CN112617183A - 一种基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，包括以下步骤：（1）固相微生物柱胁迫发酵；（2）膜分离
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；（3）固相酶柱降解；（4）膜分离

Description

一种基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法
技术领域
本发明涉及一种免疫调节组合物的制备方法，具体是一种免疫调节组合物的连续化制备方法。
背景技术
微生物的逆境胁迫应激反应是指当外界环境发生变化时，微生物会产生复杂的生理反应，通过蛋白质复合物的重组或依靠信号转导***的磷酸化等代谢产物的改变，来适应各种各样的微生态环境的变化。当细胞处于多种环境胁迫时，由一种适应性反应表达所诱导的交互作用，对细胞的生存很有利。微生物在利于其生存的条件下(例如丰富的营养、适宜生长的温度，pH值，渗透压以及氧化还原电势等)，会尽可能地阻遏冗余或非必需蛋白的表达，加速合成生长必需的细胞组分；当生存环境不利于其生存时(例如不适合生长的物化条件、营养不足等)，即在胁迫环境条件下，微生物会将用于生长的资源转而用于合成那些可以抵御压力环境，修复损伤的蛋白。
在逆境胁迫条件下发生的应激反应，不仅可以保护微生物自身不受或者减少胁迫影响，同时也能使微生物分泌具有一定特殊功能的代谢产物。研究发现，乳酸菌在各种胁迫环境下具有自我调控能力，并通过各种生理反应诱导不同数目的蛋白质来适应不利环境。如通用应激蛋白、参与代谢的各种蛋白以及胁迫诱导的特定应激蛋白。其中已研究表明通用应激蛋白可以参与DNA或蛋白质的修复，如侣伴蛋白（DnaK，GroEL，GroES）或蛋白酶 （Clp蛋白酶等)；研究也表明，微生物应激反应的代谢产物，具有激活巨噬细胞释放细胞因子，提高白细胞介素水平和调节免疫细胞分化抗原水平等，对免疫***调节具有一定的作用。
目前，关于逆境胁迫发酵方法，文献已经有所报道。
CN102162001A公开了一种厌氧发酵丙酮丁醇梭菌产丁醇的方法,其是通过胁迫环境发酵促进合成丁醇。CN111053789A公开了一种调节免疫***的方法和组合物，其是通过胁迫环境发酵从而产生应激反应而促进微生物合成代谢产物。CN106520596A公开了一种添加过氧化氢胁迫节杆菌发酵产过氧化氢酶的方法，是通过胁迫环境发酵促进过氧化氢酶的合成。这些研究成果表明，通过改变外接发酵环境，通过胁迫环境发酵，迫使微生物产生应激反应，分泌自身保护性代谢产物，这类保护性代谢产物具有特殊的生理活性，对应于人体免疫***调节具有极为重要的意义。
同时，进一步研究发现，这类应激反应产生的自身保护性代谢产物的功能与其分子量具有一定的关系，即分子量大于1万Da的代谢产物，不具有生理活性甚至具有一定的生理毒性，而分子量低于1万Da的代谢产物具有特殊的生理功能，具有调节免疫活性的功能，且无毒性，分子量小易吸收。所以通过胁迫环境发酵使微生物产生应激反应，并从其代谢产物中分离具有免疫***调节功能的活性物质，极具商业价值。
微生物发酵的传统设备与工艺为采用发酵罐进行发酵，即罐式发酵，其发酵过程为间歇式，连续化程度低，生产效率低下；同时，发酵结束后，其大量具有活性的微生物和营养丰富的培养基都作为副产物进行处理，资源浪费严重，对环境也造成污染；同时，作为间歇式发酵工艺，其代谢产物由于不能及时分离出来，导致其在发酵罐中不断积累，发酵罐中过多的代谢产物累积会反向抑制发酵，甚至产生有毒有害物质，不利于后续发酵过程的顺利进行。
CN111053789A公开了一种调节免疫***的方法和组合物，通过培养、胁迫发酵、过滤分离而得到产品，该工艺生产过程为间歇式，连续化程度低，且微生物及基质利用率低，代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害，生产效率低。
CN102162001A公开了一种厌氧发酵丙酮丁醇梭菌产丁醇的方法，通过菌种活化、种子培养及厌氧发酵三个步骤，整个发酵步骤即为常规，且发酵过程为间歇式，连续化程度低，且在发酵过程中会积累大量的代谢产物，进而抑制微生物的发酵，生产效率低。
