CN112618546A

CN112618546A - Pad4抑制剂在制备放射治疗增敏药物方面的应用

Info

Publication number: CN112618546A
Application number: CN202011528435.5A
Authority: CN
Inventors: 陈昊
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112618546B

Abstract

本发明提供了一种PAD4抑制剂在制备放射治疗增敏药物方面的应用，优选的，所述PAD4抑制剂为GSK484。通过本发明的实验结果证实，通过使用PAD4抑制剂——GSK484作用于鼻咽癌肿瘤细胞，它能够抑制mTOR信号通路，从而抑制肿瘤细胞增殖，PAD4通过调控p21的活性，从而影响mTOR信号通路，最终增加鼻咽癌肿瘤细胞的对放射的敏感性。

Description

PAD4抑制剂在制备放射治疗增敏药物方面的应用

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其是PAD4抑制剂在制备放射治疗增敏药物方面的应用。

背景技术

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种好发于东南亚地区及我国南方各省的常见恶性肿瘤。放射治疗是目前鼻咽癌的主要治疗方法，而鼻咽癌放疗后局部残余病灶复发及远处转移是制约其疗效和预后的瓶颈，而其中放射抗拒是导致鼻咽癌常规放疗后局部复发、远处转移的重要原因，解决放射抗拒的常用方法为采用放射增敏剂，以增强肿瘤组织对放射治疗的放射敏感性，因此,寻找一种高效、快速、准确的放射增敏剂对改善放射疗效具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种PAD4抑制剂在制备放射治疗增敏药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

PAD4抑制剂在制备放射治疗增敏药物方面的应用。

进一步的，所述PAD4抑制剂为GSK484。

进一步的，所述放射治疗为鼻咽癌放射治疗。

本发明还提供了一种放射治疗增敏药物，由PAD4抑制剂和药学上可接受的盐/药学上可接受的载体组成。

在肿瘤细胞中有两个主要的表观遗传学改变，一个是组蛋白修饰，另一个是DNA甲基化，而精氨酸脱亚氨酶4(peptide arginine deiminase 4，PAD4)正是组蛋白修饰过程中一个关键的酶，它在许多的人类肿瘤中都出现过表达。经过实验研究表明：在放射抗拒的鼻咽癌组织和细胞中，PAD4的表达较放射敏感的鼻咽癌组织和细胞明显增高，而在鼻咽癌细胞中 PAD4的表达水平能够明显影响p21的表达水平，已有研究证实，p21的活性与肿瘤细胞的放射敏感性有非常密切的联系。

雷帕霉素机能靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是一个调控细胞周期、生长和增殖的丝氨酸/苏氨酸激酶，同时也是控制细胞自噬的关键蛋白。mTOR可通过控制蛋白生物合成和核糖体的生物发生来调节细胞的生长和增殖。目前有研究表明，通过抑制mTOR信号通路，能够增加肿瘤细胞的放射敏感性。

通过本发明的实验结果证实，通过使用PAD4抑制剂——GSK484作用于鼻咽癌肿瘤细胞，它能够抑制mTOR信号通路，从而抑制肿瘤细胞增殖，PAD4通过调控p21的活性，p21 作为细胞周期素依赖性激酶抑制因子，它通过作用于周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶复合物及增殖细胞核抗原引起肿瘤细胞生长抑制，从而影响mTOR信号通路，最终抑制mTORC1调控的靶蛋白的磷酸化及其蛋白质的合成。在这个过程中，我们可以通过下调PAD4的表达来激活mTOR信号通路，从而抑制相关蛋白质的合成和促进鼻咽癌细胞凋亡，最终达到增加细胞放射敏感性的目的。对于其他的PAD4的抑制剂，按照同样的原理，也能最终增加鼻咽癌肿瘤细胞的对放射的敏感性。

附图说明

图1是放射敏感组织和放射抗拒组织的western blot测定图。

图2是放射敏感组织和放射抗拒组织的PAD4表达水平示意图。

图3是鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE2R和鼻咽癌放射敏感细胞株CNE2在不同照射剂量下的细胞存活率示意图。

图4是CNE2细胞和CNE2R细胞在0-8Gy照射后的集落形成示意图。

图5是CNE2细胞和CNE2R细胞在0-8Gy照射后的细胞存活率示意图。

图6a是CNE2R和CNE2在X线不同照射时间处理后的western blot测定图；图6b是CNE2R和CNE2在X线不同照射强度处理后的western blot测定图。

图7a表示QPCR检测不同X射线照射下CNE2和CNE2R中PAD4 mRNA表达变化示意图。图7b表示QPCR检测4Gy的X射线照射后不同时间CNE2和CNE2R中PAD4mRNA 表达变化示意图。

图8是QPCR检测过表达和敲低PAD4后CNE2和CNE2R的PAD4 mRNA表达变化示意图。

图9a为敲低CNE2R中PAD4后蛋白表达的western blot检测图，图9b是过表达CNE2R中PAD4后蛋白表达的western blot检测图，图9c是过表达CNE2中PAD4后蛋白表达的western blot检测图。

图10a是CNE2和CNE2-PAD4-OE(过表达CNE2)细胞0-8Gy照射后的细胞存活率示意图。图10b是CNE2R和CNE2R-PAD4-OE(过表达CNE2R)细胞0-8Gy照射后的细胞存活率示意图。图10c是CNE2R和CNE2R-PAD4-KD(敲低CNE2R)细胞0-8Gy照射后的细胞存活率示意图。图10d是CNE2R、CNE2R-PAD4-KD、CNE2R-PAD4-OE细胞在4GyX射线照射下的细胞存活率示意图。

