CN112608893A - 胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法 - Google Patents

胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112608893A
CN112608893A CN202011568941.7A CN202011568941A CN112608893A CN 112608893 A CN112608893 A CN 112608893A CN 202011568941 A CN202011568941 A CN 202011568941A CN 112608893 A CN112608893 A CN 112608893A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
mesenchymal stem
cells
primary
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011568941.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112608893B (zh
Inventor
王正
刘冰
肖海蓉
汤乐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BOYALIFE Inc
Original Assignee
BOYALIFE Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BOYALIFE Inc filed Critical BOYALIFE Inc
Priority to CN202011568941.7A priority Critical patent/CN112608893B/zh
Publication of CN112608893A publication Critical patent/CN112608893A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112608893B publication Critical patent/CN112608893B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法。具体涉及用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM‑F12培养基为基质配制并包含：血小板裂解物、人血白蛋白、重组胰岛素、EGF等等。分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中在分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段使用原代完全培养基培养得到原代胎盘间充质干细胞，P0代及后续的代次使用传代完全培养基培养细胞得到P1至P10代的间充质干细胞。本发明方法呈现如说明书所述优异效果，尤其是通过使用无血清的培养基获得高收率且高活率的间充质干细胞。

Description

胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种从胎盘中分离和传代胎盘间充质干细胞的方法。本发明还涉及上述胎盘间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液，还涉及无血清培养基在分离和传代胎盘间充质干细胞中的用途。使用本发明方法分离培养所述胎盘间充质干细胞时，能够呈现本发明所述优异技术效果。特别是，本发明涉及使用无血清的培养基从胎盘中分离培养间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。
干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏***疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。
间充质干细胞的分离培养以及传代培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行分离培养和传代培养时，所用的培养基多需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10％胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)对间充质干细胞进行分离和培养传代。
然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清的分离和传代培养间充质干细胞是有意义的。
现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、工艺复杂、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如，CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6)公开了一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，采用收集胎盘母体侧蜕膜组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，再行正、负向免疫分选结合的方法纯化胎盘间充质干细胞，获得CD34－CD105+细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。据信该发明方法每次只需少量原代细胞(1×105个细胞)就可以达到比较好的分选效果，可进一步提高了胎盘间充质干细胞的纯化率。所用培养体系不但对胎盘间充质干细胞具有明显的扩增优势，并且扩增的细胞具备多分化潜能。可在纯化胎盘间充质干细胞和体外扩增培养中应用。CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9)公开了一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，其工艺步骤为：首先将胎盘、脐带或脂肪组织与细胞保养液按2.5～4∶1的重量比混合放入组织粉碎桶中，粉碎后加入胶原酶混匀，在37℃左右条件下孵育，过滤，加入沉淀剂，静置后吸取上清液，离心，除去上清液，将浓缩的细胞加入到泛影酸钠-聚蔗糖400#的液体上，再离心，收取中间10-15ml的细胞层，用细胞保养液清洗，将收集的细胞计数，检测细胞存活率≥95％时，即可以供临床使用。据信该发明不仅实现了从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取所有干细胞，而且实现了工业化生产，使医生在临床上方便、安全、规范地获取成体干细胞，像用药一样地使用成体干细胞治疗病人的疾病，解决临床上很难获取成体干细胞的瓶颈，推广细胞治疗技术。CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1)公开了一种从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法。发明利用早期流产胎儿胎盘组织提取更原始的人胎盘间充质干细胞，并建立了一种在胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养的体系。据信该发明使干细胞的遗传信息及表型更稳定，干细胞特性更原始，并且能有效地扩增细胞，提高产品质量，获得稳定均一的胎盘间充质干细胞，解决了干细胞治疗需要大批量干细胞的问题，可用于多种疾病的治疗。另外，CN102676451A(中国专利申请号201210044648X)公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养；(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞；以及任选的下列一个或多个步骤：(f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；(h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联。据信通过该本发明方法可以获得高纯度的胎盘间充质干细胞。这些方法在工艺简便性和/或提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。另外，本申请的发明人团队的发明公布CN107299082A(中国专利申请号201710653583.1，公开日2018年10月27日)中记载了一种获取胎盘间充质干细胞的方法已经显示呈现一些优良性能。
尽管现有技术公开了一些诸如上述的有关胎盘间充质干细胞的培养方法，然而这些方法多需要使用包含较浓度胎牛血清的培养基。
