CN112584830B - 包含结合到金属离子中的离子化合物的肿瘤治疗用药学组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤治疗用药学组合物，尤其涉及一种肿瘤治疗用药学组合物包含从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与钙离子结合的离子化合物，通过使互不相同的化合物同时被肿瘤细胞吸收(uptake)而同时作用于肿瘤细胞中具有不同机制的主要代谢酶，从而可以通过重复、复合地搅乱肿瘤细胞的代谢过程而与着眼于某种特定突变或肿瘤细胞生长信号的抗肿瘤剂相比实现更加优秀的治疗效果，而且不易于产生耐药性，还可以更加有效地对肿瘤细胞的增殖、浸润以及转移等作用进行抑制的肿瘤治疗用药学组合物。

Description

包含结合到金属离子中的离子化合物的肿瘤治疗用药学组 合物
技术领域
本发明涉及一种肿瘤治疗用药学组合物，尤其涉及一种肿瘤治疗用药学组合物包含从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与1种金属离子结合的离子化合物，通过使互不相同的化合物同时被肿瘤细胞吸收(uptake)而分别通过不同的机制作用于肿瘤细胞，从而可以通过重复、复合地搅乱肿瘤细胞的代谢过程而与着眼于某种特定突变或肿瘤细胞生长信号的现有的抗肿瘤剂相比实现更加优秀的治疗效果，而且不易于产生耐药性，还可以更加有效地对肿瘤细胞的增殖、浸润以及转移等作用进行抑制的肿瘤治疗用药学组合物。
背景技术
通常，对肿瘤进行治疗的方法包括外壳手术、放射线治疗以及化学疗法等3种方法。为了对肿瘤进行治疗，可以独立地使用各个方法或对两种以上的方法进行复合使用。很多初期阶段的肿瘤可以通过外科手术的方式进行治疗，但是当肿瘤比较严重或发生转移的情况下，很难仅通过外壳手术的方式进行治疗，而是需要结合使用其他的方法。放射线疗法通常适用于难以进行外壳手术的部位或对放射线的反应性尤为良好的肿瘤治疗，可以与药物治疗并行或在外壳手术前后使用。但是，放射线疗法会因为放射线的高能量所导致的副作用而导致局部部位的正常皮肤的损伤，而且在转移性肿瘤的情况下，肿瘤干细胞会对放射线呈现出耐性，从而具有可能在日后复发或发生转移的问题。为了对死亡率较高的肿瘤进行治疗，在初期以及中期肿瘤中应尽可能地优先采用手术治疗以及抗肿瘤剂疗法或放射线疗法。但是，目前的肿瘤治疗方法通常只能够对初期肿瘤进行治疗，或者具有复发可能性较高或在杀灭肿瘤细胞的同时还杀灭正常细胞等多种副作用。尤其是对于重症的肿瘤晚期患者，采用积极的治疗方法时可能会出现相对更加严重的副作用，因此通常会采用可以通过延缓肿瘤细胞的生长并减少副作用而提升其生活品质的治疗方法。
通常，化学疗法是指通过以经口或注射的方式进行给药而对肿瘤细胞的增殖所需要的脱氧核糖核酸(DNA)或相关酶(Enzyme)进行破坏或抑制的方法。因为化学疗法与放射线治疗或外科手术相比可以将药物传递至身体的任何部位且还可以对已经发生转移的肿瘤进行治疗，因此目前作为治疗转移性肿瘤的标准疗法使用。虽然化学疗法并不能根治已经发生转移的肿瘤，但是可以通过缓解症状而起到改善患者的生活品质(Quality oflife)并延长患者寿命的重要作用。但是，大部分化学疗法的问题在于不仅会对肿瘤细胞造成影响，还会对正常细胞尤其是在人体内的增殖旺盛的骨髓、毛囊、胃肠管道内皮细胞等造成影响，因此会因为在接受药物治疗的肿瘤患者的骨髓中生成的免疫管辖细胞即白血球以及血小板的减少等原因而导致如细菌感染、自然出血、脱发、恶心以及呕吐等副作用。此外，还会因为耐药性(Drug resistance)的出现而只有在最初呈现出效果，最终仍然会导致治疗的失败。作为通过利用遗传基因技术强化免疫力并借此对肿瘤进行治疗的个性化治疗方法即免疫抗肿瘤治疗方法，在肿瘤细胞已经大量生长的步骤中会因为肿瘤细胞活性度的增加而很难仅通过免疫功能去除肿瘤细胞，而且还具有对于免疫***受到大量破坏的患者、程序性死亡受体1(PD-1，存在于活性化的T细胞表面的蛋白质)没有大量表达的患者不太有效的缺点，而且因为无法实现批量生产而需要高昂的费用，更具有可能会在临床使用过程中发生患者死亡等非预期的情况的问题。
最近，出现了大量的可以减少现有抗肿瘤剂的副作用且可以在对正常细胞进行保护的同时仅选择性地对肿瘤细胞进行杀灭的靶向抗肿瘤剂，但是因为只会对肿瘤细胞生成过程中的特定因子进行攻击，因此即使是在同类型的肿瘤中也仅对呈现出特定靶向因子的患者有效。长久以来，为了对肿瘤进行治疗而开发出了很多以肿瘤细胞的特征即持续性的细胞增殖以及转移抑制调节为基础的抗肿瘤剂，但是目前仍然很难开发出可以有效地对通过复杂信号传递途径网络调节的肿瘤细胞的增殖进行抑制的抗肿瘤剂。
因此，急需开发出一种可以轻易地适用于肿瘤疾病的治疗，而且还可以在尽可能地减少对正常组织的影响的同时有效地进行治疗的新型治疗方法。