图11a是CNE2R和CNE2R-PAD4-KD的细胞凋亡示意图，图11b是CNE2和 CNE2R-PAD4-OE的细胞凋亡示意图。

图12a是CNE2和CNE2R-PAD4-OE的细胞周期示意图；图12b是CNE2R和 CNE2R-PAD4-KD的细胞周期示意图。

图13是4Gy放射线分别照射CNE2R、CNE2R-PAD4-KD、CNE2R-PAD4-OE细胞后的克隆细胞示意图。

图14是裸鼠成瘤接受照射后第14天各组裸鼠肿瘤的示意图。

图15是CNE2和CNE2R中PAD4的蛋白表达X线不同照射时间处理后的western blot测定图。

图16是CNE2和CNE2R中PAD4的蛋白表达在X线不同照射时间处理后的p21表达量示意图。

图17是CNE2R、CNE2R-PAD4(-)和CNE2R-PAD4(+)细胞中PAD4和P21的WB 测定图。

图18是CNE2R、CNE2R-PAD4(-)和CNE2R-PAD4(+)细胞中5Gy的X线照射前后 P21的western blot测定图。

图19是CNE2R、CNE2R-PAD4(-)和CNE2R-PAD4(+)细胞中5Gy的X线照射前后 P21的蛋白表达示意图。

图20是CNE2-CK组、CNE2-NC组、CNE2-PAD4组、CNE2-PAD4+P21组在5Gy的X 线照射前后的细胞凋亡示意图。

图21是CNE2-CK组、CNE2-NC组、CNE2-PAD4组、CNE2-PAD4+P21组在5Gy的X 线照射前后的细胞凋亡率示意图(^*p<0.05，^**p<0.01)。

图22是CNE2-CK组、CNE2-NC组、CNE2-PAD4组、CNE2-PAD4+P21组的细胞周期示意图。

图23是CNE2-CK组、CNE2-NC组、CNE2-PAD4组、CNE2-PAD4+P21组的细胞周期数据结果分析图(^*p<0.05，^**p<0.01)。

图24是CNE2和CNE2R中的mTOR、pS65-4EBP1、AKT及磷酸化表达，以及抗凋亡蛋白(Mcl-1、Bcl-2)，凋亡抑制基因Bcl-XL，p-stat3的western blot测定图。

图25是CNE-2R细胞中干扰和过表达PAD4后再PAD4、p21、p-AKT、AKT、p-mTOR、 mTOR的western blot测定图。

图26是CNE2和CNE2R经4Gy照射后的mTOR、3EBP、AKT及磷酸化表达的western blot测定图。

图27是CNE2R照射前后mTOR、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1的mRNA表达水平示意图。

图28是CNE2R梯度照射后的mTOR、AKT及磷酸化表达的western blot测定图。

图29是CNE2R梯度照射后的mTOR的mRNA表达水平示意图。

图30a是sh-mTOR的western blot测定图。

图30b是CNE2R中mTOR敲低后的细胞存活率示意图。

图31a是15μm GSK484药物处理12h、18h、24h后p-p70S6K、p-4EBP1的western blot测定图，图31b是0μm、5μm、10μm、15μm的GSK484药物处理24h后的western blot 测定图。

图32是CNE2R、CNE2R-IR、CNE2R-GSK484、CNE2R-IR+GSK484的细胞存活率示意图。(**P<0.01)

图33是CNE2R经不同照射剂量照射处理后和不同浓度的GSK484处理后的细胞集落形成图。

图34是CNE2R经不同照射剂量照射处理后和不同浓度的GSK484处理后的细胞存活率示意图。(**P<0.01)

图35a是CNE2R空白、单独照射(4Gy)处理的CNE2R、单独GSK484(5μM)处理的CNE2R和5μMGSK484处理+IR 4Gy处理的CNE2R的细胞凋亡示意图；图35b是细胞凋亡率示意图。

图36a是CNE2R空白、单独照射(4Gy)处理的CNE2R、单独GSK484(5μM)处理的CNE2R和5μMGSK484处理+IR 4Gy处理的CNE2R的细胞周期示意图；图36b是细胞周期数据结果分析图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

实施例1

本实施例验证PAD4抑制剂对人鼻咽癌细胞的放射增效效果。

(一)放射敏感组织和放射抗拒组织WB检测PAD4表达水平

1.1实验目的：用WB验证鼻咽癌放疗结束3个月后仍有肿瘤残留(放射抗拒组织)以及放疗后无肿瘤残留的组织(放射敏感组织)提取蛋白的PAD4蛋白表达水平，βactin为内参。

1.2实验材料：

1.2.1试剂

(1)0.45μm PVDF膜：Millipore公司；(2)脱脂奶粉：伊利；(3)彩色预染蛋白分子量标准：Fermentas公司；(4)ECL Plus发光试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、Western及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；(5)Tris-Hcl/SDS(1.5mM， pH 8.8)、Tris-Hcl/SDS(0.5mM，pH 6.8)购自上海生工生物工程有限公司；(6)30％ Acrylamide/Bis solution，甘氨酸购自Bio-Rad公司；(7)Tris碱、SDS、过硫酸铵购自Biosharp 公司；(8)Anti-GAPDH：联科，Mab5465-100；(9)Anti-PAD4：购自abcam，货号ab128086； (10)Goat anti-Mouse：联科，GAM007；(11)Goat anti-Rabbit：联科，GAM0072。