CN106520596A公开了一种添加过氧化氢胁迫节杆菌发酵产过氧化氢酶的方法，通过种子培养基、发酵产酶、过氧化氢酶提取而得到碱性过氧化氢酶。该工艺皆为常规发酵工艺，且过氧化氢酶提取工序上只是通过简单的离心而得到含有过氧化氢酶的上清液，浓度和含量极低，这样得到的粗产品商业价值低；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN1978658A公开了一种用间歇高pH胁迫策略提高发酵生产透明质酸产量的方法，通过分阶段控制发酵液的pH值进而提高透明质酸的产量。该工艺只涉及到发酵工艺，对发酵产物如何进行提取和纯化，没得涉及到；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN103131680A公开了一种利用胁迫发酵生产重组耐热超氧化物歧化酶的方法，通过基因重组工程菌、诱导培养、离心、破碎、离心后取上清液即得。该工艺在提取工序上采取的是离心、破碎、离心后取上清液即得，没有进一步的提取、纯化和干燥，所得到的粗产量含量低，市场应用范围极为有限；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN104498552A公开了一种低PH值胁迫提高E-聚赖氨酸产量的方法，通过发酵前期引入极端的不同酸性PH值胁迫，以提高E-聚赖氨酸产量，工艺步骤为发酵培养、不同PH值的酸胁迫培养、发酵结束。该工艺未涉及到产物的提取和分离，会导致得到的粗产品难以实际应用；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN108570459A公开了一种高效发酵生产重组细菌漆酶的方法，通过重组大肠杆菌基因工程菌、LB种子培养、TB胁迫发酵、诱导发酵、离心、破碎、离心即得重组死亡谷芽孢漆酶的粗酶液。该工艺对发酵结束后产物的只进行了简单离心分离，未进行进一步的纯化，所得的产品含量低；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN103436585A公开了一种添加多种发酵促进剂发酵生产天然β-胡萝卜素的方法，通过斜面培养、种子培养、发酵培养三个工序，该工艺未涉及到最终产物的提取。
CN106399423A公开了一种利用啤酒酵母在逆境胁迫条件下制备海藻糖的方法，通过离心分离啤酒酵母、种子培养、发酵罐培养、离心过滤、冻干、复溶、煮沸、超滤、超滤液冻干、得到海藻糖。该工艺通过反复冻融发和超滤对海藻多糖进行初步的分离和纯化，该工艺发酵过程为间断性，连续化程度低；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN102517336A公开了一种利用氧化胁迫提高出芽短梗霉黑色素产量的方法，通过PDA菌种活化、种子培养、发酵培养、发酵罐培养、发酵液离心、酸解、醇沉即得黑色素粗品，然后再碱液溶解和酸沉，即得黑素色。本工艺反复用到酸和碱进行分离纯化，反应条件剧烈，对目标产物的活性和结构有极大的破坏风险，且该工艺为间断性，连续化程度极低；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN102703542A公开了一种超声波辅助微生物转化合成乳糖酸的方法，通过液体发酵、超声波强化胁迫处理、转化合成乳糖酸。该工艺至涉及到发酵方法，对产物的提取未进行进一步研究；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
CN108456702A公开了一种桑黄菌丝体发酵中提高桑黄黄酮产量的方法，通过配置培养基、灭菌、接种、培养、诱导剂添加剂、继续培养。该工艺为涉及到任何提取和纯化方法，难以实现产品；同时代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害。
概而言之，现有发酵工艺都为传统间歇式发酵工艺，甚至未对发酵结束后目标产物进行分离纯化或简单分离，得到的产物均为发酵粗产物，杂质含量多；同时胁迫发酵的代谢产物未及时提取分离，其会反向抑制发酵，甚至产生有毒有害物质，不利于胁迫发酵的顺利高效进行；发酵结束后其仍然具有高活性的微生物和营养丰富的利用过的发酵基质也作为副产物进行处理，没有加以重复利用，造成资源浪费。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种连续化程度高，发酵基质和微生物的利用率高，代谢产物可以在线提取分离，产品得率高，生产效率高，且工艺条件温和，适合规模化生产的免疫调节组合物的连续化制备方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，包括以下步骤：
