CN112626036B - 一种基因缺失的无毒猪痘病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因缺失的无毒猪痘病毒及其在制备疫苗中的应用，所述无毒猪痘病毒是野生猪痘病毒的SPV009基因缺失病毒，所述SPV009基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。相对于现有技术，本发明经过大量试验成功构建了SPVSPV009基因缺失的猪痘病毒，该病毒对猪安全无毒，可作为疫苗表达载体用于其他动物疫病的活载体疫苗的研制，减少养殖业的经济损失。

Description

一种基因缺失的无毒猪痘病毒及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因缺失的无毒猪痘病毒及其应用，属于生物制品领域。

背景技术

猪痘病毒(Swinepox virus,SPV)是脊椎动物痘病毒亚科猪痘病毒属的唯一成员。猪是SPV唯一的天然宿主，其他动物均不被SPV感染。猪感染SPV后可出现猪痘症状，目前该病在全世界范围内流行。SPV只在表皮角质形成细胞中增殖，皮肤以外的其他组织很少受到影响，并且通常病变较轻微。由于SPV能够同时刺激免疫动物的体液免疫反应以及细胞免疫反应，并且具有基因组容量大以及生物安全性高等优点，故常作为载体被用于兽用疫苗研发。

猪痘病毒(SPV)作为兽用疫苗表达载体，具有以下优点：(1)SPV基因组容量大，至少能容纳20kb外源基因的***，适合开发多价或多联疫苗。(2)重组SPV载体疫苗有多种免疫途径，包括喷雾免疫和经口免疫，可降低劳动强度，同时避免因疫苗接种导致的应激反应。(3)SPV只感染猪，具有严格的宿主特异性，此外，SPV的复制发生在细胞质内，避免了病毒基因组整合到宿主细胞染色体中的可能，生物安全性高。由于SPV作为疫苗载体有上述优点，因此适合用于兽用新型活载体疫苗的研发。

从临床分离的SPV野生毒株对猪具有一定的致病力，因此不能直接作为疫苗载体，需要对其进行致弱，降低其毒力，以保证猪痘病毒载体疫苗的安全性。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种基因缺失的无毒猪痘病毒及其应用，所述无毒猪痘病毒是一株SPV009基因缺失的无毒猪痘病毒，该病毒可作为疫苗表达载体用于其他动物疫病的活载体疫苗的研制，减少养殖业的经济损失。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基因缺失的无毒猪痘病毒，所述无毒猪痘病毒是野生猪痘病毒的SPV009基因缺失病毒，所述SPV009基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，所述无毒猪痘病毒相对于野生猪痘病毒的全长序列缺失了第6918-7385位核苷酸。

本发明还提供了一种猪痘病毒疫苗，其含有所述的基因缺失的无毒猪痘病毒。

优选的，所述的猪痘病毒疫苗，可以与其他疫苗制成联合疫苗。

进一步的，本发明提供了所述基因缺失的无毒猪痘病毒的制备方法，通过基因工程手段将野生猪痘病毒的SPV009基因缺失，以制备基因缺失的无毒猪痘病毒。

优选的，所述基因缺失的无毒猪痘病毒的制备方法，包括以下步骤：

(1)以野生猪痘病毒基因组为模板，用引物分别PCR扩增SPV009基因的左、右同源重组交换臂LF和RF；

(2)以pEGFP-N1质粒为模板，用引物通过PCR方法扩增出绿色荧光蛋白筛选标记基因gfp；

(3)以pUC19质粒为骨架，通过酶切连接方法，依次***左、右同源重组交换臂LF和RF以及绿色荧光蛋白筛选标记基因gfp，得到猪痘病毒SPV009基因缺失载体pUCLGR；

(4)用载体pUCLGR质粒进行转染细胞，孵育，培养，重复筛选纯化，即得到纯化的SPV009基因缺失猪痘病毒

技术效果：相对于现有技术，本发明经过大量试验成功构建了SPV009基因缺失的猪痘病毒，该病毒对猪安全无毒，可作为疫苗表达载体用于其他动物疫病的活载体疫苗的研制，减少养殖业的经济损失。

附图说明

图1：猪痘病毒009基因缺失载体pUCLGR示意图及其酶切鉴定；其中，A：猪痘病毒009基因缺失载体pUCLGR示意图；B：酶切鉴定。1：DL5000 DNA Marker；2：EcoR I/Hind III双酶切鉴定。