本领域仍然期待提供一种新的方法来分离培养甚至传代培养间充质干细胞，尤其是提供一种无胎牛血清的新方法进行间充质干细胞分离培养甚至传代培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的方法来制备胎盘间充质干细胞，特别是提供一种适用于从胎盘中分离获取胎盘间充质干细胞的方法，以及将所得干细胞进行传代的方法，并且期待这种方法能够呈现出细胞收率高和/或细胞活率高等特性和/或其它优异性能。本发明已经出人意料的发现使用本发明方法能够获得如本发明所述一个或多个方面的技术效果。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了分离培养原代胎盘间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的胎盘样本；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×105/cm2接种至T225瓶，例如是指按照细胞量2×105/cm2接种至T225瓶。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，以100xg离心10min。
根据本发明第一方面的方法，其中所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，其中所述原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF。
根据本发明第一方面的方法，其中所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替。根据本发明第一方面的方法，其中所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。
根据本发明第一方面的方法，其中所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，其中还包括对分离培养获得的原代胎盘间充质干细胞进行检测。例如检测细胞形态和/或免疫表型鉴定。在一个实施方案中，所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。本发明所得原代胎盘间充质干细胞的CD73、CD90、CD105均呈阳性(均大于98％)，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性(均小于2％)。
进一步的，本发明第二方面提供了分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中
(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的胎盘样本；
(a2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；
(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；
(a5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)；
(b)传代培养胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×105/cm2接种至T225瓶，例如是指按照细胞量2×105/cm2接种至T225瓶。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a4)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a5)中，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a5)中，以100xg离心10min。
根据本发明第二方面的方法，其中所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml。例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第二方面的方法，其中所述原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF。
根据本发明第二方面的方法，其中所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替。根据本发明第二方面的方法，其中所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。
根据本发明第二方面的方法，其中所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
根据本发明第二方面的方法，其中还包括对分离培养获得的原代胎盘间充质干细胞进行检测。例如检测细胞形态和/或免疫表型鉴定。在一个实施方案中，所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。本发明所得原代胎盘间充质干细胞的CD73、CD90、CD105均呈阳性(均大于98％)，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性(均小于2％)。
在本发明上下文中，提及的传代完全培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。
进一步的，本发明第三方面提供了一种用于分离培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。
进一步的，本发明第四方面提供了一种用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。
在本发明中，表示细胞数量时，“10^6”表示10的6次方；在本发明中，表示培养面积时，“cm^2”表示平方厘米；其它涉及“^”符号的情形，均具有类似含义；此符号的含义在本领域中亦是公知的。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。
在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围，并且这些PBS缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的PBS通常是pH7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如HyClone品牌的PBS缓冲液；本领域经典的应用时的PBS缓冲液组成中包括137mM氯化钠、2.7nM氯化钾和10mM磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用PBS使用时的组成均为该组成。
本发明方法分离培养胎盘间充质干细胞，所得胎盘间充质干细胞具有非常高的活率且具有非常高的收率。本发明方法呈现如本文描述的一个或多个方面的优异技术效果。
附图说明
图1：原代间充质干细胞的显微镜下细胞形态(100×)。
图2：原代细胞定向分化潜能，A)成脂对照，B)成脂诱导；C)成骨对照，D)成骨诱导；E)成软骨对照，F)成软骨诱导。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
在本发明中，试验中用到的血小板裂解物可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Sigma-Aldrich的PLTGold Human Platelet Lysate，其货号为SCM151。
在本发明中，试验中用到的Ⅱ型胶原酶可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Gibco。
在本发明中，试验中用到的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Sigma-Aldrich，其货号为GF003。
在本发明中，试验中用到的EGF(表皮生长因子)可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Gibco，其货号为PHG0311L。
在本发明中，试验中用到的重组胰岛素可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自Solarbio，其货号为I8830。
在本发明中，试验中用到的重组胰酶溶液可以容易从市场购得，如未特别说明，本文试验中使用的是购自兰博康斯公司的2000u/ml浓度的重组胰酶溶液，货号RT2S01。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的D-Hanks液其配方组成和制法如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF。
在本发明中，如未特别说明，试验中用到的原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。
在本发明的具体实验中，对所制得的某代次干细胞取样，用sysmex血球计数仪进行有核细胞即MSC细胞计数，通过台盼兰染色检测细胞活率，并取样用于微生物检测。
实施例1：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本AT)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
上述步骤(1)～(5)在步骤(4)中以2×105/cm2量接种至T225瓶后，每瓶获得有核细胞数量(重复执行5次的均值)为1.47×10^6(n＝5)(本文中，此数据可称为细胞收获量)，且细胞活率94.6％(n＝5)。
实施例1a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例1；
(4)取实施例1之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