（1）固相微生物柱胁迫发酵：首先将微生物固定化并装于层析柱，构建成固相微生物柱；再将发酵基质上固相微生物柱，进行胁迫发酵；
（2）膜分离
Figure 320751DEST_PATH_IMAGE001
：将步骤（1）胁迫发酵过程中固相微生物柱下端的流出液单独收集， 并过膜，分别收集截留液Ⅰ和透过液Ⅰ；
（3）固相酶柱降解：将步骤（2）收集得到的截留液Ⅰ过固相酶柱，将固相酶柱下端的流出液单独收集；
（4）膜分离
Figure 100002_RE-DEST_PATH_IMAGE002
：将步骤（3）收集得到的固相酶柱下端的流出液过膜，分别收集截留 液Ⅱ和透过液Ⅱ；
（5）发酵基质套用：将步骤（4）收集得到的截留液Ⅱ上步骤（1）的固相微生物柱，作为发酵基质的套用，也即新基质的补充；
（6）膜浓缩：将步骤（2）收集得到透过液Ⅰ和步骤（4）收集得到的透过液Ⅱ合并，进行膜浓缩，得到浓缩液；
（7）干燥：将步骤（5）得到的浓缩液进行干燥、粉碎、过筛，即得免疫调节组合物。
进一步，所述免疫调节组合物为由微生物在逆境中发生应激反应而代谢产生、分子量低于1万Da活性物质的混合物。
步骤（1）中，所述微生物固定化是指将微生物固定于载体之上且保持活性的方法，包括但不限于以范德华力、氢键、静电作用、共价键及离子键作用的吸附法。
固定化微生物技术是将特选的微生物固定在特殊的载体上，使其高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的生物技术。目前，这种技术大多应用于废水处理，有利于提高生物反应器内微生物（尤其是特殊功能的微生物）的浓度，有利于微生物抵抗不利环境的影响，有利于反应后的固液分离，缩短处理所需的时间。
同时，将固定后的固相微生物以层析柱的形式进行动态发酵，其一方面可以实现连续化生产的需要，同时可以使得代谢产物能及时随流出液排出并进行提取，在及时获得目标代谢产物的同时，还能减少由于代谢产物的积累而导致的反向抑制发酵作用甚至毒害作用。
进一步，步骤（1）中，所述微生物包括但不限于乳酸菌、双歧杆菌、乳杆菌、链球菌、芽孢杆菌、肠球菌及科雷伯氏菌中的一种或多种组合；微生物固定化使用的的载体为大孔吸附树脂、离子交换树脂、活性炭、硅胶、聚酰胺树脂、多孔玻璃、多孔陶瓷或硅藻土中的任意一种；所述载体的质量与微生物数量的比例优选为1g:2-20千万CFU，更优选1g: 5-15千万CFU，进一步优选1g: 8-13千万CFU。
进一步，步骤（1）中，所述胁迫发酵是指，通过改变发酵条件，以获得更高产量的目标产物为目的的发酵，所述改变发酵条件是指，调节发酵温度，调节不同柱压，改变发酵基质的pH值，调节发酵基质的渗透压，调节发酵基质营养成分中的一种或多种组合方式；所述固相微生物柱与发酵基质的质量比为1:7-15，优选1:8-13、更优选1:9-11。
进一步，步骤（1）中，所述调节发酵温度为柱温和发酵基质温度控制为10-60℃，优选30-50℃，更优选40-45℃；所述发酵优选变温发酵，发酵温度先高后低再高，变温过程之间，温差相差10-30℃，优选15-25℃；变温之间的时间为高温2-3h，然后低温2-3小时，再高温，直至发酵结束；所述的调节柱压为针对微生物柱进行压力调节，调节压力控制在-0.1MPa-0.1Mpa；所述的改变发酵基质的pH值为1-10；所述的调节发酵基质的渗透压为，通过调节不同浓度氯化钠改变发酵基质的渗透压，其氯化钠的浓度调节范围为，低渗透压或高渗透压；优选地，步骤（1）中，氯化钠的浓度调节范围，低渗透压为0.1-0.5%，优选0.2-0.4%，高渗透压为3-5%，优选3.5-4.5%；所述的调节发酵基质营养成分为，降低发酵基质中的氮源、碳源或氧源中的任意一种或多种组合。
进一步，步骤（1）中，所述固相微生物柱的径高比为1:3-10，优选径高比为1:5-7。
进一步，步骤（1）中，发酵基质上固相微生物柱的流速为0.05-0.2BV/h；优选流速为0.08-0.12BV/h。
进一步，步骤（1）中，发酵基质的温度与固相微生物柱的温度保持一致。