为了满足如上所述的需求，最近利用肿瘤细胞的固有代谢特征的新型代谢抗肿瘤剂备受人们的瞩目。随着1970年代遗传工程学以及分子生物学技术的发展，发现了诱发肿瘤的基因突变以及染色体异常，因此对肿瘤研究的焦点集中在了肿瘤的遗传性原因，但是肿瘤的独特的代谢途径被人们认为不是肿瘤的原因而是在肿瘤的发展过程中产生的附带效果，因此长久以来并没有进行相关的研究。但是，后来人们发现与肿瘤的代谢信号相关的基因变异以及多种代谢体可以直接诱发肿瘤，而且生物技术的发展使得人们可以对代谢体进行分析，因此肿瘤细胞的代谢途径成为了用于对肿瘤进行治疗的重要的抗肿瘤研究目标。因为发表了肿瘤细胞使用全新的途径即通过有氧糖酵解作用(Aerobic glycolysis，沃伯格效应(Warburg effect))的糖代谢途径的观点并因此获得诺贝尔奖的德国的生物化学家奥托·沃伯格(Otto Warburg)，率先证明了肿瘤细胞使用的是与正常细胞不同的代谢途径这一事实。
正常细胞在有氧环境下是通过氧化磷酸化而将葡萄糖完全氧化成水以及二氧化碳并借此生成能量，但是与此不同，肿瘤细胞在缺氧环境(Hypoxia)下则是选择通过将葡萄糖氧化成丙酮酸(Pyruvate)之后再进一步还原成乳酸盐(Lactate)的途径。因此，伴随着肿瘤细胞与正常细胞相比其氧气消耗量较少且在肿瘤患者的腹水中有大量乳酸盐存在的事实得到证实，了解到了肿瘤细胞所使用的是一种通过消耗与正常细胞相比极大量的葡萄糖并过量生成乳酸盐的糖酵解过程生成腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的特殊的代谢途径。
在大多数情况下，肿瘤细胞，尤其是固体肿瘤细胞是将糖酵解作用作为用于生成能量源(腺嘌呤核苷三磷酸，ATP)的代谢途径使用，上述机制中包括线粒体缺陷和功能异常、对肿瘤缺氧微环境的适应性、致肿瘤信号途径以及代谢酶的异常表达。沃伯格(Warburg)效应可以说是肿瘤细胞适应缺氧(Hypoxia)微环境的结果，缺氧环境可以通过对缺氧诱导因子1(HIF1，在细胞缺氧时诱导的转录因子)的泛素化蛋白质降解过程(Proteosomal Degradation)进行抑制而使得缺氧诱导因子1(HIF1)趋于稳定化并诱导作为转录因子的活性化。此外，葡萄糖转运蛋白1(GLUT1，用于输送糖的蛋白质1型)的表达是被缺氧诱导因子1(HIF1)诱导，从而支持葡萄糖流入到肿瘤细胞的内部，而且单羧酸转运体4(MCT4)也是缺氧诱导因子1(HIF1)的直接表达因子，借助于用于将丙酮酸转换成乳酸盐的乳酸盐脱氢酶(Lactate Dehydrogenase A；LDHA)，使得乳酸盐从肿瘤细胞的内部排出到外部。此外，缺氧诱导因子1(HIF1)还可以起到通过诱导对将丙酮酸转换成乙酰辅酶(Acetyl-Co)的酶即丙酮酸脱氢酶(Pyruvate Dehydrogenase；PDH)进行阻碍的丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate Dehydrogenase Kinase)的表达而封闭氧化磷酸化过程的途径的作用。因此，缺氧诱导因子(HIF1)可以说是通过对与葡萄糖流入以及糖酵解过程相关的多种不同因子的直接表达进行调节而诱导沃伯格(Warburg)效应的非常重要的因子。
此外，肿瘤细胞为了防止自身发生酸中毒化而将糖酵解作用的最终结果物即乳酸盐快速地排出到外部，而所排出的乳酸盐会使得在细胞毒性T细胞(Cytotoxic T Cell)以及树突状细胞(Dendritic Cell)中生成并在呈现抗肿瘤效果的方面起到重要作用的细胞因子(Cytokine)灭活，而且通过对自然杀伤细胞(Natural Killer Cell)的活化受体即NKp46(自然杀伤细胞即NK细胞的识别受体)的表达进行抑制并促进免疫阻碍以及抑制物质的生成而对肿瘤细胞的细胞杀灭能力进行抑制。与此同时，肿瘤细胞周边血管内皮细胞(Endothelial Cell)可以通过使得所排出的乳酸盐流入而诱导白细胞介素-8(IL-8，起到对炎症细胞进行活化并将其诱导到炎症部位的化学诱导因子作用的蛋白质)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达并促进血管内皮细胞的移动，从而诱导血管新生(Angiogenesis)。如上所述的肿瘤细胞的代谢重编程是在进化过程中选择的代谢转化策略，旨在生成快速生长的肿瘤细胞的细胞构成物质合成所需要的如核苷酸、脂质以及氨基酸等的前驱体，而不是单纯地生成腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，可以理解为是持续快速生长的肿瘤细胞战略性地使用如上所述的代谢途径。如山所述，因为目前的诱导肿瘤形成以及生长的多种不同的致肿瘤因子的肿瘤表达过程与肿瘤细胞的代谢存在密切的关联，因此细胞代谢的重编程可以成为用于有效地对肿瘤进行治疗的重要的抗肿瘤标靶。目前，人们为了了解肿瘤细胞独有的特殊代谢信号并借此选择性地去除肿瘤，正在集中力量大力开发用于对肿瘤细胞的糖代谢进行调节的代谢靶向治疗剂，尤其是正在大量开展可以有效地使用目前适用于糖代谢以及感染性疾病治疗的多种不同药物的肿瘤治疗剂的开发。
先行技术文献
专利文献
1.大韩民国公开专利公报第10-2016-0082918号(2016.07.11.)