本实施例1a上述步骤(1)～(5)在步骤(4)中以2×105/cm2量接种至T225瓶后，每瓶获得有核细胞数量(重复执行5次的均值)为7.38×10^6(n＝5)(本文中，此数据可称为细胞收获量)，且细胞活率92.6％(n＝5)。
实施例1b：照实施例1a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。本实施例1b的原代胎盘间充质干细胞的细胞收获量为1.41×10^6(n＝5)、细胞活率91.1％(n＝5)。
实施例1c：照实施例1a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。本实施例1b的原代胎盘间充质干细胞的细胞收获量为1.21×10^6(n＝5)、细胞活率93.7％(n＝5)。
在本文中，实施例1a、实施例1b、实施例1c亦可以称为实施例1的附属实例，而实施例1可称为主实例，它们相互之间可称为实例族。
与实施例1相比，实施例1a、实施例1b、实施例1c细胞活率基本相同，均在91～95％范围内；但是，实施例1a细胞收获量是实施例1的大约5.02倍，实施例1b细胞收获量是实施例1的大约0.96倍，实施例1c细胞收获量是实施例1的大约0.82倍；这些出人意料的发现表明，在原代完全培养基中额外添加少量价格低廉的硫代甘油和果糖，不但可以获得细胞活率基本相当的原代干细胞，更令人鼓舞的是细胞收获量显著增加达约5倍之多，在生产成本基本不变的情况下细胞收获量显著增加。但是，当仅仅添加硫代甘油或者仅仅添加果糖时虽然细胞活率未见改变，细胞收获量却并未增加，甚至在仅额外添加硫代甘油时细胞收获量还有明显的降低。
在细胞活率方面，本文主实例实施例2～8以及它们各自的附属a、b、c实例亦呈现与上述实施例1及其附属实例(实施例1a、实施例1b、实施例1c)基本相同的结果，细胞活率均在90～95％范围内，例如实施例2和实施例2a、实施例2b、实施例2c四者所得原代间充质干细胞的细胞活率分别为91.6％、94.2％、92.6％、93.1％。
在细胞收获量方面，本文主实例实施例2～8以及它们各自的附属a、b、c实例亦呈现与上述实施例1及其附属实例(实施例1a、实施例1b、实施例1c)基本相同的趋势甚至结果，主实例实施例2～8的细胞收获量均在(1.31～1.64)×10^6范围内，a组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的4.83～5.61倍，b组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的0.93～1.16倍，c组附属实例的细胞收获量均是其各自主实例的0.73～0.87倍；例如实施例2、实施例2a、实施例2b、实施例2c的细胞收获量(n＝5)分别为1.56×10^6、8.38×10^6(5.37倍)、1.74×10^6(1.12倍)、1.32×10^6(0.85倍)。
对本文主实例实施例1～8以及它们各自的附属a、b、c实例所得原代胎盘间充质干细胞进行检测，细胞形态均正常，免疫表型鉴定显示各原代胎盘间充质干细胞的CD73、CD90、CD105均呈阳性(均大于98％，例如实施例1所得干细胞CD73均大于99.2％)，CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性(均小于2％，例如实施例1所得干细胞CD19均小于0.86％)。
实施例2：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本BT)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例2a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例2；
(4)取实施例2之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例2b：照实施例2a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例2c：照实施例2a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例3：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本CT)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例3a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例3；
(4)取实施例3之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例3b：照实施例3a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例3c：照实施例3a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例4：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本DT)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例4a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例4；
(4)取实施例4之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例4b：照实施例4a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例4c：照实施例4a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例5：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本ET)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例5a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例5；
(4)取实施例5之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例5b：照实施例5a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例5c：照实施例5a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例6：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本FT)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例6a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例6；
(4)取实施例6之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例6b：照实施例6a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例6c：照实施例6a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例7：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本GT)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例7a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例7；
(4)取实施例7之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例7b：照实施例7a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例7c：照实施例7a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例8：分离培养原代胎盘间充质干细胞
(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的志愿者捐献的胎盘(样本HT)；
(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，100xg离心5min，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例8a：分离培养原代胎盘间充质干细胞
步骤(1)至步骤(3)的操作和物料是接续于实施例8；
(4)取实施例8之步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照2×105/cm2接种至T225瓶；置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养；
(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至(第10～11d)细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释，100xg离心10min，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)。