进一步，步骤（2）中，所述的膜分离
Figure 50941DEST_PATH_IMAGE001
为错流膜分离技术，所述膜为纳滤膜，膜孔径 为5-10nm，优选6-8nm；膜组件及流出液的温度保持在4-60℃，优选5-20℃。
传统死端膜过滤极易发生堵塞而直接造成过滤通量降低，甚至无法正常过滤，导致生产终止，必须进行膜清洗，连续化程度低；而错流膜过滤则很好的解决了该问题，其不易发生膜堵塞，且连续化程度极高，非常适宜于连续化生产的需要。
进一步，步骤（3）中，所述固相酶柱为将活性酶通过固定在载体之上后装层析柱构建而成；所述载体包括但不限于大孔树脂、离子交换树脂、硅胶、琼脂糖、壳聚糖、活性炭、纤维素中的任意一种；所述酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、胃蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶中的一种或多种组合；所述载体与酶的比例为1g:0.5--10万IU，优选1g:1-8万IU，更优选1g:2-6万IU；所述固相酶柱与发酵基质的质量比为1:15-30，优选1:17-25，更优选1：20-23。
进一步，步骤（3）中，所述固定的方式，包括但不限于物料吸附、离子交换吸附、化学交联或光藕联中的任意一种。
进一步，步骤（3）中，所述固相酶柱的径高比为1:3-10，优选为1:5-7。
进一步，步骤（3）中，截留液Ⅰ过固相酶柱的流速为0.2-0.5BV/h，优选为0.3-0.4BV/h。
进一步，步骤（3）中，截留液Ⅰ的温度与固相酶柱的柱温保持一致。
固相酶技术指，水溶性酶经物理的或化学的方法处理后，吸附或共价结合在不溶性支持物（载体）上而仍具催化活性，从而在催化反应中以固相作用于底物，其具有酶利用率高、连续化程度高、易回收和分离等优点。同时，进一步将固相酶以层析柱的形式进行酶解反应，提高了生产过程的连续化程度。
本步骤将含有大分子的截留液通过固相酶柱进行酶降解后，大分子降解为小分子片段，整个酶解过程条件柔和，对分子的活性影响小，同时也提高了最终目标产品得率。
进一步，步骤（4）中，所述的膜分离Ⅱ为错流膜分离技术，所述膜为纳滤膜，膜孔径为5-10nm，优选为6-8nm。
进一步，步骤（4）中，膜组件及流出液的温度保持在4-60℃，优选10-40℃，更优选温度5-20℃。
步骤（5）中，所述发酵基质的套用，为截留液Ⅱ作为发酵基质返回步骤（1）进入发酵基质，进行重复利用，同时也是作为新发酵基质的补充。目的是提高发酵基质的重复利用率，节约资源。
进一步，步骤（6）中，所述的膜为纳滤膜，膜孔径为0.5-1nm；膜组件及流出液的温度保持在4-60℃，优选10-40℃，更优选5-20℃。
进一步，步骤（6）中，所述的膜浓缩至浓缩液的百利度为20-40brix。
膜浓缩，一方面可以除去一定比例的水分，同时也可以除去盐及离子、氨基酸、单糖等低于500Da的小分子物质，进一步纯化目标产物。
进一步，步骤（7）中，所述干燥包括但不限于真空冷冻干燥、真空干燥、微波干燥中的任意一种。
进一步，所述真空冷冻干燥的预冻温度优选为-20~-40℃，预冻时间为2~5h，升华干燥温度为-18~-30℃，升华干燥时间为6-18h，解析干燥温度为30-60℃，时间为4-10h。
本发明方法的原理是：
将特定微生物固定于载体上，将富有微生物的载体以层析柱形式进行发酵，同时在发酵过程中，在逆境胁迫条件下促进微生物应激反应，并释放应激反应的代谢产物，随后这些代谢产物随柱流出液排出，这个过程中微生物始终驻留固定于层析柱之上连续进行发酵；接着将收集的流出液进行膜分离，分离出的透过液（含小分子物质）组分和截留液（含大分子物质）组分分别收集，其截留液进入固相酶柱进行酶降解，使其大分子降解为小分子，随后再进行膜分离，其截留液返回固定微生物柱作为发酵基质的补充重复利用，而其透过液组分与之前的透过液组分合并，进行膜浓缩，并进行干燥、粉碎过筛，即得免疫调节组合物。
本发明的有益效果：一、所得免疫调节组合物平均分子量低于1万Da，其水溶性好；二、所得免疫调节组合物具有较强的免疫调节作用；三、整个工艺连续化程度高，可实现不间断连续化生产；四、微生物和酶利用率高，其以层析柱形式可以实现连续化重复利用；五、工艺条件温和，对设备要求较低，适合规模化生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明，以便于本领域技术人员充分理解本发明。但本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做出改进，因此，本专利申请请求保护的范围不受下面所述具体实施例的限制。