2.美国专利申请公开公报第US2011/0117210号(2011.05.19.)
3.大韩民国公开专利公报第10-2005-0058278号(2005.06.16.)
发明内容
本发明人为了了解肿瘤细胞独有的特殊代谢信号并以此为基础开发出可以选择性地去除肿瘤的肿瘤靶向治疗剂以及治疗方法，经过多角度的研究确认了在使用从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与从Ca、Zn、Mg、Fe选择的1种金属离子结合的离子化合物的情况下可以有效地对肿瘤细胞的增殖、浸润以及转移等进行抑制，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种包含从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与从Ca、Zn、Mg、Fe选择的1种金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用药学组合物。
为了达成如上所述的目的，本发明人为了开发出可以有效地对肿瘤细胞的增殖以及转移进行抑制的方法而着眼于肿瘤细胞独有的主要代谢途径。
第一个着眼的肿瘤细胞的代谢途径为糖酵解作用(Aerobic glycolysis)，即，相对于需要氧气的能量代谢过程即氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)，肿瘤细胞主要使用不需要氧气的糖酵解作用，从而即使是在正常细胞无法存活的如固体肿瘤等缺氧(Hypoxia)环境下也可以存活，而且从线粒体开始的细胞杀灭调节过程会被灭活。
第二个着眼的肿瘤细胞的代谢途径与通过糖酵解作用生成的大量的乳酸盐(Lactate)相关，即，肿瘤细胞为了防止自身发生酸中化毒而将乳酸盐快速地排出到肿瘤细胞的外部并借此对肿瘤细胞周边环境进行酸中毒化(Acidosis)，从而可以借助于酸中毒化对自然杀伤(NK)以及细胞毒性T淋巴(CTL)细胞的活性进行阻碍并借此诱导血管新生(Angiogenesis)、肿瘤细胞的转移以及免疫抑制。
第三个着眼点在于，钙作为肿瘤细胞的存活以及增殖所必须的要素，可以在细胞质的钙缓冲作用(Cytosolic calcium buffering)中起到主要的作用，而且对于与活性氧的生成相关的细胞凋亡(Apoptosis)以及自我吞噬(Autophagy)也会造成重大的影响。尤其是，目前已经得知钙在肿瘤细胞中会维持低浓度状态，当在肿瘤细胞中减少向线粒体的钙供应量时会因为能量的枯竭而对肿瘤细胞增殖进行抑制，而与此相反，在增加钙供应量时会因为线粒体过载而导致肿瘤细胞的凋亡。因此，着眼于肿瘤细胞相对于正常细胞对钙的反应更加敏感，从而在肿瘤细胞内的钙内稳态(Homeostasis)被破坏时不仅可以对肿瘤细胞的增殖进行抑制，甚至还可以对其进行杀灭。
本发明提供一种包含可以有效地作用于肿瘤细胞独有的主要代谢途径的离子化合物，即从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与从Ca、Zn、Mg、Fe选择的1种金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用药学组合物。
适用本发明的肿瘤治疗用药学组合物，可以作为包含从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与从Ca、Zn、Mg、Fe选择的1种金属离子结合的离子化合物作为有效成分的代谢抗肿瘤剂使用，从而可以有效地对肿瘤细胞的增殖进行抑制。
此外，适用本发明的肿瘤治疗用药学组合物，包含如肿瘤细胞的生长抑制化合物以及肿瘤细胞转移抑制化合物等具有不同机制的化合物，可以同时作用于主要代谢酶并重复、复合地搅乱肿瘤细胞的代谢过程，从而与着眼于阻断某一种特定的突变或代谢过程的现有的抗肿瘤剂不同，可以在细胞水准上同时发挥药效。
此外，适用本发明的肿瘤治疗用药学组合物属于离子化合物，可以在投入到体内时提升肿瘤细胞的吸收(uptake)。
此外，适用本发明的肿瘤治疗用药学组合物，可以通过将酸性(acid)化合物转换成中性的金属盐形态而提升肿瘤细胞的吸收(uptake)，而且不易于产生耐药性，还可以有效地对肿瘤细胞的增殖、浸润以及转移等作用进行抑制。
此外，可以提供一种利用适用本发明的肿瘤治疗用药学组合物的肿瘤治疗方法以及肿瘤转移抑制方法。
附图说明
图1a是对利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的钙浓度进行图示的图表。
图1b是对利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的钙进行图示的图像。
图2是对利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的乳酸盐浓度进行图示的图表。
图3是对从利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内排出的乳酸盐浓度进行图示的图表。
图4是对利用实施例1以及实施例2和比较例1以及比较例2的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的抗坏血酸浓度进行图示的图表。
图5是对利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的pH进行图示的图表。
