CN112608979B - 微珠芯片及其电镀入孔式制备方法 - Google Patents

微珠芯片及其电镀入孔式制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了微珠芯片及其电镀入孔式制备方法。微珠芯片的电镀入孔式制备方法，包括如下步骤：步骤一，硅板表面预处理；将光刻胶层均匀旋涂到硅板的表面致使形成一层均匀的光刻胶层，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶层上；步骤二，硅板固定到硅板固定装置上，所述硅板固定装置将硅板、透明中空隔膜以及ITO导电玻璃三者从下至上堆叠并固定，使得硅板与ITO导电玻璃之间形成流通间隙；步骤三，装载二氧化硅微球：并将注射泵与硅板固定装置上的流通间隙导通；硅板与ITO导电玻璃分别接上脉冲直流电源的导电正极以及导电负极，注射泵与脉冲直流电源同时打开；步骤四，清洗去除剩余光刻胶层。

Description

微珠芯片及其电镀入孔式制备方法
技术领域
本发明涉及半导体技术领域，具体涉及微珠芯片及其制备方法。
背景技术
相比测序技术而言，高密度生物芯片拥有成本低、检测位点量大、格式统一、分析快等优势利用生物芯片技术，英国、美国均已建立了大规模人群的基因库。
新冠肺炎疫情背景下，欧洲、美国启动了对新冠患者的群体基因组检测，并采用了生物芯片技术，研究基因和新冠易感性之间的关系。
硅板是生物芯片的主要承载基体。硅板表面有超过3亿个小孔，每个小孔用来固定一个微珠，小孔按照蜂窝状排列。
如何提高微珠的入孔率是生物芯片生产过程中的难点之一。
专利文献1(CN111282604A)公开了一种生物化学芯片微球进入的方法，利用起泡剂产生的气泡，规范已经进入生物化学芯片的微球的范围。其步骤主要包括取生物化学芯片，进入微球溶液，然后通过化学连接或者物理方式将微球固定在生物化学芯片的内表面；再通入有气泡的起泡剂溶液，使用气泡将靠近内表面的微球清除，保留生物化学芯片内表面上的预先加工好的微结构内部的微球。缺陷在于，1)微球进入后，需要气泡进行清除，步骤繁琐。2)微球个数与坑面个数为2：1时，进入率约80％，微珠的消耗量较大，利用率低下。
因此，目前面临的技术性难题在于研发一款提高微珠入孔率以及利用率的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供微珠芯片的电镀入孔式制备方法，以解决现有入孔率低以及利用率低的技术问题。
本发明提供一种微珠芯片，以解决现有微珠芯片的入孔率低以及利用率低的技术问题。
本发明的技术方案是：微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，硅板表面预处理；
将光刻胶层均匀旋涂到硅板的表面致使形成一层均匀的光刻胶层，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶层上，在光刻胶层镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的小孔结构；
步骤二，硅板的固定；
硅板固定到硅板固定装置上，所述硅板固定装置将硅板、透明中空隔膜以及ITO导电玻璃三者从下至上堆叠并固定，使得硅板与ITO导电玻璃之间形成流通间隙；
所述硅板的光刻胶层朝向ITO导电玻璃；
所述透明中空隔膜的厚度为100μm-110μm；
步骤三，装载二氧化硅微球：
将二氧化硅微球用导电率在40uS/cm-100μS/cm的导电液洗净并稀释到固体浓度为0.1％-0.2％的状态的待注射溶液；
将待注射溶液放入注射泵中，并将注射泵与硅板固定装置上的流通间隙导通；
硅板与ITO导电玻璃分别接上脉冲直流电源的导电正极以及导电负极，注射泵与脉冲直流电源同时打开，并持续30-180秒，保证注射泵中的液体流速在3uL/s–15uL/s之间；
步骤四，清洗去除剩余光刻胶层。
本专利通过优化硅板的结构，提高了微珠入孔率以及利用率。
硅板蚀刻时对纯硅晶圆表面做光刻胶层处理，在硅板表面形成一层1um左右的光刻胶层(导电性极差)。在将掩膜板表面图案转移到晶圆上的光刻胶层上时，保证充分曝光，使得曝光后的图案上单晶硅已经裸露于空气中(图案部分的光刻胶层被充分反应完全)，这样小孔图案部分表面即为导电性良好的单晶硅，而非小孔图案部分的表面仍为导电性较差的光刻胶层。在电镀过程中，导电玻璃到微孔的电势差会远高于到光刻胶层的电势差。