图2：显微镜观察SPV009基因缺失猪痘病毒SPV△009。A：普通倒置显微镜拍照；B：荧光显微镜拍照。

图3：SPV009基因缺失猪痘病毒SPV△009的PCR鉴定。M：DL5000 DNA Marker；A：猪痘病毒野毒NT15株可扩增出2647bp的目的条带；B：SPV009基因缺失的猪痘病毒SPV△009只能扩增出748bp的目的条带。

图4SPV△009注射仔猪后所诱导IFN-γ、IL-4等细胞因子表达水平检测；其中，A：IFN-γ定量检测；B：IL-4定量检测。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例

1 SPV009基因缺失猪痘病毒的构建

1.1猪痘病毒009基因缺失载体的构建

以猪痘病毒临床分离毒株NT15株(南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室提供)基因组为模板，用引物LF1/LF2和RF1/RF2分别PCR扩增009基因的左、右同源重组交换臂LF和RF。以pEGFP-N1质粒为模板，用引物GFP1/GFP2通过PCR方法扩增出绿色荧光蛋白筛选标记基因gfp。以pUC19质粒(Takara)为骨架，通过酶切连接方法，依次***左、右同源重组交换臂LF和RF以及绿色荧光蛋白筛选标记基因gfp，得到猪痘病毒009基因缺失载体pUCLGR(图1)。猪痘病毒009基因缺失载体pUCLGR经EcoR I/Hind III双酶切鉴定及基因测序鉴定正确后，用于后续试验。

表1本研究所用到的引物。

斜体＝限制性酶切位点。

1.2 SPV009基因缺失猪痘病毒的构建

将PK15细胞培养于6孔细胞培养板中，待长成单层细胞后，加入0.01感染复数(MOI)的猪痘病毒NT15株对细胞进行感染，37℃孵育2h后，用pUCLGR质粒进行转染，具体操作步骤按照转染试剂Lipofectamine 2000的说明书进行，转染后3d将细胞培养物冻融两次后收集培养液。将收集的培养液接入6孔细胞板中的PK15单层细胞，进行新一轮的感染，37℃孵育2h后，弃去孔中的细胞培养液，加入含1.5％甲基纤维素的DMEM细胞培养液，继续培养3-5d。在荧光显微镜中观察到的绿色荧光噬斑即为SPV009基因缺失猪痘病毒(图2)。在荧光显微镜下，用200μL微量移液器挑取含绿色荧光的细胞，冻融2次后再次接种PK15单层细胞。重复10轮筛选纯化后，可得到纯化的SPV009基因缺失猪痘病毒，命名为SPV△009。用引物SPV1/SPV2对该猪痘病毒进行PCR鉴定，猪痘病毒野毒NT15株可扩增出2647bp的目的条带，而SPV009基因缺失的猪痘病毒SPV△009只能扩增出748bp的目的条带(图3)。

2体外增殖能力检测以及遗传稳定性检测

对SPV009基因缺失猪痘病毒SPV△009进行体外增殖能力进行检测。用0.01MOI的病毒感染PK15、Vero和MDBK等细胞，37℃孵育2h，中间摇动3次，弃去感染液，加入含2％胎牛血清的DMEM细胞培养液，继续培养至70％细胞发生病变(约72h)，将细胞反复冻融2次，收集细胞培养液，测定SPV△009的培养滴度。将收集的细胞培养液，再次接种同种细胞，进行连续传代，每隔10代取样，分别测定细胞培养液中SPV△009的培养滴度，并进行全基因组测序，以评价其遗传稳定性。结果表明SPV△009只能在猪源细胞系(PK15、ST)中稳定增殖，在其他种属来源的细胞系(Vero、HeLa等)中均不能增殖，仅发生一过性感染(表2)。

