CN112611742B - 一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略 - Google Patents

一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略，步骤是：先将PQ官能化到ZIKV病毒中；将乙烯基醚官能化到量子点中；然后，在照射下通过环化反应将ZIKV病毒标记为荧光量子点。本发明的优点有：利用基于光点击生物正交反应的量子点来标记和跟踪ZIKV，使ZIKV在其自然环境中具有精确的时空控制的可视化成为可能。ZIKV‑量子点能够描绘在TPZ或诺康唑处理的条件下ZIKV与宿主细胞的相互作用，可见本发明为阐明病毒与宿主细胞的相互作用和开发潜在的快速诊断和治疗方法提供一个可靠的工具。

Description

一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略
技术领域
本发明涉及一种生物小分子标记技术领域，尤其涉及寨卡病毒可视化标记技术。
背景技术
蚊媒寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)隶属于黄病毒属黄病毒科黄病毒属，是一种重新出现的黄病毒，通过受感染蚊子的叮咬或与受感染伴侣的性接触传播，可引起多种寨卡综合征，例如脑室肥大，以及ZIKV在怀孕期间的感染与许多胎儿畸形有关，包括产前死亡和小头畸形。据报道，最近在30多个国家或地区爆发了寨卡病毒，成为全球健康的主要威胁。人们对ZIKV的研究相对较少，因此对ZIKV感染的生物学和致病机制还没有完全了解。流行病/地方病国家的普通民众和前往这些地区的旅行者迫切需要一种有效的疫苗来遏制传播。
目前ZIKV的诊断技术主要基于血清逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)或检测ZIKV特异性IgM抗体，在预防疾病传播方面取得了显著进展。此外，最近有关ZIKV感染的细胞信号通路的研究，极大地丰富了RNA病毒感染机制的研究。然而，寨卡病毒与宿主细胞相互作用的可视化研究还很少，这对于理解寨卡病毒病的分子机制和发病机制至关重要。因此，发展一种无抗体交叉反应的荧光标记方法对于阐明病毒的致病机制是迫切的。
为了揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用，荧光染料在病毒标记实验和实时成像中得到了广泛的应用，加深了人们对病毒感染过程的理解。但是荧光团的光漂白和光谱重叠是不可避免的，极大地影响了追踪染料标记病毒的效果，限制了其在生物成像中的应用。荧光量子点由于其独特的光学性质，如窄带、可调谐的荧光发射、高的荧光量子产率和光稳定性，可以被合理地选择作为候选材料。尽管目前构建量子点病毒成像模式的众多研究已经能够提供有意义的信息，但通过不温和和不可控制的物理化学过程将病毒铆接在量子点上后维持病毒的渗透仍然是一个巨大的挑战，因此很难通过这种方法去揭示真正的病毒与宿主细胞相互作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略，以解决现有技术缺乏研究ZIKV病毒与宿主细胞相互作用的物质基础的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略，步骤是：先将9，10-菲醌官能化到ZIKV病毒中；将乙烯基醚官能化到量子点中；然后，在照射下通过环化反应将ZIKV病毒标记为荧光量子点。
进一步地，
所述将9，10-菲醌官能化到ZIKV病毒中的操作包括：9，10-菲醌分散于MES缓冲液中，加入EDC和NHS，超声作用，封口，振荡；然后将上述步骤处理过的ZIKV病毒分散在PBS中；加入MES缓冲液，振荡过夜，经NAP-5脱盐柱净化，得到PQ组修饰的寨卡病毒。
进一步地，
所述将9，10-菲醌官能化到ZIKV病毒中的详细操作包括：11mg，4.17×10-5mol的9，10-菲醌(PQ)，分散于10ml MES缓冲液中；加入80mg，4.17x10-4mol的EDC和120mg NHS，超声作用15s，封口，37℃振荡15min；然后将浓度为2mg/ml的寨卡病毒100μL分散在10ml PBS中，加入MES缓冲液，37℃振荡过夜，经NAP-5脱盐柱净化，得到PQ组修饰的寨卡病毒。
进一步地，