本专利还通过优化硅片的固定方式，通过混合有微珠的导电液通过流通间隙中形成电场，微珠溶液从电极之间流过，洛伦兹力使得微珠进入孔内，进而提高了微珠入孔率以及利用率。
进一步优选地，步骤三中，将混合有二氧化硅微球的导电液超声3分钟以上后，置于涡旋震荡仪30秒进行清洗，离心机在3000g的转速下离心6分钟进行固液分离。
进一步优选地，所述硅板固定装置包括一用于承载硅板的底板，所述底板呈镂空状；
所述硅板固定装置还包括一夹持机构，所述夹持机构用于从上至下依次堆叠排布的ITO导电玻璃、透明中空隔膜、硅板以及底板之间的夹紧固定，所述硅板的上表面刻蚀有小孔结构；
所述透明中空隔膜的通孔的左右方向的长度大于底板以及ITO导电玻璃，所述透明中空隔膜的通孔的左右两端均外露出ITO导电玻璃；
所述ITO导电玻璃、透明中空隔膜以及硅板围成所述流通间隙，以所述透明中空隔膜的通孔的左右两端均外露出ITO导电玻璃的区域分别为所述流通间隙的进口以及出口；
所述硅板固定装置还包括一用于输送微珠溶液的输送通道，所述微珠溶液是混合有二氧化硅微珠的导电液，所述输送通道的进口与注射泵导通，所述输送通道的出口与所述进口导通，所述出口与一回收箱导通；
所述脉冲直流电源的导电正极用于穿过所述底板的镂空区域与硅板相抵，所述脉冲直流电源的导电负极与所述ITO导电玻璃相抵。
本专利通过在缝隙中形成电场，微珠溶液从导电正极以及导电负极之间流过，洛伦兹力使得微珠进入孔内。由于流通间隙的设置，提高了微珠的入孔率以及利用率。
进一步优选地，所述二氧化硅微球耦连了带有负电荷的寡核苷酸链。寡核苷酸链水解电离呈负电荷。当带电荷的微球经过带有小孔图案的硅板表面时，由于受到的电场力较大，微球受到的方向向单晶硅表面的洛伦兹力更大，故微球会优先向微孔中聚集，提高微珠的入孔率。
二氧化硅微球耦连寡核苷酸链的方法，包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
将二氧化硅微球配制成10mg/mL-200mg/mL的二甲苯悬浮液；加入硅烷化试剂，硅烷化试剂在混合液中的体积浓度为10％以下，充分反应，使二氧化硅微球表面修饰上氨基；
B.激活二氧化硅微球
将步骤A获得的表面修饰上氨基的二氧化硅微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为10mg/mL-200mg/mL；加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，摇晃反应；用乙腈清洗去除多余反应物，再让二氧化硅微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，调pH值至7.5-8.5；
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，与步骤B获得的二氧化硅微球硼酸钠悬浮液混合，其中二氧化硅微球含量为10-100mg，震荡反应5-8小时后进行1000-3000rpm离心处理，保留上清液；清洗、干燥。
进一步优选地，所述硅板是光刻胶层刻蚀后的硅板；
所述硅板的上表面设有0.9μm-1.1μm的光刻胶层，所述小孔结构位于所述光刻胶层上，所述小孔结构贯穿所述光刻胶层，使得所述硅板局部外露。
硅板的结构设计有利于电镀。硅板蚀刻时对纯硅晶圆表面做光刻胶层处理，在硅板表面形成一层1um左右的光刻胶层(导电性极差)。在将掩膜板表面图案转移到晶圆上的光刻胶层上时，保证充分曝光，使得曝光后的图案上单晶硅已经裸露于空气中(图案部分的光刻胶层被充分反应完全)，这样小孔图案部分表面即为导电性良好的单晶硅，而非小孔图案部分的表面仍为导电性较差的光刻胶层。在电镀过程中，导电玻璃到微孔的电势差会远高于到光刻胶层的电势差。
进一步优选地，所述导电液的导电率在40uS/cm–100uS/cm之间，pH值小于9大于5。
进一步优选地，所述导电液包括4.2-4.8mM三羟甲基氨基甲烷、4.2-4.8mM硼酸以及质量百分比浓度为0.01％-0.03％Triton X-100。
进一步优选地，所述导电液的pH值为8.5-8.7，电导率为60-62μS/cm。
进一步优选地，所述导电液包括4.5mM三羟甲基氨基甲烷、4.5mM硼酸以及0.01％Triton X-100。pH值为8.7，电导率为62μS/cm。