下述本发明实施例所使用的微生物菌种购自深圳海思歌生物科技有限公司HXCARE品牌益生菌；本发明实施例所使用的其他原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
下述本发明实施例中对免疫调节组合物活性的检测指标为：对巨噬细胞的增殖作用、对巨噬细胞分泌细胞介素的促进作用以及白细胞分化抗原的分泌水平情况。
（1）巨噬细胞的增殖作用的检测方法：MTT比色法检测法，RAW264. 7（(中科院上海细胞库，目录号TCM13)）细胞接种96孔板，分组为空白组，对比组，免疫***调节组合物0.5，2. 5，5，10，30，90 g/L组，每组设置6个复孔。常规培养过夜。细胞贴壁生长至50%后，按分组要求给药，继续培养48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20ul继续孵育4 h后，小心吸弃上清液，加入DMSO 200 ul振荡溶解后，酶标仪测定A。
（2）巨噬细胞分泌细胞介素的促进作用的检测方法：取上述上清液，使用商业细胞因子试剂盒（华美生物工程有限公司）来做检测白细胞介素IL-1α，IL-6和TNFα水平。
（3）白细胞分化抗原的分泌水平情况：取上述上清液，使用商业细胞因子试剂盒（南京欧凯生物科技有限公司）来做检测CD-14和CD-16水平。
平均分子量的检测方法：粘度法。
溶解度的测定：定温25℃条件下进行。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
（1）固相微生物柱胁迫发酵：将固定有乳酸菌的大孔吸附树脂装层析柱，柱体积为10L，径高比为1:6，用无菌水冲洗干净后，将100L灭菌的发酵基质以流速为0.1BV/h上柱，发酵基质的pH值为2，柱温调节为40℃3h，20℃2h，55℃至发酵结束，收集流出液；
（2）膜分离Ⅰ：将微生物柱下端流出液单独收集，并过5nm错流膜分离装置，分别收集截留液Ⅰ（合计76L）和透过液Ⅰ（合计38L）；
（3）固相酶柱降解：将固定有木瓜蛋白酶的硅胶装层析柱，柱体积为5L，径高比为1:5，并无菌水冲洗干净后，将步骤（2）得到的截留液Ⅰ流速为0.3BV/h过固相酶柱，将下端流出液单独收集；
（4）膜分离Ⅱ：将固相酶柱下端流出液单独收集，并过5nm错流膜分离装置，分别收集截留液Ⅱ（合计19L）和透过液Ⅱ（合计32L）；
（5）发酵基质套用：将步骤（4）得到的截留液Ⅱ上柱于步骤（1）的微生物柱，作为发酵基质的套用，新基质的补充；
（6）膜浓缩：将步骤（2）和（4）得到透过液Ⅰ和透过液Ⅱ合并，进行膜浓缩，膜孔径为0.5nm，浓缩至33birx，得到浓缩液；
（7）干燥：将步骤（5）得到的浓缩进行真空冷冻干燥（预冻温度为-20℃、预冻时间为5h、升华干燥温度为-18℃、升华干燥时间为12h、解析干燥温度为40℃、时间为5h）、粉碎、过80目筛后，即得83.5g免疫调节组合物，平均分子量为7000Da，溶解度为10.2g/100g水。
将本实施例制得的免疫调节组合物进行活性试验，结果见下表1。
表1 实施例1制得免疫调节组合物进行活性试验检测结果数据
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例2
本实施例包括以下步骤：
（1）固相微生物柱胁迫发酵：将固定有双歧杆菌、乳杆菌、芽孢杆菌（1:1：1）的离子交换树脂装层析柱，柱容积为10L，径高比为1:8，并无菌水冲洗干净后，将100L灭菌的发酵营养基质以流速为0.2BV/h上柱，发酵基质的pH值为6，2h；2，4h；10，4h；3，10h；柱温保持50℃至发酵结束，收集流出液；
（2）膜分离Ⅰ：将微生物柱下端流出液单独收集，并过6nm错流膜分离装置，分别收集截留液Ⅰ（合计70L）和透过液Ⅰ（合计40L）；
（3）固相酶柱降解：将固定有木瓜蛋白酶的硅胶装层析柱，柱体积为5L，径高比为1:6，并无菌水冲洗干净后，将步骤（2）得到的截留液Ⅰ流速为0.4BV/h过固相酶柱，将下端流出液单独收集；