所述将乙烯基醚官能化到量子点中的操作包括：取含氨基的量子点，再取含羧基的乙烯基醚，EDCI，4-二甲胺基吡啶，分别放入3颈烧瓶中，加入二氯甲烷完全溶解；然后在室温黑暗环境中摇动；然后通过硅胶柱层析得到乙烯基醚基修饰的量子点。
进一步地，
所述将乙烯基醚官能化到量子点中的操作包括：取摩尔浓度为8×10-6μM含氨基的量子点1μL，再取含羧基的乙烯基醚1000μL，EDCI 15.3mg，4-二甲胺基吡啶9.8mg，分别放入3颈烧瓶中，加入5ml二氯甲烷完全溶解；然后在室温黑暗环境中摇动2小时；然后通过硅胶柱层析得到乙烯基醚基修饰的量子点。
进一步地，
所述照射下通过环化反应将ZIKV病毒标记为荧光量子点的操作包括：
将9，10-菲醌基修饰的寨卡病毒和乙烯基醚基修饰的量子点溶解在CH3CN和PBS混合溶液中，然后用LED灯照射1min进行环化反应将ZIKV病毒标记为荧光量子点，得到量子点修饰的寨卡病毒ZIKV-Qds。
本发明的优点包括：利用基于光点击生物正交反应的量子点来标记和跟踪ZIKV。使ZIKV在其自然环境中具有精确的时空控制的可视化成为可能。利用这一策略，ZIKV在细胞进入不同的细胞系(如A549和SNP19)后被成功地跟踪和可视化。此外，ZIKV-量子点能够描绘在TPZ或诺康唑处理的条件下ZIKV与宿主细胞的相互作用。本发明将为阐明病毒与宿主细胞的相互作用和开发潜在的快速诊断和治疗方法提供一个可靠的工具。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是基于光点击的ZIKV-QDs的合成过程示意图；
图2是PQ与富电子乙烯基醚之间的光点击反应过程吸收峰变化示意图；
图3是PQ与富电子乙烯基醚之间的光点击反应溶液颜色变化实验图；
图4是ZIKV-量子点与量子点聚丙烯酰胺凝胶电泳法实验图；
图5是ZIKV-量子点透射电子显微镜图；
图6是提纯后的滴度同计图；
图7是ZIKV RNA水平统计图；
图8是ZIKV的NTA浓度和平均粒径同计图；
图9是纳米粒子、量子点修饰的纳米颗粒的平均粒径的统计图
图10是量子点和ZIKV病毒的Zeta电位统计图；
图11是ZIKV和ZIKV-量子点病毒滴度统计图；
图12是孵育ZIKV-QDs的与未孵育ZIKV的A549细胞的荧光成像图；
图13是图12的共定位散点图；
图14是图12相应的Pearson相关系数(PC)；
图15是孵育ZIKV-QDs的与未孵育ZIKV的SNB 19癌细胞的荧光成像图；
图16是图15的共定位散点图；
图17是图15应的Pearson相关系数(PC)。；
图18是对照组、CPZ处理组、诺可达唑处理组的量子点的细胞荧光强度实验图；
图19是CPZ处理的Western blotts实验结果图；
图20是CPZ处理的细胞活力统计图；
图21是诺可达唑处理的细胞活力统计图；
图22、23是不同浓度的量子点孵育后的细胞活力统计图；
图24是照射时间不同，对细胞影响情况统计图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
基于光点击的ZIKV-QDs的合成过程如图1所示，将9，10-菲醌(PQ)和乙烯基醚分别官能化到ZIKV病毒和量子点中。然后，在照射下通过环化反应将ZIKV病毒标记为荧光量子点。详细过程描述如下：
寨卡病毒的修饰：9，10-菲醌(PQ)11mg(4.17×10-5mol)分散于10ml MES缓冲液中，加入80mg EDC(4.17x10-4 mol)和120mg NHS，超声作用15s，封口，37℃振荡15min。然后将100μL的寨卡病毒(浓度为2mg/ml)分散在10ml PBS中。加入MES缓冲液，37℃振荡过夜，经NAP-5脱盐柱净化，得到PQ组修饰的寨卡病毒。实现将PQ官能化到ZIKV病毒中。
量子点QDs的修饰：取摩尔浓度为8×10-6μM的含氨基的量子点1μL；再取含羧基的乙烯基醚1000μL，EDCI 15.3mg，4-二甲胺基吡啶9.8mg，分别放入3颈烧瓶中，加入5ml二氯甲烷完全溶解。然后在室温黑暗环境中摇动2小时。然后通过硅胶柱层析得到乙烯基醚基修饰的量子点。实现将乙烯基醚官能化到量子点中。