进一步优选地，所述二氧化硅微球的直径在0.5um-5um之间。二氧化硅微球的CV<5.0％。
进一步优选地，所述脉冲直流电源的电压为1.0V–10.0V，频率为1Hz-20Hz，循环周期为5％-40％。所述脉冲直流电源的频率为1Hz，循环周期为5％，也就是说1秒钟内5％的时间供电，其余时间不供电。所述脉冲直流电源的频率为20Hz，循环周期为40％，也就是说20秒钟内40％的时间供电，其余时间不供电。
所述微珠芯片的电镀入孔式制备方法的制备的微珠芯片。
有益效果：1)制备步骤的优化，传统光刻胶刻蚀后立即去除光刻胶。本专利光刻胶在微珠入孔后清洗去除。这样硅板表面的小孔结构为导电性良好的单晶硅，而非小孔结构区域由于光刻胶的保留，仍为导电性较差的光刻胶层。在电镀过程中，导电玻璃到微孔的电势差会远高于到光刻胶层的电势差。有利于提高微珠的入孔。
2)通过混合有微珠的导电液通过流通间隙中形成电场，微珠溶液从电极之间流过，洛伦兹力使得微珠进入孔内，进而提高了微珠入孔率以及利用率。
3)使微球的入孔率达到99.5％-99.9％。
4)微球利用率高，不会留在表面后续不需要处理。
5)二氧化硅微球耦连寡核苷酸链的方法中，硅烷化试剂的浓度和三聚氰氯的浓度，其分别保证了微球表面氨基的密度和连接基团的密度，以用于最终与寡核苷酸链连接。连接效率可达到1000-10000个寡核苷酸链/平方微米，大大节省了制作成本，为后续生物芯片的制作提供了稳定且保存时间长的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球产品。
附图说明
图1为本发明微珠芯片的电镀入孔式制备方法的流程图；
图2为本发明硅板固定装置的***分解图；
图3为本发明硅板固定装置的剖视图；
图4为本发明具体实施例1制备的产品的显微镜图；
图5为本发明具体实施例2制备的产品的显微镜图；
图6为本发明具体实施例3制备的产品的显微镜图；
图7为本发明对比实验例1制备的产品的显微镜图；
图8为本发明对比试验例2制备的产品的显微镜图；
图9为本发明对比试验例3制备的产品的显微镜图。
图中：1为底板，2为硅板，3为透明中空隔膜，4为ITO导电玻璃，5为夹持机构。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
参见图1，具体实施例1，微珠芯片的电镀入孔式制备方法，包括如下步骤：
步骤一，硅板表面预处理；
将硅板置于转速为2000rpm的旋涂仪上选涂时间为30s，使得在上附有一层光刻胶层，利用步进式电机进一步将掩膜板上的图案转移到硅板上，硅板的表面形成微孔结构；
步骤二，硅板的固定；硅板固定装置按照底板、硅板(光刻胶层朝向透明中空隔膜)、透明中空隔膜、ITO导电玻璃的顺序从下至上堆叠并固定，使得硅板与ITO导电玻璃之间形成流通间隙；
步骤三，装载二氧化硅微球：
二氧化硅微球耦连有寡核苷酸链。
二氧化硅微球的直径为0.5um，二氧化硅微球的CV<5.0％。将二氧化硅微球用导电液洗净并稀释到固体浓度为0.1％的状态的待注射溶液。具体步骤为，将混合有二氧化硅微球的导电液超声3分钟，置于涡旋震荡仪30秒进行清洗，离心机在3000g的转速下离心6分钟进行固液分离。固体浓度是质量百分比浓度。
导电液包括4.5mM三羟甲基氨基甲烷、4.5mM硼酸以及质量百分比浓度为0.02％Triton X-100。pH值为8.7，电导率为62μS/cm。
将待注射溶液放入注射泵中，并将注射泵与硅板固定装置上的流通间隙导通；
硅板与ITO导电玻璃分别接上电压供给***的导电正极以及导电负极，注射泵与脉冲直流电源同时打开，以30秒为一次注射周期，循环注射三次，保证注射泵中的液体流速在3uL/s之间；
脉冲直流电源的电压为1.0V，频率为1Hz，循环周期为5％；
步骤四，清洗去除硅板表面的光刻胶层。
参见图4，采用本实施例方法，获得微珠入孔率约为87％，微珠利用率为80％以上。
具体实施例2，一种提高微珠入孔率的电镀方法，采用微珠芯片的电镀入孔式制备方法进行电镀，包括如下步骤：
步骤一，硅板表面预处理；
将硅板置于转速为2000rpm的旋涂仪上选涂时间为30s，使得在上附有一层光刻胶层，利用步进式电机进一步将掩膜板上的图案转移到硅板上，硅板的表面形成微孔结构；