（4）膜分离Ⅱ：将固相酶柱下端流出液单独收集，并过8nm错流膜分离装置，分别收集截留液Ⅱ（合计40L）和透过液Ⅱ（合计17L）；
（5）发酵基质套用：将步骤（4）得到的截留液Ⅱ上柱于步骤（1），作为发酵基质的套用，新基质的补充；
（6）膜浓缩：将步骤（2）和（4）得到透过液Ⅰ和透过液Ⅱ进行膜浓缩，膜孔径为0.7nm，浓缩至36.2birx，得到浓缩液；
（7）干燥：将步骤（5）得到的浓缩进行真空干燥（真空干燥温度65℃、时间为20h）、粉碎、过100目筛后，即得78.5g免疫***调节组合物，平均分子量为6500Da，溶解度为11.4g/100g水。
将本实施例制得的免疫调节组合物进行活性试验，结果见下表2：
表2 实施例2制得的免疫调节组合物进行活性试验检测结果数据
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE004
实施例3
本实施例包括以下步骤：
（1）固相微生物柱胁迫发酵：将固定有乳酸菌、链球菌、肠球菌及科雷伯氏菌的硅胶装层析柱，柱容积为10L，径高比为1:6，并无菌水冲洗干净后，将100L灭菌的发酵基质以流速为0.1BV/h上柱，基质的pH值为4，柱温为50℃，氯化钠的浓度为0.3%，收集流出液；
（2）膜分离Ⅰ：将微生物柱下端流出液单独收集，并过5nm错流膜分离装置，分别收集截留液Ⅰ（合计67L）和透过液Ⅰ（合计41L）；
（3）固相酶柱降解：将固定有木瓜蛋白酶的硅胶装层析柱，柱体积为5L，径高比为1:5，并无菌水冲洗干净后，将步骤（2）得到的截留液Ⅰ流速为0.3BV/h过固相酶柱，将下端流出液单独收集；
（4）膜分离Ⅱ：将固相酶柱下端流出液单独收集，并过5nm错流膜分离装置，分别收集截留液Ⅱ（合计21L）和透过液Ⅱ（合计30L）；
（5）发酵基质套用：将步骤（4）得到的截留液Ⅱ上柱于步骤（1），作为发酵基质的套用，新基质的补充；
（6）膜浓缩：将步骤（2）和（4）得到透过液Ⅰ和透过液Ⅱ合并进行膜浓缩，膜孔径为0.7nm，浓缩至35birx，得到浓缩液；
（7）干燥：将步骤（5）得到的浓缩进行真空干燥（预冻温度为-20℃、预冻时间为5h、升华干燥温度为-18℃、升华干燥时间为12h、解析干燥温度为40℃、时间为5h）、粉碎、过100目筛后，即得69.8g免疫***调节组合物，平均分子量为5700Da，溶解度为12.5/100g水。
将本实施例得到的免疫调节组合物进行活性试验，结果见下表3：
表3：实施例3制得的免疫调节组合物进行活性试验检测结果数据
Figure DEST_PATH_IMAGE005

Claims (10)

1.一种基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）固相微生物柱胁迫发酵：首先将微生物固定化并装层析柱，构建成固相微生物柱；再将发酵基质上固相微生物柱，进行胁迫发酵；
（2）膜分离
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
：将步骤（1）胁迫发酵过程中固相微生物柱下端的流出液单独收集，并过膜，分别收集截留液Ⅰ和透过液Ⅰ；
（3）固相酶柱降解：将步骤（2）收集得到的截留液Ⅰ过固相酶柱，将固相酶柱下端的流出液单独收集；
（4）膜分离
Figure DEST_PATH_IMAGE004
：将步骤（3）收集得到的固相酶柱下端的流出液过膜，分别收集截留液Ⅱ和透过液Ⅱ；
（5）发酵基质套用：将步骤（4）收集得到的截留液Ⅱ上步骤（1）的固相微生物柱，作为发酵基质的套用，也即作为发酵新基质的补充；
（6）膜浓缩：将步骤（2）收集得到透过液Ⅰ和步骤（4）收集得到的透过液Ⅱ合并，进行膜浓缩，得到浓缩液；
（7）干燥：将步骤（5）得到的浓缩液进行干燥、粉碎、过筛，即得免疫调节组合物。
2.如权利要求1所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，所述免疫调节组合物为由微生物在逆境中发生应激反应而代谢产生、分子量低于1万Da活性物质的混合物。