1.2.2相关试剂配制

(1)10％过硫酸铵(AP)：过硫酸胺0.1g，超纯水1.0ml，溶解后，4℃保存，保存时间为一周；(2)电泳缓冲液：Tris(MW 121.14)3.04g，甘氨酸(MW 75.07)14.42g，SDS0.5g，蒸馏水至1000ml；(3)转移缓冲液：甘氨酸(MW 75.07)14.42g，Tris(MW 121.14)3.04g，甲醇200ml，蒸馏水至1000ml；(4)TBST缓冲液：Tris(MW 121.14)1.22g，NaCl2.92g，Tween200.5ml，蒸馏水至1000ml；(5)封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST)：脱脂奶:5g，TBST 缓冲液100ml。

1.2.3WB实验方法

(1)组织总蛋白提取：将各组组织样品收集样品到1.5EP管中，每管中加入200μlWestern 及IP裂解液(使用前加入PMSF，终浓度1mM)，混匀后4℃充***解30分钟，4℃离心机、 12000rpm离心处理样品，分别取上清液储存；

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳

表1.1.1 10％分离胶和4％浓缩胶的配制

制胶：清洗干净玻璃板，固定在支架上，在玻璃板之间灌入按上表配制的10％的分离胶，立即用异丙醇封闭表面，于室温下聚合。当异丙醇与分离胶层之间出现明显界面时，表示分离胶的聚合已完成。弃去异丙醇，用滤纸吸干，再灌入4％的浓缩胶，***梳子，待胶凝固后，小心拔去梳子，备用。上样前样品的处理：加入5×上样缓冲液混匀，100℃放置10min，迅速冰浴中冷却，上样量为每泳道约30μg。在电泳槽内加入电泳缓冲液，接通电源，80V恒压电泳至溴酚蓝跑完浓缩胶层，分离胶120V恒压电泳，当溴酚蓝迁移至分离胶下缘时，关掉电源，停止电泳。

(3)转膜：预先配置1L转移缓冲液并冷却至4℃。先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30s，再在转移缓冲液浸泡10min，后与滤纸、凝胶一起放入电转移缓冲液中。按夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵按顺序放好，小心去除所有气泡，PVDF膜位于阳极侧，凝胶位于阴极侧，***电泳槽中，倒入转膜缓冲液，200mA恒流转移，根据所转蛋白分子量，约1min/kd。

(4)封闭：将PVDF膜浸入含5％脱脂奶粉的封闭液中，置摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。

(5)孵育一抗：取出已封闭的PVDF膜，加入一抗，4℃孵育过夜(PAD4稀释比为1∶500，GAPDH稀释比为1∶2000)。

(6)洗膜：浸于1×TBST缓冲液中，于摇床上洗涤3次，每次10min。

(7)孵育二抗：加入二抗，于室温摇床上孵育1h。

(8)洗膜：将PVDF膜浸于1×TBST缓冲液中，于摇床上洗涤3次，每次10min。

(9)ECL化学发光显影：将PVDF膜置于保鲜膜上，取适量ECL试剂盒中等体积的A 液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。照片以TIFF格式导出。

1.2.4实验结果：检测结果如图1和2所示，其中R表示放射抗拒组织，N表示放射敏感组织，图1是放射敏感组织和放射抗拒组织的western blot测定图，1表示非角化型未分化癌临床I期患者鼻咽癌组织(AJCC第八版分期)，2表示非角化型未分化癌临床II期患者鼻咽癌组织(AJCC第八版分期)，3表示非角化型未分化癌临床III期患者鼻咽癌组织(AJCC第八版分期)，4表示角化型鳞状细胞癌临床II期患者鼻咽癌组织(AJCC第八版分期)，5表示角化型鳞状细胞癌临床III期患者鼻咽癌组织(AJCC第八版分期)。图2是放射敏感组织和放射抗拒组织的PAD4表达水平示意图，放射抗拒组织的PAD4表达水平显著高于放射敏感组织，**P<0.01，差异具有统计学意义。

(二)PAD4对鼻咽癌细胞放射抗拒性的影响

2.1实验目的

检测PAD4与放疗两个因素对细胞的增殖的作用。

2.2材料与试剂

2.2.1实验材料

(1)CNE2(放射敏感组织)、CNE2R(放射抗拒组织)细胞：本实验室保存。(2)1640 培养基：购自GIBCO，货号C11875500BT；(3)血清：购自Gibco公司，货号10099-141；(4)胰蛋白酶Trypsin 0.25％EDTA，货号：25200-072(美国invitrogen公司)。

2.2.3实验试剂

(1)RNA提取试剂盒为动物总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)：上海捷瑞生物工程公司，货号GK3016；(2)逆转录试剂盒为HiScript II Q RT SuperMix for qPCR：南京诺唯赞生物公司，货号R222-01；(3)定量PCR试剂盒为ChamQTM SYBR Color Qpcr Master Mix：南京诺唯赞生物公司，货号Q411-02；(4)氯仿：南京化学试剂有限公司；(5)无水乙醇：上海生工生物工程有限公司；(6)其它试剂均为国产分析纯。

2.3实验步骤

2.3.1细胞培养：CNE2和CNE2R细胞株的培养条件：含10％FBS和1×青链霉素的1640 培养基，37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