表2重组猪痘病毒SPV△009在不同细胞中的培养滴度(TCID₅₀/log₁₀)。

^*ND＝未检测到病毒。

3毒力评价

选取45头一月龄长白猪，随机分为3组，每组15头。前2组分别用SPV△009株以及NT15株进行皮肤穿刺接种，第3组只注射生理盐水，作为阴性对照。每种病毒分别以1.0×10⁷TCID₅₀、1.0×10⁶TCID₅₀、1.0×10⁵TCID₅₀、1.0×10⁴TCID₅₀和1.0×10³TCID₅₀剂量进行接种，2mL/头，每个剂量分别接种3头猪。每隔8h观察猪皮肤表面症状，评估SPV△009的毒力。试验结果表明(表3)，所有SPV△009注射组猪的体温、饮食以及精神状态均正常，与阴性对照组(注射PBS)相比无显著差异。而1.0×10⁴TCID₅₀以上剂量的NT15株注射组仔猪，注射后5d左右注射部位皮肤出现直径约2-3mm的痘疹，16d内全部结痂脱落，除此之外未出现其他症状。根据Reed-Muench方法计算可知，NT15株对仔猪的半数感染量(median infectivedose,ID₅₀)约为1.9×10⁵TCID₅₀。而1.0×10⁷TCID₅₀剂量的SPV△009仍然不会导致接种仔猪发生猪痘症状。与NT15株相比，SPV△009的毒力下降至少50倍。

表3重组猪痘病毒SPV△009对仔猪的毒力检测。

4细胞因子检测

机体的获得性免疫应答主要是由Th1型和Th2型T细胞亚群诱导的。Th1型T细胞分泌IFN-γ和IL-2等细胞因子，主要诱导细胞免疫反应以及炎症反应；而Th2型T细胞分泌IL-4和IL-10等细胞因子，主要诱导体液免疫反应。采集注射后第10d、20d的试验猪血清，用ELISA试剂盒检测SPV△009株以及NT15株接种猪血清中的IFN-γ和IL-4细胞因子水平，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，根据相应的标准曲线进行计算。结果表明(图4)，SPV△009免疫仔猪后所诱导的IFN-γ、IL-4等细胞因子的表达水平显著高于野生毒株NT15免疫组。表明缺失SPV009基因后，猪痘病毒所诱导的细胞免疫及体液免疫水平均显著升高，该重组猪痘病毒SPV△009载体具有巨大的研发潜力。

综上所述，本专利所涉及的SPV009基因缺失的猪痘病毒SPV△009对猪安全无毒，能够诱导动物体内产生较高水平的细胞免疫以及体液免疫应答，可作为疫苗表达载体用于其他动物疫病的活载体疫苗的研制，减少养殖业的经济损失。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种基因缺失的无毒猪痘病毒及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 468

<212> DNA

<213> 猪痘病毒009(SPV009)

<400> 1

atggatcctg tttgttggat atgtaaagac gactacagta ttgaaaagaa ttattgtaac 60

tgtaagaacg agtataaagt tgtacacgat gaatgtatga aaaagtggat acaatactca 120

agggaacgat cttgtaaatt atgtaataag gaatataaca tcattagtgt tagaaaacca 180

ttctcacagt gggtattctc cattaaagat tgcaaaaagt cagcaatttt gtacgctact 240

ctattcttat gtacgttcat tatatcgctt gttttaacta gaattaatat aacaaagata 300

atagatacat caaaaaatga tgtttcattt aagctggtta cgatggtatt ctacttatta 360

ccatttgtca taacttgtat atcgttcata acgctgatag tttatctata taaatattgt 420

aagatttccg ctaaaaacaa cacatacgat acgatttatg aactttaa 468

Claims (5)

1.一种基因缺失的无毒猪痘病毒，其特征在于，所述无毒猪痘病毒是野生猪痘病毒的SPV009基因缺失病毒，所述SPV009基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种猪痘病毒疫苗，其特征在于，其含有权利要求1所述的基因缺失的无毒猪痘病毒。

3.根据权利要求2所述的猪痘病毒疫苗，其特征在于，与其他疫苗制成联合疫苗。

4.权利要求1所述的基因缺失的无毒猪痘病毒的制备方法，其特征在于，通过基因工程手段将野生猪痘病毒的SPV009基因缺失，以制备基因缺失的无毒猪痘病毒。

5.根据权利要求4所述的基因缺失的无毒猪痘病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以野生猪痘病毒基因组为模板，用引物分别PCR扩增SPV009基因的左、右同源重组交换臂LF和RF；

(2)以pEGFP-N1质粒为模板，用引物通过PCR方法扩增出绿色荧光蛋白筛选标记基因gfp；

(3)以pUC19质粒为骨架，通过酶切连接方法，依次***左、右同源重组交换臂LF和RF以及绿色荧光蛋白筛选标记基因gfp，得到猪痘病毒SPV009基因缺失载体pUCLGR；

(4)用载体pUCLGR质粒进行转染细胞，孵育，培养，重复筛选纯化，即得到纯化的SPV009基因缺失猪痘病毒。

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