图6是对利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的丙酮酸浓度进行图示的图表。
图7是对利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的α-酮戊二酸(α-KG)浓度进行图示的图表。
图8是对从利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞表达的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、β-连环蛋白(β-catenin)、血管内皮生长因子(VEGF)以及β-肌动蛋白(β-actin)的表达量进行图示的图表。
图9是对从利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞表达的活性氧的表达量进行图示的图表。
图10是对利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞的细胞凋亡进行图示的图表。
图11是对利用实施例1至实施例3的钙盐对大肠肿瘤细胞株进行处理时的细胞菌落形成性能进行确认的图像。
图12是对将实施例1至实施例3的钙盐以及现有的5-氟尿嘧啶(5-FU)抗肿瘤剂并用于大肠肿瘤细胞株时的细胞菌落形成性能进行确认的图表。
图13是对利用实施例1的钙盐以及5-氟尿嘧啶(5-FU)抗肿瘤剂对大肠肿瘤细胞株即HCT-116进行处理时的并用传递效果进行确认的图表。
图14是对利用实施例2的钙盐以及5-氟尿嘧啶(5-FU)抗肿瘤剂对大肠肿瘤细胞株即HCT-116进行处理时的并用传递效果进行确认的图表。
图15是对利用实施例1的钙盐以及7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)抗肿瘤剂对大肠肿瘤细胞株即HCT-116进行处理时的并用传递效果进行确认的图表。
图16是对利用实施例2的钙盐以及7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)抗肿瘤剂对大肠肿瘤细胞株即HCT-116进行处理时的并用传递效果进行确认的图表。
图17是对利用实施例1的钙盐以及紫杉醇(Paclitaxel)抗肿瘤剂对大肠肿瘤细胞株即HCT-116进行处理时的并用传递效果进行确认的图表。
图18是对利用实施例2的钙盐以及紫杉醇(Paclitaxel)抗肿瘤剂对大肠肿瘤细胞株即HCT-116进行处理时的并用传递效果进行确认的图表。
图19a是利用实施例1的钙盐在老鼠模型(DLD-1 orthotopic model)中给药1周并在切开之后进行观察的成像结果照片，图19b是利用实施例1的钙盐在老鼠模型(DLD-1orthotopic model)中给药1周并在切开之后对肿瘤组织的重量进行测定的图表。
图20是在向肺部移植人肺肿瘤细胞株(A549/LUC)的老鼠模型中利用实施例1至实施例3的钙盐进行给药之后通过荧光(luminescence)成像测定在不同的日期对肿瘤的生长饱和度进行拍摄的影像照片。
图21是对利用IVIS Spectrum(Xenogen)程序对上述图20的图像中的感兴趣区域(ROI，Region Of Interest)进行测定以及图示的图表。
图22是在向肺部移植人肺肿瘤细胞株(A549/LUC)的老鼠模型中利用实施例1至实施例3的钙盐进行给药之后对其存活率进行测定以及图示的图表。
具体实施方式
因此，本发明提供一种包含从抗坏血酸(Ascorbic acid)、二氯乙酸(Dichloroacetic acid)以及乳酸盐(Lactate)中选择的2种化合物与从Ca、Zn、Mg、Fe选择的1种金属离子结合的离子化合物作为有效成分的肿瘤治疗用药学组合物。
上述抗坏血酸(L-ascorbic acid)为维生素C，是诺贝尔奖获奖者莱纳斯·鲍林通过研究证实的无毒性的抗肿瘤剂。此外，抗坏血酸即使是在人体中过量(50g以上)给药时也不会呈现出特殊的毒性，而且因为具有与葡萄糖类似的结构而可以竞争性地抑制肿瘤细胞的葡萄糖过度吸收(glucose addition)。此外，高浓度(mega dose)的抗坏血酸可以通过破坏肿瘤细胞内的谷胱甘肽或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)并生成活性氧(ROS)而诱导肿瘤细胞的坏死。此外，抗坏血酸还可以通过诱导肿瘤细胞分化成正常细胞并阻断帮助胶原蛋白合成以及肿瘤转移的酶而对肿瘤细胞扩散到肿瘤周边组织的现象进行抑制。与此同时，可以通过进入到肿瘤细胞内部而在对细胞膜进行破坏的同时减轻肿瘤性疼痛，同时还可以通过对肿瘤患者的重要脏器进行解毒(Detox；Detoxification)而增强免疫力，并对肿瘤的血管新生进行抑制。此外，还可以提升其他抗肿瘤剂治疗或放射线治疗的效果并减少副作用，从而在肿瘤的预防以及治疗方面起到重要的作用。
此外，在上述抗坏血酸的浓度较低的情况下，虽然没有观察到肿瘤细胞的细胞凋亡，但是在肿瘤细胞的G1阶段中可以阻碍完全生长，而且可以在增加肿瘤抑制基因(p53)水平的同时抑制细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)活性，还可以减少p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的活化以及环氧化酶-2(COX-2)的表达。