2.3.2铺板：取正常培养的处于对数期的CNE2和CNE2R细胞株，1000rpm离心5min，计数板下计数，铺六孔板，每孔3×10⁵个细胞，静置过夜。

2.3.3X射线放疗：次日，CNE-2和CNE-2R细胞分别接受0-8Gy放疗剂量，并在放疗后24h-48h收样，进行qPCR检测。

2.3.4RT-qPCR实验方法

2.3.4.1Trizol-离心柱法提取细胞总RNA

(1)加1mL Trizol裂解细胞。(2)按200μl氯仿/mL Trizol加入氯仿，剧烈振荡混匀30s，然后室温放置5min。(3)台式离心机，11000rpm，4℃离心10min，溶液充分分层。(4)取400μL上清液小心转移到无菌1.5mL RNase-free离心管里。加入200μL无水乙醇，混匀。(5)将上述溶液全部(包括沉淀)转移到套放于2mL收集管内的GenClean柱中，室温放置2min，8000rpm离心1分钟。(6)小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入600μL buffer RWA，8000rpm，室温离心30秒，弃去收集管中的废液。(7)重复步骤6。 (8)小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，11000rpm，室温离心2min。 (9)小心取出柱子，放入无菌RNase-free的1.5mL离心管里，在柱内膜的中央小心加入50μL DEPC-H₂O，65℃放置2min。(10)11000rpm，室温离心2min。收集管内的溶液即为RNA 样品。(H₂O、TE或0.5％SDS均用DEPC处理并高压灭菌。)

2.3.4.2RNA纯度的测定和RNA的定量

以相应溶剂为对照(Blank)，取2μL RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280>2.0且<2.3，则可以满足后续RT-qPCR所需。

2.3.4.3反转录实验

(1)把以下试剂加入到EP管中(总共20μL)：

表1.2.1

混匀，50℃干浴15min。

(2)85℃干浴5s终止反应。

(3)-20℃保存cDNA。按RNA OD值报告所示浓度计算ddH₂O量，将RT产物稀释成一致水平。

2.3.4.4定量PCR扩增

(1)mRNA的引物序列

表1.2.2

(2)mRNA的定量PCR扩增反应体系

表1.2.3

(3)mRNA的定量PCR实验参数

1:95.0℃ for 30s；2:95.0℃ for 10s；3:55.7℃ for 30s for Plate Read；4:GOTO 2,40more times；5:Melt Cure 70℃ to 95℃:Increment 0.5℃ for 5s PlateRead END

2.4实验结果：

2.4.1对鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE2R和鼻咽癌放射敏感细胞株CNE2进行细胞模型放射抗拒性验证，X线不同照射剂t下鼻咽癌CNE2细胞和CNE2R细胞的剂存活曲线，从而验证CNE2R放射抗拒性较CNE2明显。

如下表1.2.4所示，CNE2和CNE2R细胞0-8Gy照射后的细胞存活率数据为：

表1.2.4 CNE2和CNE2R细胞0-8Gy照射后的细胞存活率

将表2.4中的数据制成不同照射剂量下的细胞存活率示意图，如图3所示，CNE2R细胞照射后的存活率显著高于CNE2细胞。

2.4.2对鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE2R和鼻咽癌放射敏感细胞株CNE2进行细胞模型放射抗拒性验证，X线不同照射剂量下鼻咽癌CNE2细胞和CNE2R细胞的集落形成,从而验证CNE2R细胞放射抗拒性较CNE2细胞明显。

如图4所示，为CNE2细胞和CNE2R细胞0-8Gy照射后的集落形成，如图5所示，为CNE2和CNE2R细胞0-8Gy照射后的CNE2细胞和CNE2R细胞克隆数的比较。结合图4和图5所示，CNE2R细胞集落形成能力显著高于CNE2细胞，不同剂量照射后CNE2R细胞集落形成能力显著高于CNE2细胞。

2.4.3检测CNE2R和CNE2在X线不同照射剂量后PAD4的表达，同时对各组细胞进行细胞增殖实验。

(1)WB分别检测0-8Gy照射48h和4Gy照射0-48h后CNE2和CNE2R中PAD4蛋白表达变化，结果分别如图6a和6b所示。

如图所示，随X射线照射剂量增加(0-8Gy)或随照射后时间延长(0-48h)，PAD4在CNE2和CNE2R中的蛋白表达均增加。

(2)QPCR分别检测0-8Gy照射48h和4Gy照射0-48h后CNE2和CNE2R中PAD4 mRNA 表达，结果分别如图7a和7b所示。

如图所示，CNE2和CNE2R中PAD4的mRNA表达在X线照射后均有所增加，均在照射48h后表达量最高。其中，CNE2R中PAD4的mRNA表达较CNE2增高明显。

(四)分别对CNE-2R和CNE-2中的PAD4进行干扰和过表达后，再分别检测各组细胞照射X线前后的PAD4表达水平，同时对各组细胞进行细胞增殖实验，以此验证PAD4在鼻咽癌细胞产生放射抗拒过程中所起的变化及作用。

4.1实验目的：

构建pLVX-IRES-Puro-hPAD4过表达质粒。

4.2实验材料与仪器：

4.2.1基因名称：hPAD4.