步骤二，硅板的固定；硅板固定装置按照底板、硅板(光刻胶层朝向透明中空隔膜)、透明中空隔膜、ITO导电玻璃的顺序从下至上堆叠并固定，使得硅板与ITO导电玻璃之间形成流通间隙；
步骤三，装载二氧化硅微球：
二氧化硅微球耦连有寡核苷酸链。
二氧化硅微球的直径为5um，二氧化硅微球的CV<5.0％。将二氧化硅微球用导电液洗净并稀释到固体浓度为0.2％的状态的待注射溶液；
导电液包括4.5mM三羟甲基氨基甲烷、4.5mM硼酸以及质量百分比浓度为0.02％Triton X-100。pH值为8.7，电导率为62μS/cm。
将待注射溶液放入注射泵中，并将注射泵与硅板固定装置上的流通间隙导通；
硅板与ITO导电玻璃分别接上电压供给***的导电正极以及导电负极，注射泵与脉冲直流电源同时打开，以180秒为一次注射周期，循环注射三次，保证注射泵中的液体流速在15uL/s之间；
脉冲直流电源的电压为10.0V，频率为20Hz，循环周期为40％；
步骤四，清洗去除硅板表面的光刻胶层。
参见图5，采用本实施例方法，获得微珠入孔率约为99.8％，微珠利用率为80％以上。
具体实施例3，一种提高微珠入孔率的电镀方法，采用微珠芯片的电镀入孔式制备方法进行电镀，包括如下步骤：
步骤一，硅板表面预处理；
将硅板置于转速为2000rpm的旋涂仪上选涂时间为30s，使得在上附有一层光刻胶层，利用步进式电机进一步将掩膜板上的图案转移到硅板上，硅板的表面形成微孔结构；
步骤二，硅板的固定；硅板固定装置按照底板、硅板(光刻胶层朝向透明中空隔膜)、透明中空隔膜、ITO导电玻璃的顺序从下至上堆叠并固定，使得硅板与ITO导电玻璃之间形成流通间隙；
步骤三，装载二氧化硅微球：
二氧化硅微球耦连有寡核苷酸链。
二氧化硅微球的直径为3um，二氧化硅微球的CV<5.0％。
将二氧化硅微球用导电液洗净并稀释到固体浓度为0.15％的状态的待注射溶液；
导电液包括4.5mM三羟甲基氨基甲烷、4.5mM硼酸以及质量百分比浓度为0.02％Triton X-100。pH值为8.7，电导率为62μS/cm。
将待注射溶液放入注射泵中，并将注射泵与硅板固定装置上的流通间隙导通；
硅板与ITO导电玻璃分别接上电压供给***的导电正极以及导电负极，注射泵与脉冲直流电源同时打开，以100秒为一次注射周期，循环注射三次，保证注射泵中的液体流速在9uL/s之间；
脉冲直流电源的电压为5.0V，频率为10Hz，循环周期为22％；
步骤四，清洗去除硅板表面的光刻胶层。
参见图6，采用本实施例方法，获得微珠入孔率约为93％，微珠利用率为80％以上。
对比试验例1：其他同实施例3，区别仅步骤一中，硅板的表面形成微孔结构后，清洗取出光刻胶层。
参见图7，采用本实施例方法，获得微珠入孔率大于93％，微珠利用率大于40％。
对比试验例2：其他同实施例3，区别仅步骤二中，导电液的电导率为30uS/cm。导电液包括4.5mM三羟甲基氨基甲烷、4.2mM硼酸以及质量百分比浓度为0.02％Triton X-100。
参见图8，采用本实施例方法，获得微珠入孔率约为50％，微珠利用率为80％以上。
对比试验例3：其他同实施例3，区别仅步骤三中，注射泵中的液体流速在60uL/s。
参见图9，采用本实施例方法，获得微珠入孔率约为60％，微珠利用率为80％以上。
微珠入孔率 微珠利用率
具体实施例1 ≈87％ >＝80％
具体实施例2 ≈99.8％ >＝80％
具体实施例3 ≈93％ >＝80％
对比实验例1 ≈93％ ≈40％
对比实验例2 ≈50％ >＝80％
对比实验例3 ≈60％ >＝80％
上述具体实施例1、2、3以及对比试验例中的，硅板固定装置均包括一用于承载硅板2的底板1，底板1呈镂空状；硅板固定装置还包括一夹持机构5，夹持机构5用于从上至下依次堆叠排布的ITO导电玻璃4、透明中空隔膜3、硅板2以及底板1之间的夹紧固定，硅板2的上表面刻蚀有小孔结构；透明中空隔膜的厚度为110μm，透明中空隔膜3的通孔的左右方向的长度大于底板1以及ITO导电玻璃4，透明中空隔膜3的通孔的左右两端均外露出ITO导电玻璃4；以透明中空隔膜3的通孔的左右两端均外露出ITO导电玻璃4的区域分别为与流通间隙导通的进口以及出口；
还包括一用于输送微珠溶液的输送通道，微珠溶液是混合有二氧化硅微珠的导电液，输送通道的进口与注射泵导通，输送通道的出口与进口导通，出口与一回收箱导通；
脉冲直流电源的导电正极用于穿过所述底板的镂空区域与硅板相抵，所述脉冲直流电源的导电负极与所述ITO导电玻璃相抵。