实施例8b：照实施例8a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加硫代甘油，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
实施例8c：照实施例8a进行，不同的仅是原代增补培养基中未添加果糖，分离培养以获取原代胎盘间充质干细胞。
以下实施例11～18所用的传代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。
实施例11：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例1a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
实施例12：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例2a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
实施例13：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例3a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
实施例14：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例4a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
实施例15：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例5a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
实施例16：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例6a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
实施例17：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例7a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
实施例18：胎盘间充质干细胞的传代培养
以实施例8a所得P0代胎盘间充质干细胞进行传代培养，操作如下：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
对实施例11～18所得P1～P10代细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果实施例11所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～97％％范围内，实施例12所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～95％％范围内，实施例13所得P1～P10代细胞的细胞活率均在90～96％％范围内，实施例14所得P1～P10代细胞的细胞活率均在91～96％％范围内，实施例15所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～96％％范围内，实施例16所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～94％％范围内，实施例17所得P1～P10代细胞的细胞活率均在90～96％％范围内，实施例18所得P1～P10代细胞的细胞活率均在89～94％％范围内，例如实施例11所得P1～P10代细胞的细胞活率分别为95.8％、94.7％、96.1％、90.3％、89.8％、92.7％、90.4％、93.7％、94.5％、94.1％。
实施例21：胎盘间充质干细胞的传代培养
参照实施例11进行胎盘间充质干细胞的传代培养，不同的仅是所用传代完全培养基中添加的硫代甘油的量为0.12％，得到P1～P10代胎盘间充质干细胞，将这些细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果P1～P6代细胞的细胞活率均在81～94％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P1代和P6代的细胞活率分别为93.7％和81.7％；P7～P10代细胞的细胞活率继续降低并均在54～83％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P7代和P10代的细胞活率分别为82.3％和54.7％。本实施例结果表明传代完全培养基中添加较高量的硫代甘油对细胞活率的影响是不利的。
实施例22：胎盘间充质干细胞的传代培养
参照实施例11进行胎盘间充质干细胞的传代培养，不同的仅是所用传代完全培养基中不添加硫代甘油，得到P1～P10代胎盘间充质干细胞，将这些细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果P1～P10代细胞的细胞活率均在57～93％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P2代和P8代的细胞活率分别为89.6％和66.8％。本实施例结果表明传代完全培养基中不添加硫代甘油对细胞活率的影响是不利的。
实施例23：胎盘间充质干细胞的传代培养
参照实施例11进行胎盘间充质干细胞的传代培养，不同的仅是所用传代完全培养基中不添加果糖，得到P1～P10代胎盘间充质干细胞，将这些细胞通过台盼兰染色法检测细胞活率，结果P1～P10代细胞的细胞活率均在67～94％范围内且随着代次递增细胞活率降低，例如P2代和P8代的细胞活率分别为91.3％和77.4％。本实施例结果表明传代完全培养基中不添加果糖对细胞活率的影响是不利的。
试验例1：间充质干细胞的检测
间充质干细胞的典型特征包括：显微镜下呈梭形并贴壁生长，流式细胞术鉴定CD73、CD90、CD105均呈阳性且CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均呈阴性，定向分化潜能试验显示细胞呈现成骨、成软骨、成脂的分化潜能。
使用本领域公知的方法对本发明实施例1～8以及它们各自的附属a、b、c实例制得的间充质干细胞进行检测，结果：全部间充质干细胞均呈现梭形并贴壁生长(例如实施例1a所得P0代间充质干细胞的显微镜下细胞形态如图1所示)，全部间充质干细胞的CD73、CD90和CD105均大于98％(例如实施例1a所得一个批次P0代间充质干细胞的CD73＝99.6％、CD90＝99.4％、CD105＝99.9％)，全部间充质干细胞的CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均小于2％(例如实施例1a所得一个批次P0代间充质干细胞的CD19＝0.32％、CD11b＝0.14％、CD31＝0.24％、CD45＝0.17％、HLADR＝0.03％、CD34＝0.26％)，定向分化潜能试验显示全部间充质干细胞均有成骨、成软骨、成脂的分化潜能(例如实施例1a所得一个批次P0代间充质干细胞的成骨、成软骨、成脂的分化潜能结果如图2所示)。
另外，使用本领域公知的方法对本发明实施例11～18所得8种P10代细胞进行检测，结果：全部间充质干细胞均呈现梭形并贴壁生长，8种细胞的CD73、CD90和CD105均大于98％(例如实施例11的P10代间充质干细胞的CD73＝98.4％、CD90＝98.6％、CD105＝99.3％)，8种细胞的CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34均小于2％(例如实施例11的P10代间充质干细胞的CD19＝0.26％、CD11b＝0.41％、CD31＝0.22％、CD45＝0.46％、HLADR＝0.53％、CD34＝0.38％)，定向分化潜能试验显示全部间充质干细胞均有成骨、成软骨、成脂的分化潜能(未图示)。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。
2.根据权利要求1的培养基，所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。
3.根据权利要求2的培养基，所述DMEM-F12培养基的配制方法为：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
4.分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中
(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的胎盘样本；
(a2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；
(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；
(a5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)；