4.2.2载体：pLVX-IRES-Puro，抗性：Amp+。

4.2.3实验试剂

(1)DH5α感受态细胞，货号：9057(TAKARA)；(2)T4连接酶，货号：2011(TAKARA)；(3)限制性内切酶EcoR I，货号：1040(TAKARA)；(4)限制性内切酶BamH I，货号： 1010(TAKARA)；(5)高纯度质粒小量中提试剂盒，货号：DP107(北京天根生化有限公司)； (6)琼脂糖凝胶回收试剂盒，货号：DP209(北京天根生化有限公司)；(7)DNA引物合成 (上海捷瑞公司)；(8)DNA测序(上海捷瑞公司)；(9)Qiagen大规模质粒抽提试剂盒(德国Qiagen公司)。

4.2.4实验方法

4.2.4.1hPAD4基因序列合成：根据NCBI查询人hPAD4基因序列，包含1992个碱基，在两端分别加EcoRI和BamHI酶切位点，将序列合成到pLVX-IRES-Puro载体上。

4.2.4.2取1μL合成的质粒转化100μL DH5α感受态细胞：将连接产物与感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃热激45s，立即置冰上放置5min，加入预热至室温的400μL LB培养基，200rpm，37℃恒温摇床培养1h，4000rpm离心3min，弃去400μL培养上清，剩余100 μL用移液器混匀后均匀涂布于含100μg/mL Amp抗性的LB平板上，倒置，37℃恒温培养。

4.2.4.3测序：挑取阳性菌测序。

4.2.4.4质粒提取

取100μL测序正确菌液接种于含10mL，100μg/mL Amp抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用高纯度质粒小量中提试剂盒抽提质粒，用于后续转染实验。

4.4实验结果：

4.4.1QPCR检测过表达CNE2和CNE2R中PAD4后mRNA表达，及敲低CNE2R中PAD4 后mRNA。结果如图8所示，其中，CK表示空白组，NC表示阴性对照组，OE表示过表达组，KD表示敲低组。

过表达和敲低PAD4后,CNE2R中PAD4的mRNA表达水平分别随之增高和下降，由于CNE2中PAD4的本底表达水平较低，无法检测到PAD4敲低后的PAD4 mRNA表达。

4.4.2WB检测过表达CNE2和CNE2R的PAD4后蛋白表达水平及敲低CNE2R的PAD4 后蛋白表达水平。检测结果如图9a、9b、9c所示。图9a为敲低CNE2R中PAD4后蛋白表达的western blot检测图，图9b是过表达CNE2R中PAD4后蛋白表达的western blot检测图，图9c是过表达CNE2中PAD4后蛋白表达的western blot检测图。

过表达和敲低PAD4后,CNE2R的PAD4蛋白表达水平分别随之增高和下降，由于CNE2中PAD4的本底表达水平较低，无法检测到PAD4敲低后的PAD4蛋白表达。

4.2.3使用不同剂量X线分别照射CNE2和过表达PAD4的CNE2-PAD4-OE细胞后，CCK8实验检测细胞存活率。

如下表1.4.1所示，CNE2和CNE2-PAD4-OE(过表达CNE2)细胞0-8Gy照射后的细胞存活率数据为：

表1.4.1CNE2和CNE2-PAD4-OE细胞0-8Gy照射后的细胞存活率

0Gy

1Gy

2Gy

3Gy

4Gy

5Gy

6Gy

7Gy

8Gy

CNE2

100.0±7.2

95.2±8.1

74.2±7.6

61.6±7.8

46.6±6.1

33.9±8.6

24.7±3.0

19.8±3.7

14.1±5.3

CNE2-OE

100.0±8.6

96.6±7.9

87.6±8.2

72.1±7.2

59.0±7.8

46.6±4.5

28.7±4.7

23.0±5.8

17.9±4.6

将表4.1中的数据制成不同照射剂量下的细胞存活率示意图，如图10a所示，过表达PAD4 后细胞存活率较CNE2细胞增加，即上调PAD4可降低CNE2细胞放射敏感性。

4.2.4使用不同剂量X线分别照射CNE2R和过表达PAD4的CNE2R-PAD4-OE细胞后，CCK8实验检测细胞存活率。

如下表4.2所示，CNE2R和CNE2R-PAD4-OE(过表达CNE2)细胞0-8Gy照射后的细胞存活率数据为：

表1.4.2 CNE2R和CNE2R-PAD4-OE细胞0-8Gy照射后的细胞存活率

0Gy

1Gy

2Gy

3Gy

4Gy

5Gy

6Gy

7Gy

8Gy

CNE2R

100.0±5.1

98.0±6.0

96.1±6.1

88.7±6.3

71.6±7.8

58.3±9.1

47.2±6.7

36.6±5.5

29.9±7.0

CNE2R-OE

100.0±8.6

101.8±7.6

99.1±6.0

97.4±6.2

87.0±7.5

77.2±6.8

64.9±8.8

51.5±5.3

41.8±4.5

将表4.2中的数据制成不同照射剂量下的细胞存活率示意图，如图10b所示，过表达PAD4 后细胞存活率较CNE2R细胞增加，即上调PAD4可降低CNE2R细胞放射敏感性。

4.2.5使用不同剂量X线分别照射CNE2R和降低表达PAD4的CNE2R-PAD4-KD细胞后，CCK8实验检测细胞存活率。

如下表1.4.3所示，CNE2R和CNE2R-PAD4-KD(敲低CNE2)细胞0-8Gy照射后的细胞存活率数据为：

表1.4.3 CNE2R和CNE2R-PAD4-KD细胞0-8Gy照射后的细胞存活率

0Gy

1Gy

2Gy

3Gy

4Gy

5Gy

6Gy

7Gy

8Gy

CNE2R

100.0±5.2

98.8±6.3

95.5±4.8

87.7±5.3

70.8±4.2

57.2±7.7

49.0±6.0

37.4±5.2

26.4±4.4

CNE2R-KD

100.0±9.3

93.4±4.4

85.5±4.6

73.2±4.7

45.1±4.9

38.9±8.8

21.5±5.1

15.3±4.7

11.1±4.7

将表1.4.3中的数据制成不同照射剂量下的细胞存活率示意图，如图10c所示，敲低PAD4 后CNE2R-PAD4-KD细胞存活率较CNE2R细胞降低，即下调PAD4可增加CNE2R细胞放射敏感性。