底板1是一绝缘件，底板1包括前后设置的支撑杆以及用于连接支撑杆的连接杆，支撑杆的内侧设有条状突起，条状突起与连接杆的顶部齐平。夹持机构5是一金属夹持件，金属夹持件包括左右镜像对称设置的夹持臂，夹持臂用于夹持在底板1的前后两侧，金属夹持件的中央设有向下凹陷的下凹部，下凹部的左右两端分别连接有夹持臂。下凹部与导电玻璃相抵。
具体实施例5，所述二氧化硅微球耦连了带有负电荷的寡核苷酸链。当带电荷的微球经过带有小孔图案的硅板表面时，由于受到的电场力较大，微球受到的方向向单晶硅表面的洛伦兹力更大，故微球会优先向微孔中聚集，提高微珠的入孔率。
二氧化硅微球耦连寡核苷酸链的方法，包括以下步骤：
A.二氧化硅微球表面修饰氨基
原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径3um，将其配制成100mg/mL的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为1.0％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。
B.激活二氧化硅微球
将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为100mg/mL。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3-5次去除多余反应物和产物后，再用2M的硼酸钠缓冲液冲洗3-5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的pH值调整至7.5-8.5。
C.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解(寡核苷酸链的长度为15mer，末端修饰氨基)，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为50mg，将混合液在室温下震荡5-8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000-3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3-5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。
将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带FAM荧光基团)，在比相应寡核苷酸链的解链温度低20℃的条件下培育30分钟，检测其荧光强度。检测时微球浓度为2mg/mL，所使用的激发/发射滤光片为488nm/520nm。本发明中提到的所有荧光强度均在上述条件下测得。荧光强度与浓度的换算使用标准曲线(由配制的标准物测荧光值得到)：C＝8.797e-7*I-0.0055。其中C为荧光基团的浓度，单位nmol/mL，I为荧光强度。则由荧光强度可以得到荧光基团浓度，又已知微球的量，从而可以计算得到单位表面积上荧光基团的个数。从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到约9500-10500个寡核苷酸链/平方微米(微球粒径3um，多次测量荧光强度为40048、42619、39890)。
有益效果：1)使微球的入孔率达到99.5％-99.9％。
2)微球利用率高，不会留在表面后续不需要处理。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一，硅板表面预处理；
将光刻胶层均匀旋涂到硅板的表面致使形成一层均匀的光刻胶层，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶层上，在光刻胶层镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的小孔结构；
步骤二，硅板的固定；
硅板固定到硅板固定装置上，所述硅板固定装置将硅板、透明中空隔膜以及ITO导电玻璃三者从下至上堆叠并固定，使得硅板与ITO导电玻璃之间形成流通间隙；
所述硅板的光刻胶层朝向ITO导电玻璃；
所述透明中空隔膜的厚度为100μm-110μm；
步骤三，装载二氧化硅微球：