而在上述抗坏血酸的浓度较高的情况下，可以通过减少线粒体膜的移位、减少血清转铁蛋白(Tf)转运受体的表达、减少铁的吸收以及增加肿瘤细胞内的活性氧(ROS)而诱导肿瘤细胞的细胞凋亡(Apoptosis)。
当上述抗坏血酸与适当的金属离子结合时，可以提高在体内的稳定性、增加在肿瘤细胞内部的吸收(uptake)，从而与现有的抗坏血酸相比进一步提升其抗肿瘤效果，而且还可以在相对较低的浓度下诱导肿瘤细胞的细胞凋亡。
通常，在肿瘤细胞进入缺氧状态的情况下，可以通过缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的活化而表达丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate DehydrogenaseKinase)，并借助于所表达的丙酮酸脱氢酶激酶对丙酮酸脱氢酶复合体(PyruvateDehydogenase Kinase)进行抑制。借此，可以通过防止丙酮酸转换成乙酰辅酶(Acetyl-CoA)而对丙酮酸进行蓄积并减少线粒体的能量合成。在如上所述的丙酮酸被过量蓄积的情况下，丙酮酸将被转换成乳酸盐(Lactate)并借此使得乳酸盐蓄积在肿瘤细胞的周边。换言之，在肿瘤细胞进入缺氧状态的情况下，可以以丙酮酸脱氢酶激酶的表达为开始发生乳酸盐的蓄积。
上述二氯乙酸并没有毒性，而且可以阻断如上所述的糖酵解作用(Aerobicglycolysis)的途径。此外，还可以通过阻碍丙酮酸脱氢酶激酶的表达而对乳酸盐的蓄积进行抑制。与此同时，通过重新恢复三羧酸循环(Tricarboxylic Acid Cycle)，可以借助于线粒体的换气过度而诱导葡萄糖代谢的重编程(即线粒体的代谢正常化)。
此外，上述二氯乙酸可以通过与适当的金属离子结合而提升现有的二氯乙酸的抗肿瘤效果并诱导线粒体的代谢正常化，从而通过诱导活性氧(ROS)而对肿瘤细胞进行杀灭。
此外，上述二氯乙酸可以通过与适当的金属离子结合而减少乳酸盐的蓄积并对肿瘤细胞的酸中毒化(Tumor acidosis)进行抑制。
上述乳酸盐可以包括乳酸(Lactic acid)、D-乳酸盐以及L-乳酸盐，还可以包括D-乳酸以及L-乳酸。
上述乳酸盐可以通过与适当的金属离子结合而在肿瘤细胞内蓄积过量的乳酸盐并借此对乳酸脱氢酶B(LDHB，L-lactate dehydrogenaseB；将乳酸盐或乳酸转换成丙酮酸的酶，同时也是将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转换成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态(NADH)的酶)进行活化或对乳酸脱氢酶A(LDHA，L-lactate dehydrogenaseA；乳酸脱氢酶B(LDHB)的逆反应酶)进行抑制，从而对单羧酸转运蛋白(MCT，Monocarboxylatetransporters)的表达进行抑制。
其中，“乳酸脱氢酶A(LDHA)的抑制”或“乳酸脱氢酶B(LDHB)的活化”是指将乳酸盐转换成丙酮酸。此外，“单羧酸转运蛋白(MCT)的表达抑制”是指通过对管辖乳酸盐的流入以及排出的单羧酸转运蛋白(MCT)的表达进行抑制，对自然杀伤细胞表面受体(NKp46)的表达进行活化并借此对肿瘤细胞的细胞杀灭能力进行活化。
此外，上述乳酸盐可以通过与适当的金属离子结合而进入到肿瘤细胞的内部并对其内部进行酸中毒化，从而诱导细胞杀灭。
上述金属离子可以是从Ca、Zn、Mg、Fe中选择的1种。较佳地，可以是Ca、Mg、Fe，更较佳地可以是Ca2+离子，但是并不限定于此。
此时，上述Ca2+离子(钙离子)会对肿瘤细胞的钙内稳态(Homeostasis)造成影响，可以通过诱导线粒体的钙蓄积而在肿瘤细胞内生成过量的活性氧，并借助于所生成的活性氧对肿瘤细胞进行杀灭。
具体来讲，对于在肿瘤细胞中负责能量生成的线粒体，钙是通过与α-酮戊二酸脱氢酶(alpha-ketoglutarate dehydrogenase)直接结合而在三羧酸(TCA)循环的正常运转中起到重要作用的因素，目前已知钙内稳态的丧失可以对肿瘤细胞的减少起到至关重要的作用。在肿瘤细胞内的钙浓度过度增加的情况下，核酸内切酶(endonuclease)以及大量的蛋白酶(protease)将被活化，从而在引起线粒体的代谢障碍的同时有利于细胞色素C(cytochrome C)，而且可以通过活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(caspase 9)而连锁性地活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3以及7。借此，可以达成细胞凋亡(Apoptosis)的效果。
在本说明书中，“离子化合物(Ionic compound)”是指具有相反电荷的离子借助于静电力通过离子结合而构成的化合物，上述化合物通常呈现出电中性。
适用本发明的药学组合物中所包含的离子化合物，较佳地可以是抗坏血酸以及二氯乙酸的钙盐(Calcium salts)、抗坏血酸以及乳酸盐的钙盐、二氯乙酸以及乳酸盐的钙盐、抗坏血酸以及二氯乙酸的镁盐、抗坏血酸以及乳酸盐的镁盐、二氯乙酸以及乳酸盐的镁盐、抗坏血酸以及二氯乙酸的镁盐、抗坏血酸以及乳酸盐的镁盐、二氯乙酸以及乳酸盐的镁盐、抗坏血酸以及二氯乙酸的铁盐(iron salts)、抗坏血酸以及乳酸盐的铁盐、二氯乙酸以及乳酸盐的铁盐中的某一个，更较佳地可以是抗坏血酸以及二氯乙酸的钙盐、抗坏血酸以及乳酸盐的钙盐、二氯乙酸以及乳酸盐的钙盐中的某一个，但是并不限定于此。