4.2.6敲低(KD)和过表达(OE)CNE2R中的PAD4再进行4Gy照射，CCK8实验检测包括CNE2R在内的各组细胞存活率。

如下表1.4.4所示：

表1.4.4CNE2R、CNE2R-PAD4-KD、CNE2R-PAD4-OE细胞4Gy照射后的细胞存活率

CNE2R、CNE2R-PAD4-KD、CNE2R-PAD4-OE细胞，4Gy vs.0Gy，**P<0.01

将表1.4.4中的数据制成4GyX射线照射下的细胞存活率示意图，如图10d所示，CNE2R-PAD4-KD细胞的放射敏感性最高，其次为CNE2R细胞，CNE2R-PAD4-OE细胞的放射敏感性最低。说明下调PAD4可增加CNE2R细胞放射敏感性，而上调PAD4可降低 CNE2R细胞的放射敏感性。

(五)分别对CNE-2R和CNE-2中的PAD4进行干扰和过表达后，检测各组细胞的细胞凋亡和细胞周期。

5.1实验目的

检测各组CNE-2R、CNE-2细胞凋亡的影响。

5.2实验材料及试剂

5.2.1实验材料：

CNE-2R、CNE2细胞：本实验室保存。

5.2.2实验试剂：

1640培养基：GIBCO，货号C11875500BT；胎牛血清：GIBCO，货号10099-141；细胞凋亡试剂盒：杭州联科生物公司，货号70-AP101-100；胰蛋白酶(Trypsin)：GIBCO，货号27250-018。

5.3实验方法：

5.3.1细胞培养:细胞的培养条件：含10％FBS和1×青链霉素的1640培养基，37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中培养。

5.3.2铺板:取正常培养的处于对数期的细胞，PBS洗2遍后用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化3-5min，计数板下计数，铺6孔板，每孔均加入5×104细胞细胞静置过夜后进行后续检测。

5.3.3检测细胞凋亡:消化、离心收集细胞，1×PBS洗涤细胞1次(2000rpm，离心时间 5min收集细胞)，用100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，在细胞悬浮液中加入5μLAnnexin V-FITC和10μL PI，并设置单染管，轻轻混匀后于4℃避光条件下孵育5min，再补加1×Binding Buffer至500μL，上机检测。

5.4实验结果

5.4.1敲低CNE2R细胞中PAD4和过表达CNE2细胞中PAD4后的细胞凋亡

结果如图11a和11b所示。图11a是CNE2R和CNE2R-PAD4-KD的细胞凋亡示意图，图11b是CNE2和CNE2R-PAD4-OE的细胞凋亡示意图。

结果显示，在CNE2R细胞中，下调PAD4，细胞凋亡增加；在CNE2细胞中，上调PAD4，细胞凋亡减少。

5.4.2敲低CNE2R细胞中PAD4和过表达CNE2细胞中PAD4后的细胞周期

结果如图12a和12b所示。图12a是CNE2和CNE2R-PAD4-OE的细胞周期示意图；图12b是CNE2R和CNE2R-PAD4-KD的细胞周期示意图。

结果显示，在CNE2细胞中，上调PAD4，S期细胞比例增加；在CNE2R细胞中，下调PAD4，S期细胞比例减少。

(六)敲低CNE2R细胞中PAD4和过表达CNE2R细胞中PAD4后进行4Gy照射的细胞克隆形成实验。

6.1实验目的：

克隆形成实验检测不同处理CNE2R细胞的克隆形成能力。

6.2实验材料与试剂：

6.2.1实验材料：CNE2R细胞不同处理组的细胞。

6.2.2实验试剂：CNE2R细胞：公司细胞库；1640培养基：GIBCO，货号C11875500BT；血清：BI公司，货号04-001-1ACS；结晶紫：sigma公司，货号C6158-100G；其余试剂均为国产分析纯。

6.2.3实验方法：

6.2.3.1细胞培养及给药：

(1)细胞培养：细胞株的培养条件：含10％FBS和1×青链霉素的1640培养基，37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。

(2)铺板：取正常培养的处于对数期的细胞株，1000rpm离心5min，计数板下计数，铺6孔板，每孔5×104个细胞，静置8～12h待细胞贴壁。

(3)放疗：放疗剂量为4gy，放疗48h后收样进行后续检测。

(4)克隆形成能力检测：取各组细胞，用0.25％Typsin+0.02％EDTA消化，1500rpm离心5min，计数板计数，用2％FBS+1×P.S.1640培养基重悬，梯度倍比稀释至100个/mL，铺6孔板，200个/2mL/孔，连续培养14～16天；用4％多聚甲醛室温固定15min，再用1×PBS 清洗3次，加入结晶紫染色15min，用1×PBS清洗3次，置于室温下风干，拍照计数克隆数。结果如图13所示。4Gy放射线照射CNE2R细胞后，下调PAD4，细胞集落形成较对照组明显减少；上调PAD4后细胞集落形成较对照组明显增加。

(七)将低表达PAD4的人鼻咽癌放射抗拒细胞(CNE2R-PAD4kd)和鼻咽癌放射抗拒细胞(CNE2R)分别于皮下接种在裸鼠上，成瘤后使用2Gy的X线照射前后对比，在裸鼠鼻咽癌模型上进一步证实PAD4基因对鼻咽癌放射敏感性产生的作用。

7.1实验方法

将常规培养的CNE2R细胞以1×10⁷个细胞/鼠的密度接种于体重大约为20g左右的裸鼠的腹股沟皮下，当肿瘤大小达到100mm³左右时，检疫合格后，将小鼠随机分成4组：对照组(CNE2R)、对照放疗组(CNE2R+2Gy)、PAD4低表达组(CNE2R-PAD4kd)、PAD4低表达放疗组(CNE2R-PAD4kd+2Gy)。需放疗裸鼠给予2Gy/d连续5天的放射剂量，第14天取瘤测量体积(体积大小按照公式V＝π/6×L×W²来计算)。Tomayko M M，Reynolds C P.Determination ofsubcutaneous tumor size in athymic(nude)mice[J].Cancer Chemotherapy andPharmacology，1989，24(3)：148-154.