寨卡病毒与量子点的点击反应：将PQ基修饰的寨卡病毒和乙烯基醚基修饰的量子点溶解在CH3CN和PBS混合溶液中，然后用LED灯照射1min进行环化反应将ZIKV病毒标记为荧光量子点，得到量子点修饰的寨卡病毒ZIKV-Qds。如图2-3所示，所制备的9，10-菲醌的一次吸收峰显著蓝移，从330nm移至310nm，425nm处的吸收带随着LED灯的照射而消失，因PQ与富电子乙烯基醚之间的光点击反应，PQ与富电子乙烯基醚在450nm处反应的荧光强度随着辐照时间的延长而大大增强。同时如图3所示，它们的混合溶液由黄色变为无色，并出现蓝光，这与前述的吸光度和荧光结果一致。此外，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证了量子点是否被标记在ZIKV病毒上。如图4所示，ZIKV-量子点与量子点相比保持了原来的位置，这是由病毒的大分子蛋白贡献的。另一方面，如图5所示，透射电子显微镜观察到ZIKV-量子点具有典型的量子点功能化的ZIKV图案，直观地验证了量子点在ZIKV病毒中的修饰成功。综上所述，PQ与乙烯基醚之间的光点环化反应可以应用于ZIKV病毒的量子点标记。
ZIKV-Qds内化分析：
Arruda et报道，通过不连续的蔗糖梯度提纯，优化了获得ZIKV的工艺。为了确定沿梯度组分是否存在具有感染性的ZIKV颗粒，所有组分均通过空斑滴定。事实上，尽管在所有组分中都存在ZIKV，但如图6所示，提纯后的滴度高于108pfu/ml；如图7所示，ZIKV RNA水平的峰值达到5.0pfu/ml(具体数值)×1010RNA拷贝/ml，在蔗糖含量为20％时达到峰值。结合NanoSight NS300仪器和马尔文仪器软件，利用悬浮在溶液中的纳米颗粒的布朗运动产生的反射光，对量子点和ZIKV-量子点进行了表征。每次测量都要测定寨卡病毒、量子点修饰的寨卡病毒的浓度值(颗粒/毫升)和纳米颗粒的大小(纳米)。如图8所示，ZIKV的NTA浓度为2.92×105±3.55×104个/mL，平均粒径为119.3±11.5nm。如图9所示寨卡病毒的平均粒径为108.9±8.2nm，比量子点修饰的寨卡病毒(2.14×106±4.10×105个/mL)高13.6倍。如图10所示，量子点和ZIKV病毒的Zeta电位值分别为-8.14mV和-12.03mV。ZIKV-量子点样品的Zeta电位峰明显分离，结合带负电荷，说明量子点是通过氨基和羧基之间的氨键成功修饰到ZIKV表面的。如图11所示，ZIKV和ZIKV-量子点病毒滴度也没有差异，说明量子点对ZIKV病毒的渗透性能没有影响。这些检测有力地表明，量子点能够在不影响的情况下标记ZIKV病毒。
ZIKV-Qds与核酸染料Syto13在37℃培育箱混合孵育1h，108000g超速离心2h，去除剩余染料，把上一步纯化后的物质备用，当然也可以视情况增殖后备用。
有了QDs修饰的ZIKV病毒，本发明将通过荧光可视化QDs进一步评估ZIKV的浸润能力。在细胞中缺乏ZIKV感染的直接证据的情况下，我们使用QDs修饰的ZIKV来绘制感染过程。
设置孵育ZIKV的A549细胞组和孵育ZIKV-QDs的A549细胞组。将核酸染料Syto13加入孵育ZIKV的A549细胞组，将所述纯化后的物质加入孵育ZIKV-QDs的A549细胞组中，每隔15分钟摇动5次，然后在37℃含5％二氧化碳的培养箱中孵育24小时。孵育完成后用4％多聚甲醛固定细胞，然后在激光共聚焦扫描显微镜(LSM880)下观察荧光成像，并拍摄上述荧光染料颗粒。量子点的激发波长为561nm，发射波长为605nm；Syto13的激发波长为488nm，发射波长为509nm。如图12所示，在共聚焦显微镜蓝色通道中孵育ZIKV-QDs的A549细胞的荧光成像比孵育ZIKV的A549细胞更亮，两种条件下Syto13染料的绿色发射没有显著差异。QDs的荧光图像与市面上的核酸追踪染料Syto13的荧光有很好的重叠。如图13-14所示，孵育ZIKV-QDs的A549细胞组的Pearson相关系数(PC)为0.95。
为了验证ZIKV-QDs靶向示踪性能的广泛应用，本发明还设置孵育ZIKV的SNB 19癌细胞组和孵育ZIKV-QDs的SNB 19癌细胞组。将核酸染料Syto13加入孵育ZIKV的SNB 19癌细胞组，将所述纯化后的物质加入孵育ZIKV-QDs的SNB 19癌细胞组中，孵育过程同上文A549细胞实验相同。通过共聚焦荧光显微镜对SNB 19癌细胞株进行了显著的荧光共定位实验，结果如图15所示。在共聚焦显微镜蓝色通道中孵育ZIKV-QDs的SNB 19癌细胞的荧光成像比孵育ZIKV的SNB 19癌细胞更亮，两种条件下Syto13染料的绿色发射没有显著差异。QDs的荧光图像与市面上的核酸追踪染料Syto13的荧光有很好的重叠。如图16-17所示，孵育ZIKV-QDs的SNB 19癌细胞组的PC也被计算到0.95。上述生物成像结果充分表明，用QDs标记的ZIKV在病毒感染过程中具有良好的定位和追踪功能。