所述二氧化硅微球耦连了带有负电荷的寡核苷酸链；
将二氧化硅微球用导电率在40μS/cm-100μS/cm的导电液洗净并稀释到固体浓度为0.1%-0.2%的状态的待注射溶液；
将待注射溶液放入注射泵中，并将注射泵与硅板固定装置上的流通间隙导通；
硅板与ITO导电玻璃分别接上脉冲直流电源的导电正极以及导电负极，注射泵与脉冲直流电源同时打开，并持续30-180秒，保证注射泵中的液体流速在3μL/s–15μL/s之间；
步骤四，清洗去除剩余光刻胶层。
2.根据权利要求1所述的微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：步骤三中，将混合有二氧化硅微球的导电液超声3分钟后，置于涡旋震荡仪30秒进行清洗，离心机在3000g的转速下离心6分钟进行固液分离。
3.根据权利要求1所述的微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：所述硅板固定装置包括一用于承载硅板的底板，所述底板呈镂空状；
所述硅板固定装置还包括一夹持机构，所述夹持机构用于从上至下依次堆叠排布的ITO导电玻璃、透明中空隔膜、硅板以及底板之间的夹紧固定，所述硅板的上表面刻蚀有小孔结构；
所述透明中空隔膜的通孔的左右方向的长度大于底板以及ITO导电玻璃，所述透明中空隔膜的通孔的左右两端均外露出ITO导电玻璃；
所述ITO导电玻璃、透明中空隔膜以及硅板围成所述流通间隙，以所述透明中空隔膜的通孔的左右两端均外露出ITO导电玻璃的区域分别为所述流通间隙的进口以及出口；
所述硅板固定装置还包括一用于输送微珠溶液的输送通道，所述微珠溶液是混合有二氧化硅微珠的导电液，所述输送通道的进口与注射泵导通，所述输送通道的出口与所述进口导通，所述出口与一回收箱导通；
所述脉冲直流电源的导电正极用于穿过所述底板的镂空区域与硅板相抵，所述脉冲直流电源的导电负极与所述ITO导电玻璃相抵。
4.根据权利要求1所述的微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：二氧化硅微球耦连寡核苷酸链的方法，包括以下步骤：
A. 二氧化硅微球表面修饰氨基
将二氧化硅微球配制成10mg/mL-200mg/mL的二甲苯悬浮液；加入硅烷化试剂，硅烷化试剂在混合液中的体积浓度为1%，充分反应，使二氧化硅微球表面修饰上氨基；
B. 激活二氧化硅微球
将步骤A获得的表面修饰上氨基的二氧化硅微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为10mg/mL-200mg/mL；加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，摇晃反应；用乙腈清洗去除多余反应物，再让二氧化硅微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，调pH值至7.5-8.5；
C. 二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，与步骤B获得的二氧化硅微球硼酸钠悬浮液混合，其中二氧化硅微球含量为10-100mg，震荡反应5-8小时后进行1000-3000rpm离心处理，保留上清液；清洗、干燥。
5.根据权利要求1所述的微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：所述导电液的pH值小于9大于5。
6.根据权利要求1所述的微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：所述导电液包括4.2-4.8 mM三羟甲基氨基甲烷、4.2-4.8 mM硼酸以及质量百分比浓度为0.01%-0.03%Triton X-100。
7.根据权利要求1所述的微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：所述二氧化硅微球的直径在0.5μm-5μm之间。
8.根据权利要求1所述的微珠芯片的电镀入孔式制备方法，其特征在于：所述脉冲直流电源的电压为1.0V–10.0V，频率为1Hz-20Hz，循环周期为5%-40%。
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