其中，“钙盐”是指以化合物与钙离子结合的形态生成或合成的离子化合物，上述“镁盐”是指以化合物与镁离子结合的形态生活合成的离子化合物，而上述“铁盐”是指以化合物与铁离子结合的形态生成或合成的离子化合物。
适用本发明的药学组合物可以在与放射线照射或抗肿瘤剂的并用治疗中使用。通常，因为可以减少在照射放射线时为肿瘤细胞赋予放射线耐性的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达，因此在与放射线照射并用给药的情况下，可以提升放射线的抗肿瘤活性，从而可以在与现有方式相比减少放射线的照射剂量的同时呈现出同等水准的抗肿瘤活性。此时，可以使用的放射线的照射剂量并不受到特殊的限定，可以是每天2至10Gy，上述放射线可以每天照射1次，也可以对上述线量进行分割而分为多天进行照射。
适用本发明的药学组合物，包含从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与从Ca、Zn、Mg、Fe选择的1种金属离子结合的离子化合物，可以在不抵消2种化合物原本所具有的各自的抗肿瘤效果的情况下同时被吸收(uptake)到肿瘤细胞内部并借此同时发挥其功效。如上所述的方式可以呈现出与现有的抗肿瘤剂复合给药(Comb i-therapy)方式相比更加优秀的效果。
此外，在将适用本发明的药学组合物与抗肿瘤剂并用给药时，可以呈现出与单独抗肿瘤剂给药方式的抗肿瘤效果相比更加优秀的抗肿瘤效果。
此时，可以与适用本发明的药学组合物并用给药的抗肿瘤剂，只要不直接作用于肿瘤细胞的整体代谢过程就不受到特殊限定，作为一实例，可以使用公知的抗肿瘤剂即伊马替尼(Imatinib)、5-氟尿嘧啶(5-FU，5-Florouracil)、伊立替康(Irinotecan)、舒尼替尼(Sunitinib)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、拉帕替尼(Lapatinib)、曲妥珠单抗(Trastuzumab，赫赛汀(Herceptin))、吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、卡铂(Carboplatin)、多西他赛(Docetaxel)、依维莫司(Everolimus)、索拉非尼(Sorafenib)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase)的抑制剂、单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporter)的抑制剂、派姆单抗(Pembrolizumab)、阿特朱单抗(Atezolizumab)、程序性死亡受体1(PD-1)系列抗肿瘤剂、纳武单抗(Nivolumab)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1，Poly(ADP-ribose)polymerase 1)的抑制剂、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-2(PARP-2，Poly(ADP-ribose)polymerase 2)的抑制剂、奥拉帕尼(Olaparib)、瑞卡帕布(Rucaparib)、尼拉帕利(Niraparib)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)以及血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂，还可以使用所有已知的可以呈现出抗肿瘤活性的其他抗肿瘤剂。
在本发明中，上述肿瘤是可以通过搅乱代谢过程而对增殖、浸润以及转移等进行抑制的肿瘤，作为一实例，可以是从由肺肿瘤、乳腺肿瘤、大肠肿瘤、胃肿瘤、脑肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、皮肤肿瘤、骨髓肿瘤、淋巴肿瘤、子宫肿瘤、***、肾肿瘤以及黑色素肿瘤构成的组中选择的肿瘤。
适用本发明的药学组合物，可以以追加包含在药学组合物的制造中普遍使用的适当的载体、赋形剂或稀释剂的肿瘤治疗用药学组合物的形态进行制造。具体来讲，上述药学组合物可以分别按照通常所使用的方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂以及口腔贴剂等经口剂型、外用剂、外用贴剂、栓剂以及灭菌注射溶液的形态进行制剂化之后使用。