3.如权利要求1或2所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述微生物包括乳酸菌、双歧杆菌、乳杆菌、链球菌、芽孢杆菌、肠球菌及科雷伯氏菌中的一种或多种组合；微生物固定化使用的载体为大孔吸附树脂、离子交换树脂、活性炭、硅胶、聚酰胺、多孔玻璃、多孔陶瓷或硅藻土中的任意一种；所述载体的质量与微生物数量的比例优选为1g:2-20千万CFU，更优选为1g:5-15千万CFU，进一步优选1g: 8-13千万CFU，更进一步优选1g: 10-12千万CFU。
4.如权利要求1-3之一所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胁迫发酵是指，通过改变发酵条件，以获得更高产量的目标产物为目的进行的发酵，所述改变发酵条件是指，调节发酵温度，调节不同柱压，改变发酵基质的pH值，调节发酵基质的渗透压，调节发酵基质营养成分中的一种或多种组合方式；所述固相微生物柱与发酵基质的质量比为1:7-15，优选1:8-13、更优选1:9-11。
5.如权利要求4所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的调节发酵温度为柱温和发酵基质温度控制为10-60℃，优选30-50℃、更优选40-45℃；所述发酵优选变温发酵，发酵温度先高后低再高，变温过程之间，温差相差10-30℃，优选15-25℃；变温之间的时间为高温2-3h，然后低温2-3小时，再高温，直至发酵结束；所述的调节柱压为针对微生物柱进行压力调节，调节压力控制在-0.1MPa-0.1Mpa；所述的改变发酵基质的pH值是指将pH值在1-10范围内进行改变；所述的调节发酵基质的渗透压为通过调节不同浓度氯化钠改变发酵基质的渗透压，其氯化钠的浓度调节范围为低渗透压或高渗透压；优选地，步骤（1）中，氯化钠的浓度调节范围，低渗透压为0.1-0.5%，优选0.2-0.4%，高渗透压为3-5%，优选3.5-4.5%；所述的调节发酵基质营养成分为，降低发酵基质中的营养成分氮源、碳源或氧源中的任意一种或多种组合。
6.如权利要求1-5之一所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）中，所述的膜分离
Figure 25204DEST_PATH_IMAGE002
和膜分离Ⅱ为错流膜分离技术，膜孔径为5-10nm；膜组件及流出液的温度保持在4-60℃，优选5-20℃。
7.如权利要求1-6之一所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述固相酶柱为活性酶通过固定在载体之上后装层析柱构建而成；所述载体包括大孔树脂、离子交换树脂、硅胶、琼脂糖、壳聚糖、活性炭、纤维素中的任意一种；所述酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、胃蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶中的一种或多种组合；所述载体与酶的比例为1g:0.5--10万IU，优选1g:1-8万IU、更优选1g:2-6万IU；所述固相酶柱与发酵基质的质量比为1:15-30，优选1:17-25、更优选1:20-23。
8.如权利要求1-7之一所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述发酵基质的套用，为截留液Ⅱ作为发酵基质返回步骤（1）进入固相微生物柱胁迫发酵，进行重复利用，同时也是作为新发酵基质的补充。
9.如权利要求1-8之一所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述的膜为纳滤膜，膜孔径为0.5-1nm；膜组件及流出液的温度保持在4-60℃，优选10-30℃；所述的膜浓缩至浓缩液的百利度为20-40brix。
10.如权利要求1-9之一所述的基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，其特征在于，步骤（7）中，所述干燥为真空冷冻干燥、真空干燥、微波干燥中的任意一种；所述真空冷冻干燥的预冻温度优选为-20~-40℃，预冻时间优选为2~5h，升华干燥温度优选为-18~-30℃，升华干燥时间优选为6-18h，解析干燥温度优选为30-60℃，时间优选为4-10h。
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