘤抗体比传统杂交瘤筛选出的杂交瘤抗体表现出更多的亚型多样性，不仅能够生产出特异性的抗体，而且生产出的抗体更具多样性。结果见表1。
2、如实施例2项目2(对应图5)中筛选的阳性杂交瘤所分泌的抗体与BMK一起进行特异性抗原、抗体结合表位实验，结果表明浆细胞融合筛选出的阳性杂交瘤抗体比传统杂交瘤筛选出的杂交瘤抗体表现出更多抗原结合表位多样性。抗原结合表位高度相似，生产出的抗体相对单一，抗原结合表位多样性，生产出的抗体也表现出多样性，多样性高、差异大的抗体可以为抗体新药研发提供更多的机会和优势。结果见表2。
表1：传统杂交瘤融合和浆细胞融合阳性杂交瘤亚型多样性比较
Figure BDA0002845651520000081
备注：“/”：无；“+”：阳性杂交瘤出现的亚型；
表2：传统杂交瘤融合vs浆细胞杂交瘤融合阳性杂交瘤抗原表位结合多样性比较
Figure BDA0002845651520000082
备注：“+”：阳性杂交瘤与BMK抗原结合表位相同；“－”：阳性杂交瘤与BMK抗原结合表位不相同；“NA”：其他；
实施例4：传统杂交瘤融合和小鼠浆细胞融合不同细胞铺板密度阳性率比较如实施例4中传统杂交瘤融合细胞铺板密度一般8000-20000细胞/孔，5块96孔融合板，筛选获得的阳性杂交瘤为52个。相同板数下，浆细胞融合中，细胞铺板密度为8000-10000细胞/孔，筛选获得的阳性杂交瘤为470个，细胞铺板密度为500-4000细胞/孔，筛选获得的阳性杂交瘤为449个。结果表明浆细胞融合中，低密度细胞融合板在筛选过程中反映了真实特异性抗体的阳性率和多样性。结果见图6。

Claims (7)

1.一种利用CD138+ 生物标志物富集小鼠浆细胞制备杂交瘤的方法，其特征在于，为以下步骤：
（1）富集：通过小鼠CD138阳性选择试剂盒直接阳性选择富集小鼠浆细胞；所述小鼠CD138阳性选择试剂盒包括小鼠CD138阳性选择混合物、小鼠FcR阻断剂和磁珠；步骤（1）所述富集的具体方法是：
（a）制备缓冲液，过滤除菌后按照1 × 108 cells/mL的密度调节免疫组织混合细胞；
（b）在步骤(a)所得细胞悬液中按照体积比50 μL/mL加入小鼠FcR阻断剂和小鼠CD138阳性选择混合物，混匀后孵育；
（c）在步骤（b）按照体积比50 μL/mL加入磁珠beads，混匀后孵育；
（d）将步骤（c）所得溶液用缓冲液补齐相应的体积混匀后放置磁体中，孵育后倒出无关细胞悬液；用缓冲液洗涤管壁补齐相应的体积混匀后，再将溶液放置磁体中孵育，倒出无关细胞悬液后收集管壁富集的细胞；
（2）融合：收集富集后的小鼠浆细胞；分别将小鼠浆细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞悬液离心弃上清，洗涤后按照小鼠浆细胞和小鼠骨髓瘤细胞比例为1:1-1:3 进行细胞电融合；细胞铺板密度为500-4000细胞/孔；在进行步骤（2）所述细胞电融合前，按每1-2 × 108 cell加1 mL pronase buffer处理小鼠浆细胞和小鼠骨髓瘤细胞，处理时间为10-60秒，加多于10倍体积的FBS干扰反应；
（3）培养：将融合后的细胞接入HAT培养基中于二氧化碳培养箱中培养；
（4）筛选：将融合后的细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养，7-14天后进行特异性抗体高通量筛选。
2.根据权利要求1所述的制备杂交瘤的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述缓冲液含PBS，2% FBS，和1 mM EDTA；所述PBS中无Ca2+，Mg2+。
3.根据权利要求1所述的制备杂交瘤的方法，其特征在于，步骤（b）中，所述孵育具体方法为在2-8℃，孵育3-10分钟。
4.根据权利要求1所述的制备杂交瘤的方法，其特征在于，步骤（c）中，所述孵育具体方法为在2-8℃，孵育3-10分钟。
5.根据权利要求1所述的制备杂交瘤的方法，其特征在于，步骤（d）中，所述孵育具体方法是在室温孵育5-10分钟。
6.根据权利要求1所述的制备杂交瘤的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度为5%，培养温度为37℃，培养时间1-3小时。
7.根据权利要求1所述的制备杂交瘤的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度为5%，培养温度为37℃。
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