在本发明中，作为可以包含于上述药学组合物中的载体、赋形剂以及稀释剂的实例，可以包括如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油等。在进行制剂化时，可以使用普遍使用的如填充剂、膨胀剂、结合剂、湿润剂、崩解剂以及表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行调制。作为用于进行经口给药的固态制剂，可以包括如片剂、长效剂(depot)、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、口腔贴剂等，而如上所述的固态制剂可以通过向上述提取物及其馏分添加如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)以及明胶等的方式进行调配。此外，除了单纯的赋形剂之外，还可以使用如硬脂酸镁以及滑石等润滑剂。作为用于进行经口给药的液态制剂，可以包括如混悬剂、口服液剂、乳剂以及糖浆剂等，除了通常所使用的单纯的稀释剂即水以及液体石蜡之外，还可以包括如湿润剂、甜味剂、芳香基以及保存剂等多种赋形剂。作为用于进行非经口给药的制剂，可以包括如灭菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻结干燥剂、外用贴剂以及栓剂等。作为非水溶剂以及悬浊剂，可以使用如丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇以及橄榄油等植物油或如油酸乙酯等可注射的酯等。作为栓剂的基质，可以使用如威泰索尓(Witepsol)、聚乙二醇(Macrogol)、吐温(Tween)61、可可脂、月桂酯以及甘油明胶等。
适用本发明的药学组合物中所包含的上述离子化合物的含量并不受到特殊的限定，但是可以以最终组合物的总重量为基准包含0.0001至50重量％，较佳地可以包含0.01至20重量％，上述药学组合物的单次给药量中所包含的金属离子的浓度可以是0.1至300mM。
上述适用本发明的药学组合物，可以以药剂学上有效的量进行给药，本发明中的术语“药剂学上有效的量”是指在可以适用于医学治疗或预防的合理的受益/风险比例范围内对疾病进行治疗或预防的足够的量，有效用量水准可以根据包括疾病的严重程度、药物的活性、患者年龄、体重、健康状态、性别、患者对药物的敏感度、所使用的适用本发明的组合物的给药时间、给药途径以及排出比例、治疗期间、所使用的适用本发明的组合物的组成或同时使用的药物在内的要素以及其他医学领域所公知的要素进行确定。适用本发明的药学组合物可以单独给药，也可以与公知的抗肿瘤剂或可以呈现出抗肿瘤活性的成分并用给药。在考虑上述所有要素的情况下，按照以没有副作用的最小限度的量达成最大治疗效果的量进行给药显得尤为重要。
适用本发明的药学组合物的给药量可以在考虑其使用目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别、以往病史或作为有效成分使用的物质类型等的前提下由相关从业人员确定。例如，适用本发明的药学组合物可以以成年人每人约1ng至约2,000mg/kg，较佳地以1mg至约400mg/kg的量进行给药，而适用本发明的组合物的给药频率并不受到特殊的限定，可以每天进行1次给药或通过对用量进行分割而进行多次给药。上述给药量以及给药次数在任何方面都不是为了对本发明的范围做出限定。
适用本发明的另一方面提供一种包括将上述药学组合物以药剂学上有效的量向患上肿瘤疾病的个体进行给药的步骤的肿瘤治疗方法。
本发明中的术语“个体”可以不受限定地包括患上肿瘤疾病的如老鼠、家畜以及人类等的哺乳动物、养殖鱼类等。
本发明中的术语“治疗”是指通过将作为有效成分包含适用本发明的离子化合物的药学组合物向患上肿瘤疾病的个体进行给药而改善或帮助改善肿瘤症状的所有行为。
在适用本发明的肿瘤治疗方法中，作为治疗对象的肿瘤类型如上所述。
上述组合物可以以药剂学上有效的量进行单独或多重给药。此时，组合物可以以液剂、散剂、气雾剂、注射剂、输液剂(静脉注射)、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂或贴剂的形态制剂化并进行给药。
作为适用本发明的肿瘤治疗用药学组合物的给药途径，可以通过能够到达目标组织的任意的一般途径进行给药。
适用本发明的药学组合物可以根据目的通过腹腔内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、经皮贴片给药、经口给药、鼻内给药、肺内给药以及直肠内给药等途径进行给药，但是并不限定于此。但是，在经口给药时也可以以未经过制剂化的形态进行给药，而且因为上述乳酸盐金属盐可能会因为胃酸发生改性或分解，因此经口用组合物也可以以涂布活性药剂或可以保护其不会在胃中发生分解的制剂化的形态或经口用贴片形态进行口腔内给药。此外，在注射给药时可以为了将其功效极大化而以缓释型注射形态(Long acting injection)进行给药。此外，上述组合物可以通过可以使活性物质移动到靶细胞的的任意装置进行给药。
此外，适用本发明的药学组合物可以以缓释型制剂形态进行制剂化，从而有效地在体内维持药物即离子化合物的浓度。例如，可以通过每天1次或每周1次的给药方式在维持药效的同时对体内的药物释放速度进行调节。此时，缓释型制剂还可以包括如上所述的载体、赋形剂以及稀释剂。
作为本发明的另一实施例，提供一种包含从抗坏血酸、二氯乙酸以及乳酸盐中选择的2种化合物与从Ca、Zn、Mg、Fe选择的1种金属离子结合的离子化合物的肿瘤转移抑制用药学组合物。
本发明所提供的离子化合物可以对肿瘤细胞的转移、浸润、血管新生、菌落形成能力等可以诱导肿瘤细胞转移的多种特性进行抑制，因此可以作为肿瘤转移抑制用药学组合物的有效成分使用。
此外，上述离子化合物以及金属离子与在上述内容中进行说明的内容相同。