7.2实验结果

7.2.1肿瘤大小的结果如表1.7.1和图14所示：

表1.7.1裸鼠成瘤接受照射后第14天各组裸鼠肿瘤的体积

组别	肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)
		对照组(CNE2R)	571.61±15.72
对照放疗组(CNE2R+2Gy)	365.90±21.48*
		PAD4低表达组(CNE2R-PAD4kd)	406.25±37.91*
PAD4低表达放疗组(CNE2R-PAD4kd+2Gy)	242.88±32.91**

注：与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果：在放射线照射的情况下，低表达PAD4的人鼻咽癌放射抗拒细胞(CNE2R-PAD4kd) 成瘤较鼻咽癌放射抗拒细胞(CNE2R)明显减小，低表达PAD4后放射敏感性显著提高。

7.2.2对各组裸鼠体重的影响的试验结果如表1.7.2所示：

表1.7.2对各组裸鼠体重的影响

注：与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果：各组和对照组相比裸鼠体重无明显差距(p>0.05)。

实施例2：PAD4调控P21对鼻咽癌放射抗拒性的影响

(一)CNE2和CNE2R照射4Gy的X射线后不同时间段检测p21的表达

1.1WB实验检测CNE2和CNE2R照射4Gy的X射线后不同时间段的p21蛋白表达

结合图15的结果显示：CNE2和CNE2R中PAD4的蛋白表达在X线照射后随时间延长均有所增加，CNE2在照射24h后表达量最高，CNE2R在照射48h后表达量最高。

1.2QPCR检测CNE2和CNE2R照射4Gy的X射线后不同时间段p21的mRNA表达水平

结合图16的结果显示：CNE2和CNE2R中PAD4的mRNA表达在X线照射后随时间延长均有所增加，CNE2在照射24h后表达量最高，CNE2R在照射48h后表达量最高。

(二)应用慢病毒转染构建出PAD4稳定上调表达的CNE2R-PAD4(+)鼻咽癌细胞和PAD4稳定下调表达的CNE2R-PAD4(-)鼻咽癌细胞，分别检测在CNE2R、CNE2R-PAD4 (+)和CNE2R-PAD4(-)细胞中P21的表达。

WB实验检测CNE2R、CNE2R-PAD4(-)和CNE2R-PAD4(+)细胞中PAD4和P21的蛋白表达。

结合图17的结果显示：当下调CNE2R中的PAD4表达时，p21的表达增加；当上调CNE2R 中的PAD4表达时，p21的表达减少。

(三)分别干扰CNE2R-PAD4(-)细胞和上调CNE2R-PAD4(+)细胞中P21的表达后，以CNE2R细胞为对照组，使用X线照射前后，检测各组细胞中P21的表达。

WB实验检测CNE2R、CNE2R-PAD4(-)和CNE2R-PAD4(+)细胞中5Gy的X线照射前后P21的蛋白表达。

结果：在5Gy的X线照射48h后，CNE2R、CNE2R-PAD4(-)和CNE2R-PAD4(+) 细胞中5Gy的X线照射前后P21的蛋白表达

(四)检测CNE2、CNE2-PAD4-OE细胞在感染P21过表达病毒之后对放疗的敏感性，考察PAD4、P21和放疗三个因素对细胞凋亡的影响(无照射及5Gy的X线照射)。

CNE2-CK组：正常CNE2细胞组；

CNE2-NC组：稳定株对照细胞组；

CNE2-PAD4组：PAD4过表达稳定株未处理组；

CNE2-PAD4+P21组：PAD4过表达稳定株感染P21过表达病毒组。

凋亡结果的代表图片如图20所示。

细胞凋亡率分析如表2.1所示：

表2.1：细胞凋亡率分析(％)

	0Gy	5Gy
			CNE2-CK	8.74％±1.51	25.93％±5.34
CNE2-NC	10.44％±0.69	27.78％±1.40
			CNE2-PAD4+	15.61％±0.99	33.09％±1.78
CNE2-PAD4+P21+	21.12％±0.95	39.15％±0.69

结合图20和图21的结果显示：放疗能够促进细胞凋亡，下调PAD4和上调P21均能够增加细胞对放疗的敏感性。

细胞凋亡周期结果如图22所示，细胞凋亡率分析如表2.2所示：

表2.2各组细胞周期分析(％)

组别	G1期％	S期％	G2期％
				CNE2-CK 0Gy	38.87±1.29	26.47±1.20	34.37±2.29
CNE2-NC 0Gy	41.30±17.45	24.03±6.31	33.23±8.68
				CNE2-PAD4+0Gy	42.13±20.90	40.73±20.93	13.41±6.92
CNE2-PAD4+P21+0Gy	45.13±15.53	28.67±4.37	23.87±7.39
				CNE2-CK 5Gy	7.68±7.13	0.00±0.00	0.00±0.00
CNE2-NC 5Gy	36.27±24.32	40.53±23.53	18.27±22.22
				CNE2-PAD4+5Gy	54.20±6.33	21.97±0.21	25.80±7.20
CNE2-PAD4+P21+5Gy	43.63±13.15	32.07±18.23	21.69±18.27