(b)传代培养胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。
5.根据权利要求4的方法，其中：
步骤(a2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；
步骤(a3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作；
步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×105/cm2接种至T225瓶，例如是指按照细胞量2×105/cm2接种至T225瓶；
步骤(a4)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度；
步骤(a5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min；
步骤(a5)中，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释；和/或
步骤(a5)中，以100xg离心10min。
6.根据权利要求4的方法，所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
7.根据权利要求4的方法，其中所述原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF。
8.根据权利要求4的方法，其中所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替；例如，其中所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖。
9.根据权利要求4的方法，其中所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。
10.根据权利要求4的方法，所述传代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。
CN202011568941.7A 2020-12-25 2020-12-25 胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法 Active CN112608893B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011568941.7A CN112608893B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011568941.7A CN112608893B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112608893A true CN112608893A (zh) 2021-04-06
CN112608893B CN112608893B (zh) 2023-03-21

Family

ID=75248135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011568941.7A Active CN112608893B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112608893B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100261274A1 (en) * 2007-09-25 2010-10-14 Vodyanyk Maksym A Generation of clonal mesenchymal progenitors and mesenchymal stem cell lines under serum-free conditions
CN106085952A (zh) * 2016-07-05 2016-11-09 四川华皓生物科技有限公司 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法
CN109234229A (zh) * 2018-09-27 2019-01-18 博雅干细胞科技有限公司 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100261274A1 (en) * 2007-09-25 2010-10-14 Vodyanyk Maksym A Generation of clonal mesenchymal progenitors and mesenchymal stem cell lines under serum-free conditions
CN106085952A (zh) * 2016-07-05 2016-11-09 四川华皓生物科技有限公司 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法
CN109234229A (zh) * 2018-09-27 2019-01-18 博雅干细胞科技有限公司 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
任春红等: "无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究", 《延安大学学报(医学科学版)》 *
张飞等: "两种方法培养人胎盘间充质干细胞的生物特性比较", 《中国组织工程研究》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112608893B (zh) 2023-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6053853B2 (ja) 間葉系幹細胞を調製する方法、その組成物及びキット
US9631176B2 (en) Method for preparing stem cells from fat tissue
KR100973615B1 (ko) 산후 포유류의 태반, 이의 용도 및 태반 줄기세포
KR101211913B1 (ko) 양막유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 양막유래 중간엽 줄기세포의 배양방법
CN112481202B (zh) 血小板裂解物无血清分离培养脐带间充质干细胞的方法
CN107299082B (zh) 从组织中分离胎盘***并培养成间充质干细胞的方法
US20080317718A1 (en) Cell Differentiation Of Adipose-Derived Precursors Cells
JP5431146B2 (ja) 免疫学的寛容および調節性前駆細胞
CN109234229B (zh) 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物
EP3385372B1 (en) Method for manufacturing mesenchymal cell line derived from vertebrate animal adipose tissue
NZ527849A (en) Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom
CN110938590B (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基及其用途
CA3103769A1 (en) Method for producing dental pulp-derived cells
WO2013146992A1 (ja) 歯髄由来の多能性幹細胞の製造方法
CN109628388B (zh) 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞
CN112458047B (zh) 分离胎盘间充质干细胞的方法和使用的无血清培养基
CN112608892B (zh) 血小板裂解物用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法
CN112608893B (zh) 胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法
CN112522193B (zh) 无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途
CN112300986B (zh) 无血清培养基制备脂肪间充质干细胞的方法
CN110951668B (zh) 无血清培养液以及使用其分离和放大培养干细胞的方法
Mohammed EFFECTS OF HUMAN PLATELET LYSATE PREPARATIONS ON THE PROLIFERATION OF BONE MARROW DERIVED MICE MESENCHYMAL STEM CELLS
CN111019889A (zh) 一种间充质干细胞化学成分限定无血清培养基及其用途
WO2017021535A1 (en) Improved cell culture medium for human progenitor cells (hpc)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant