CN112592882A - 一种乳腺上皮细胞分离培养方法 - Google Patents

一种乳腺上皮细胞分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳腺上皮细胞分离培养方法，包括以下步骤：选取妊娠乳腺组织放入加有双抗的PBS缓冲液中反复洗涤，剔除脂肪组织；将乳腺组织剪切成组织块；将剪切的乳腺组织放入培养皿中，加入胶原酶溶液，消化；离心收集沉淀的细胞，用培养液离心，洗涤，重新悬浮细胞团块；用接种培养基重新悬浮细胞，放入培养皿中，在培养箱中培养；更换生长培养基培养，长满传代，倒掉上清液，洗涤，加入胰蛋白酶消化，细胞完全脱落加入终止液终止消化。本申请最大限度地解决了现有技术中细胞活率低、分离数量少、可保存性差的缺陷和不足，以该方法培养获得的乳腺上皮细胞比传统实验室方法获得的细胞活力更高，数量更多、更易贴壁。

Description

一种乳腺上皮细胞分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一种乳腺上皮细胞分离培养方法。
背景技术
乳腺是重要的皮肤外分泌器官，具有多种生理、生化和免疫功能，能为婴儿或幼畜提供充足的营养并满足其发育的需求。乳腺上皮细胞来源于乳腺小叶中，它们与腺体导管和脂肪组织一起在乳腺中形成复杂的网络结构，乳腺上皮细胞在人出生、发育和妊娠均会受到荷尔蒙调控进行一系列的增长、迁移和分化。激素水平失调、细胞外基质的变化和其他基因因素都会导致乳腺上皮细胞恶性增长、最终导致乳腺癌的发生，培养和了解乳腺上皮细胞的特性可以帮我我们对乳腺病理机制的了解以及为治疗确定新的靶点。
体外培养的乳腺上皮细胞具有乳腺细胞的功能，可用于确定免疫标记物类型，这些细胞可被SV40病毒转化，是研究正常乳腺细胞与乳腺癌细胞的区别及癌基因引起细胞转化的重要材料。使用优化培养液可以培养乳腺上皮细胞传代，并形成克隆，将细胞培养在胶原凝胶上可形成三维立体结构，且与起源供体组织相似。胰岛素，氢化可的松，EGF等可促进上皮细胞生长。但目前对乳腺上皮细胞的体外培养尚不成熟。因此，探索一种能提高乳腺上皮细胞活性和增殖能力的体外培养方法，已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种乳腺上皮细胞分离培养方法，培养速度快，耗时短，操作简单，细胞活率高，细胞形态整齐、增殖旺盛，为科研领域提供一种全新的培养方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种乳腺上皮细胞分离培养方法，包括以下步骤：
步骤(1)、选取妊娠乳腺组织放入加有双抗的PBS缓冲液中反复洗涤，剔除脂肪组织；
步骤(2)将乳腺组织剪切成组织块；
步骤(3)将剪切的乳腺组织放入培养皿中，加入胶原酶溶液，消化，观察有大量的细胞爬出时终止消化；
步骤(4)、离心收集沉淀的细胞，用培养液离心，洗涤，重新悬浮细胞团块；
步骤(5)、细胞计数；
步骤(6)、用接种培养基重新悬浮细胞，放入培养皿中，在培养箱中培养。
步骤(7)、更换生长培养基培养，长满传代，倒掉上清液，洗涤，加入胰蛋白酶含0.05％EDTA消化，细胞完全脱落加入终止液终止消化，所述生长培养基为：DMEM/F12培养基，10％胎牛血清(FBS)，人重组表皮生长因子，青霉素/链霉素溶液；所述步骤(1)-步骤(7)按照顺序依次进行。
优选的是，步骤(2)中取乳腺组织5g，用手术剪剪切乳腺组织剪成1mm2大小的组织块。
上述任一方案中优选的是，步骤(3)中胶原酶溶液为3-6ml/g，35-38℃200r/min消化0.8-1.2h，显微镜下观察有大量的细胞爬出时终止消化。
上述任一方案中优选的是，步骤(3)中胶原酶溶液为3ml/g，35℃200r/min消化1.2h。
上述任一方案中优选的是，步骤(3)中胶原酶溶液为5ml/g，37℃200r/min消化1h，显微镜下观察有大量的细胞爬出时终止消化。
上述任一方案中优选的是，步骤(3)中胶原酶溶液为6ml/g，38℃200r/min消化0.8。
上述任一方案中优选的是，步骤(4)中用F12培养液离心1000r，5min洗涤三次。
上述任一方案中优选的是，步骤(6)中，接种培养基为F12基础培养基，F12基础培养基中加入氢化可的松、胰岛素、青霉素、链霉素、人重组表皮生长因子中的至少一种。
氢化可的松，有促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的效应,能提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率。
胰岛素，可以促进细胞增殖，胰岛素是大多数合成培养基的必须成份，它可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成RNA、蛋白质和脂质。胰岛素还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用。
表皮生长因子广泛存在于人体各种组织中，可刺激多种细胞增殖。
上述任一方案中优选的是，所述氢化可的松1-3ug/ml，胰岛素8-12ug/ml、青霉素80-120ug/ml、链霉素80-120ug/ml、人重组表皮生长因子8-12ug/ml。
上述任一方案中优选的是，所述氢化可的松1ug/ml，胰岛素8ug/ml、青霉素80ug/ml、链霉素80ug/ml、人重组表皮生长因子8ug/ml。
上述任一方案中优选的是，所述氢化可的松2ug/ml，胰岛素10ug/ml、青霉素100ug/ml、链霉素100ug/ml、人重组表皮生长因子10.0ug/ml。
上述任一方案中优选的是，所述氢化可的松3ug/ml，胰岛素12ug/ml、青霉素120ug/ml、链霉素120ug/ml、人重组表皮生长因子12ug/ml。
上述任一方案中优选的是，步骤(6)中，接种密度为为2.5-5.0*105个/cm2，在37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
上述任一方案中优选的是，步骤(7)中每2天更换1次培养基，长满传代，倒掉上清液，用5-8ml PBS洗涤两次。
上述任一方案中优选的是，步骤(7)中加入0.5-1ml胰蛋白酶放入培养箱消化1min，细胞完全脱落加入6ml终止液终止消化，按1：3传代至3个培养皿中。
乳腺细胞团块可在12h内贴壁，接种48h后可从细胞团块中迁移伸展出来，大约4d可形成90％-95％细胞汇合的单层细胞，第5d可长满培养皿底部；免疫组化染色角蛋白阳性，肌动蛋白阳性，细胞表面抗原CD10阳性。
本申请的乳腺上皮细胞分离培养方法，缩短分离时间、减少污染以及对细胞的损伤，对提取细胞使用的酶、培养细胞的方法进行优化，最大限度地解决了现有技术中细胞活率低、分离数量少、可保存性差的缺陷和不足，以该方法培养获得的人乳腺上皮细胞比传统实验室方法获得的细胞活力更高，数量更多、更易贴壁，可传代性更强，分化率更高，且培养方法，方法简单，方便操作，省时省力。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
实施例1
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
实验用品；弯镊、弯钳、手术剪、外科手术刀；培养液及添加物:F12基础培养液、10％热灭活胎牛血清、氢化可得松、胰岛素、青霉素、链霉素、人重组表皮生长因子；培养板、培养瓶；胶原酶溶液：胶原酶A、2.6mg/mlHepes、1.2mg/mlNaHCO3、胰蛋白酶、9.8mg/mlHamsF10和10％的胎牛血清；胰蛋白酶/EDTA混合消化液、PBS、终止液(F12基础培养基中加入10％胎牛血清)。
本发明提供了一种人乳腺上皮细胞分离培养方法，包括如下步骤：
步骤(1)；选取妊娠乳腺组织，将***组织放入加有双抗的PBS缓冲液中反复洗涤多次，用手术剪刀和镊子剔除脂肪组织。
步骤(2)；取乳腺组织5g，用手术剪剪切乳腺组织剪成1mm2大小的组织块。
步骤(3)；将剪切的乳腺组织放入培养皿中，加入胶原酶溶液(5ml/g)，37℃200r/min消化1h，显微镜下观察有大量的细胞爬出时终止消化。
步骤(4)；离心收集沉淀的细胞，主要为腺泡样细胞。用F12培养液离心1000r/min，离心5min，洗涤三次，重新悬浮细胞团块；
步骤(5)；细胞计数；大约每克组织中可获取(5-15)*106个细胞。
步骤(6)；用接种培养基(F12基础培养基中加入氢化可的松2ug/ml，胰岛素10ug/ml、青霉素100U/ML、链霉素100ug/ml、人重组表皮生长因子10.0ug/ml；配置成的培养液)重新悬浮细胞，放入培养皿中，接种密度为3.0*105个/cm2，在37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
步骤(7)；更换培养基为生长培养基培养，每2天换液1次，长满传代，倒掉上清液，用5-8mlPBS洗涤两次，加入0.5-1ml胰蛋白酶含0.05％EDTA放入培养箱消化1min，细胞完全脱落加入6ml终止液终止消化，按1：3传代至3个培养皿中，所述生长培养基为：DMEM/F12培养基，10％胎牛血清(FBS)，人重组表皮生长因子，青霉素/链霉素溶液。
乳腺细胞团块可在12h内贴壁，接种48h后可从细胞团块中迁移伸展出来，大约4d可形成90％-95％细胞汇合的单层细胞，第5d可长满培养皿底部；免疫组化染色角蛋白阳性，肌动蛋白阳性，细胞表面抗原CD10阳性。
实施例2：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，F12基础培养基中加入氢化可的松1ug/ml，胰岛素8ug/ml、青霉素80ug/ml、链霉素80ug/ml、人重组表皮生长因子8ug/ml。
实施例3：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，F12基础培养基中加入氢化可的松3ug/ml，胰岛素12ug/ml、青霉素120ug/ml、链霉素120ug/ml、人重组表皮生长因子12ug/ml。
细胞活率检测
采用实验室常规传统台盼蓝法测定细胞活率。采用步骤(8)中的加入完全培养基终止消化后的细胞液，离心重悬后，吸取少量细胞悬液与台盼蓝以9：1进行混合，在3min内用细胞计数板分别计算染色与未染色细胞数。
细胞活率＝未染色细胞数/细胞总数×100％
实验结果，先后四次取平均值，根据公式得出实施例1-3的平均值为97.23％、95.56％、96.42％，细胞活率较高，其中实施例1的培养方法所获得的细胞活率最高。
实施例4：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(3)中胶原酶溶液为3ml/g，35℃200r/min消化1.2h。
实施例5：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(3)中胶原酶溶液为6ml/g，38℃200r/min消化0.8h。
实施例6：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，F12基础培养基中加入氢化可的松0.5ug/ml，胰岛素6ug/ml、青霉素60ug/ml、链霉素60ug/ml、人重组表皮生长因子6ug/ml。
实施例7：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，F12基础培养基中加入氢化可的松4ug/ml，胰岛素15ug/ml、青霉素150ug/ml、链霉素150ug/ml、人重组表皮生长因子15ug/ml。
实施例8：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，接种密度为2.5*105个/cm2。
实施例9：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，接种密度为4.0*105个/cm2。
实施例10：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，接种密度为5.0*105个/cm2。
实施例11：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(7)中，加入0.5ml胰蛋白酶放入培养箱消化2min。
实施例12：
一种乳腺上皮细胞分离培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，加入2ml胰蛋白酶放入培养箱消化1min。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、选取妊娠乳腺组织放入加有双抗的PBS缓冲液中反复洗涤，剔除脂肪组织；
步骤(2)将乳腺组织剪切成组织块；
步骤(3)将剪切的乳腺组织放入培养皿中，加入胶原酶溶液，消化，观察有大量的细胞爬出时终止消化；
步骤(4)、离心收集沉淀的细胞，用培养液离心，洗涤，重新悬浮细胞团块；
步骤(5)、细胞计数；
步骤(6)、用接种培养基重新悬浮细胞，放入培养皿中，在培养箱中培养。
步骤(7)、更换生长培养基培养，长满传代，倒掉上清液，洗涤，加入胰蛋白酶含0.05％EDTA消化，细胞完全脱落加入终止液终止消化，所述生长培养基为：DMEM/F12培养基，10％胎牛血清(FBS)，人重组表皮生长因子，青霉素/链霉素溶液；
所述步骤(1)-步骤(7)按照顺序依次进行。
2.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中取乳腺组织5g，用手术剪剪切乳腺组织剪成1mm2大小的组织块。
3.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中胶原酶溶液为3-6ml/g，35-38℃200r/min消化0.8-1.2h，显微镜下观察有大量的细胞爬出时终止消化。
4.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中胶原酶溶液为5ml/g，37℃200r/min消化1h，显微镜下观察有大量的细胞爬出时终止消化。
5.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中用F12培养液离心1000r，5min洗涤三次。
6.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(6)中，接种培养基为F12基础培养基，F12基础培养基中加入氢化可的松、胰岛素、青霉素、链霉素、人重组表皮生长因子中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，所述氢化可的松1-3ug/ml，胰岛素8-12ug/ml、青霉素80-120ug/ml、链霉素80-120ug/ml、人重组表皮生长因子8-12ug/ml。
8.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(6)中，接种密度为为2.5-5.0*105个/cm2，在37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
9.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(7)中每2天更换1次培养基，长满传代，倒掉上清液，用5-8mlPBS洗涤两次。
10.根据权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(7)中加入0.5-1ml胰蛋白酶放入培养箱消化1min，细胞完全脱落加入6ml终止液终止消化，按1：3传代至3个培养皿中。
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