盐酸氯丙嗪(CPZ)和诺可达唑(诺康唑)分别特异性地抑制笼蛋白依赖性的内吞作用和微管的形成，从而预防ZIKV的感染。鉴于PQ修饰的量子点具有良好的定位能力，为了展示其在ZIKV相关治疗后疗效评价中的推广应用，本发明进一步介绍盐酸氯丙嗪(CPZ)和诺可达唑两种典型的抗病毒药物。设置对照组、诺可达唑组、CPZ组，将所述纯化后的物质加入各实验组中，诺可达唑组还加入诺可达唑，CPZ组还加入CPZ。最后结果如图18所示，与对照组相比，CPZ处理组量子点的细胞荧光强度降低，这是因为穿过屏障细胞单层的ZIKV减少。此外，诺可达唑处理也明显减少了ZIKV在接种后2小时的侵入和感染，诺可达唑对ZIKV的进入和感染有明显的抑制作用，这为微管聚合是ZIKV细胞内转运所必需提供了直接证据。考虑到这些结果，我们可以利用荧光纳米探针量子点来追踪ZIKV的感染过程，并利用独立的荧光信号来评估治疗效果。
接下来，本发明验证CPZ或诺可达唑(诺康唑)治疗后ZIKV感染期间的新生蛋白质合成水平。ZIKV包膜蛋白E(ZIKV E)是暴露在颗粒细胞表面的主要结构蛋白，被认为参与病毒的附着、穿透和膜融合。因此，我们选择ZIKV E作为研究对象，对盐酸氯丙嗪和诺康唑抑制ZIKV感染的原因进行了研究和评价。如图19所示经CPZ处理的Western blotts实验结果表明，ZIKV感染对ZIKV E的合成有显著影响，与翻译抑制剂诺可达唑感染的细胞中观察到的结果相似。同时，如图20、21所示CPZ和诺可达唑也表现出一定的副作用，这意味着这两种药物不仅可以抑制微管聚合，而且可以通过干扰细胞内转运而导致细胞凋亡。此外，为了测试探针量子点的生物应用能力，用细胞测试了探针量子点的细胞毒性。如图22、23所示，与不同浓度的量子点孵育后，细胞内无明显变化，说明探针量子点可以在活体***中使用，以及照射时间不同，对细胞影响情况如图24所示。综上所述，上述结果表明，ZIKV-量子点可以通过监测不同条件下量子点的荧光来准确定位和定位ZIKV病毒。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (3)

1.一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略，其特征在于：
步骤是：
先将9，10-菲醌官能化到寨卡病毒中，操作包括：11 mg 9，10-菲醌，分散于10 ml MES缓冲液中；加入80 mg EDC和120 mg NHS，超声作用，封口，振荡；然后将浓度为2 mg/ml的寨卡病毒100 μL分散在10 ml PBS中，加入上述MES缓冲液，振荡；
将乙烯基醚官能化到量子点中，操作包括：取摩尔浓度为8×10-6 μM含氨基的量子点1μL，再取含羧基的乙烯基醚1000 μL，EDCI 15.3 mg，4-二甲胺基吡啶9.8 mg，加入5 ml二氯甲烷完全溶解；室温黑暗环境中摇动；
然后，在照射下通过环化反应将寨卡病毒标记为荧光量子点，操作包括：将9，10-菲醌基修饰的寨卡病毒和乙烯基醚基修饰的量子点溶解在CH3CN和PBS混合溶液中，然后用LED灯照射1min进行环化反应将寨卡病毒标记为荧光量子点，得到量子点修饰的寨卡病毒ZIKV-Qds。
2.根据权利要求1所述的一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略，其特征在于：
所述将9，10-菲醌官能化到寨卡病毒中的详细操作包括：11 mg 9，10-菲醌，分散于10ml MES缓冲液中；加入80 mg EDC和120 mg NHS，超声作用15s，封口，37℃振荡15 min；然后将浓度为2 mg/ml的寨卡病毒100 μL分散在10 ml PBS中，加入上述MES缓冲液，37℃振荡过夜，经NAP-5脱盐柱净化，得到9，10-菲醌修饰的寨卡病毒。
3.根据权利要求1所述的一种利用光点击生物正交反应的寨卡病毒可视化标记策略，其特征在于：
所述将乙烯基醚官能化到量子点中的操作包括：取摩尔浓度为8×10-6μM含氨基的量子点1 μL，再取含羧基的乙烯基醚1000 μL，EDCI 15.3 mg，4-二甲胺基吡啶9.8 mg，分别放入三颈烧瓶中，加入5 ml二氯甲烷完全溶解；然后在室温黑暗环境中摇动2小时；然后通过硅胶柱层析得到乙烯基醚基修饰的量子点。
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