各组细胞周期数据(％)如图23所示。

小结：CNE2-CK 5Gy组无法测得周期分布，所得数据不可信，将数据按照“0.00”进行分析。PAD4在放疗中的引起细胞G1期阻滞，而P21能够部分逆转此作用。

实施例3PAD4调控p21在mTOR信号通路的作用机制

(一)检测CNE2和CNE2R中的mTOR、pS65-4EBP1、AKT及磷酸化表达，以及抗凋亡蛋白(Mcl-1、Bcl-2)，凋亡抑制基因Bcl-XL，p-stat3的表达。结果如图24所示。

(二)在CNE-2R细胞中分别干扰和过表达PAD4，分别检测PAD4、p21、p-AKT、AKT、 p-mTOR、mTOR的表达。结果如图25所示。

(三)CNE2和CNE2R经4Gy照射后的mTOR、3EBP、AKT及磷酸化表达。结果如图 26所示。

(四)CNE2R照射前后mTOR、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1的qpcr。

结果如图27所示，4Gy照射后，CNE2R中mTOR、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1的mRNA表达均升高。

(五)CNE2R梯度照射后的mTOR、AKT及磷酸化表达。

结果如图28所示，结果显示：0-8Gy射线照射后，p-mTOR、p-AKT水平逐渐升高。

(六)CNE2R梯度照射后的mTOR的QPCR。

结果如图29所示，结果显示：0-8Gy射线照射，mTOR的mRNA表达逐渐升高。

(七)在实验组的CNE-2R细胞中下调mTOR，以CNE-2R细胞为对照组，同时用不同剂量的X线进行照射，进行细胞增殖实验。

如图30a所示，为sh-mTOR的WB验证，如图30b所示，为CNE2R中mTOR敲低后的细胞存活率，相应照射剂量下，mTOR-shRNA组vs.ctrl组，^**P<0.01。结果显示：敲低 CNE2R细胞中mTOR表达，经照射后细胞存活率下降，即下调mTOR可增加CNE2R细胞的照射敏感性。

实施例4验证GSK484对人鼻咽癌细胞的放射增效效果。

(一)CNE2R细胞经GSK484药物处理后的p-p70S6K、p-4EBP1的WB检测PAD4表达水平。

将GSK484(15μM)加入CNE2R细胞中培养24小时后收集细胞，western blot检测p-p70S6K、p-4EBP1的表达，检测结果如图31a、31b所示。图31a是15μmGSK484药物处理12h、18h、24h后p-p70S6K、p-4EBP1的western blot测定图，图31b是0μm、5μm、 10μm、15μm的GSK484药物处理24h后的western blot测定图。

在CNE2R细胞中，GSK484可抑制p-p70S6K、p-4EBP1，并呈现时间和剂量依赖性。

(二)对CNE2R、单独照射(不同照射强度梯度)处理的CNE2R、单独GSK484(不同浓度梯度)处理的CNE2R和5μMGSK484处理+照射(不同照射强度梯度)处理的CNE2R 进行细胞模型放射抗拒性验证。

将对应浓度的GSK484加入CNE2R细胞中培养24小时后收集细胞，并进行相应的照射处理，检测结果见表4.1。

表4.1CNE2R、CNE2R-IR、CNE2R-GSK484、CNE2R-IR+GSK484的细胞存活率表

将表4.1中的数据制成不同照射剂量下的细胞存活率示意图，如图32所示，2-8Gy的照射可降低CNE2R(鼻咽癌放射抗拒细胞)细胞存活率，3-10μM的GSK484可降低CNE2R 细胞存活率，照射联合GSK484降低CNE2R细胞存活并具有协同作用。

(三)CNE2R(鼻咽癌放射抗拒细胞)经不同照射剂量照射处理后和不同浓度的GSK484 处理后，以及不同照射剂量+不同浓度的GSK484联合处理后，进行细胞模型放射抗拒性验证，检测鼻咽癌CNE2细胞的集落形成。结果如图33所示。

结合图34所示，2-8Gy的照射可降低CNE2细胞落形成；5和10μM的GSK484可降低CNE2细胞集落形成；照射联合GSK484可降低CNE2细胞存活率并具有协同作用。

(四)CNE2R细胞照射+GSK的细胞凋亡

CNE2R、单独照射(4Gy)处理的CNE2R、单独GSK484(5μM)处理的CNE2R和5 μMGSK484处理+IR 4Gy照射处理的CNE2R的细胞凋亡试验。试验方法同实施例1的5.3。

结合图35a和35b(各处理组vs.ctrl组，^**P<0.01)所示，4Gy照射诱导CNE2R细胞凋亡；5μM的GSK484诱导细胞凋亡；4Gy照射联合5μM的GSK484诱导CNE2R细胞凋亡并具有协同作用。

(五)CNE2R细胞照射+GSK的细胞周期

结合图36a和36b(各处理组vs.ctrl组，^**P<0.01)所示，4Gy照射诱导CNE2R细胞凋亡；5μM的GSK484诱导细胞凋亡；4Gy照射联合5μM的GSK484诱导CNE2R细胞凋亡并具有协同作用。

Claims

1.PAD4抑制剂在制备放射治疗增敏药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PAD4抑制剂为GSK484。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述放射治疗为鼻咽癌放射治疗。

4.一种放射治疗增敏药物，其特征在于：由PAD4抑制剂和药学上可接受的盐/药学上可接受的载体组成。