此时，可以作为转移抑制对象的肿瘤与在上述内容中做出的定义相同，作为一实例，上述肿瘤转移抑制用药学组合物可以用于对从由转移性肺肿瘤、乳腺肿瘤、大肠肿瘤、胃肿瘤、脑肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、皮肤肿瘤、骨髓肿瘤、淋巴肿瘤以及黑色素肿瘤构成的组中选择的一种以上的转移肿瘤的发病进行抑制。
作为本发明的又一实施例，提供一种通过将上述药学组合物以药剂学上有效的量向可以预期到肿瘤转移的个体进行进行给药的步骤的肿瘤转移抑制方法。
本发明中的术语“转移(metastasis)”是指肿瘤或恶性肿块传播到与发病脏器相隔一定距离的其他组织中的状态。
在利用本发明所提供的离子化合物进行给药的情况下，可以对上述转移进行抑制。
在适用本发明的肿瘤转移医治方法中，作为转移抑制对象的肿瘤类型、给药的药物形态以及药物的给药途径等与在上述内容中进行的说明相同。
作为本发明的又一实施例，提供一种作为有效成分包含上述离子化合物的肿瘤相关疲劳预防或改善用药学组合物。
其中，肿瘤相关疲劳是指在肿瘤治疗过程中或完成治疗之后最常见的副作用之一，作为一实例，可以以肿瘤相关性疲劳综合征(Cancer-related fatigue；CRF)为例。其中，肿瘤相关性疲劳综合征是指对因为肿瘤及其治疗而带来的疲乏以及劳累的主观感受，非常痛苦且长期持续，是在与近期活动无关的状态下对日常生活功能造成妨碍的症状。
通常，肿瘤患者会因为抗坏血酸的不足而造成血脑屏障渗透力的增加，因此神经毒性物质或病毒可以轻易地侵入大脑并进一步诱发各种疲劳综合征，而且，在抗坏血酸不足时会因为如肾上腺素红或去甲肾上腺素等神经毒性物质的增加而导致脏器损伤。
因此，适用本发明的离子化合物是通过对包含抗坏血酸的2种以上的化合物与金属离子进行结合的方式制造，当将其适用于肿瘤患者时可以起到恢复免疫功能的作用，还可以减少肌肉疼痛并呈现出缓解因为压力而导致的疲劳感的效果，从而对肿瘤相关性疲劳综合征进行预防或改善。此外，如上所述的效果还可以提升肿瘤患者的存活率。
接下来，将对用于实施本发明的实施例进行详细的说明，但是下述实施例只是相当于用于实施本发明的较佳例示，本发明并不因为下述实施例而受到限定。
制造例1--1.二氯乙酸(Dichloroacetic acid)以及抗坏血酸(Ascorbic acid)的钙盐(Calcium salt)的制造
通过将129mg的二氯乙酸溶解到125ml的蒸馏水中而制造出二氯乙酸溶液，接下来通过将176mg的抗坏血酸溶解到125ml的蒸馏水中而制造出抗坏血酸溶液。在缓缓搅拌的同时将抗坏血酸溶液添加到二氯乙酸溶液中。接下来，缓缓添加105mg的碳酸钙(CaCO3)并在常温下进行30分钟的搅拌，接下来缓缓地将反应温度提升至60℃进行反应，直至不再生成CO2。在利用旋转式汽化器(Rotary evaporator)以及真空烘箱进行干燥并利用***(Diethyl ether)去除未反应的物质之后，通过执行过滤、干燥以及粉碎而获得了粉末状态的二氯乙酸以及抗坏血酸的钙盐。所有反应是在氮气环境下执行。
制造例1--2.抗坏血酸(Ascorbic acid)以及乳酸盐(Lactate)的钙盐(Calciumsalt)的制造
通过将90mg的乳酸(L-lactic acid)溶解到125ml的蒸馏水中而制造出乳酸溶液，接下来通过将176mg的抗坏血酸溶解到125ml的蒸馏水中而制造出抗坏血酸溶液。在缓缓搅拌的同时将抗坏血酸溶液添加到乳酸溶液中。接下来，缓缓添加105mg的碳酸钙(CaCO3)并在常温下进行30分钟的搅拌，接下来缓缓地将反应温度提升至60℃进行反应，直至不再生成CO2。在利用旋转式汽化器(Rotary evaporator)以及真空烘箱进行干燥并利用***(Diethyl ether)去除未反应的物质之后，通过执行过滤、干燥以及粉碎而获得了粉末状态的抗坏血酸以及乳酸盐的钙盐。所有反应是在氮气环境下执行。
制造例1--3.二氯乙酸(Dichloroacetic acid)以及乳酸盐(Lactate)的钙盐(Calcium salt)的制造
在进行搅拌的同时将640mg的二氯乙酸以及450mg的乳酸(L-lactic acid)溶解到10ml的蒸馏水中，接下来在缓缓添加500mg的碳酸钙(CaCO3)的同时在常温下进行30分钟的搅拌。在利用旋转式汽化器(Rotary evaporator)以及真空烘箱进行干燥并利用***(Diethyl ether)去除未反应的物质之后，通过执行过滤、干燥以及粉碎而获得了粉末状态的二氯乙酸以及乳酸盐的钙盐。
实施例1
按照上述制造例1-1制造出的二氯乙酸以及抗坏血酸与钙离子结合的钙盐。
实施例2
按照上述制造例1-2制造出的抗坏血酸以及乳酸盐与钙离子结合的钙盐。
实施例3
按照上述制造例1-3制造出的二氯乙酸以及乳酸盐与钙离子结合的钙盐。
试验例1.钙盐的肿瘤细胞吸收(uptake)效果以及肿瘤细胞pH变化
利用实施例1至实施例3的钙盐分别对肿瘤细胞进行处理，接下来对细胞内的钙的浓度变化、乳酸盐的浓度变化、抗坏血酸的浓度变化以及pH变化进行分析，从而分别对钙盐的流入水准进行了预测。
试验例1--1：钙水准的变化
分别利用1mM的实施例1至实施例3的钙盐，对在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116)进行处理，接下来进行24小时的培养。利用均质器(homogenizer)对上述所培养出的肿瘤细胞进行粉碎以及离心分离，接下来利用钙分析试剂盒(Biovision，SanFrancisco，CA)对上述粉碎物中所包含的钙的浓度进行了测定，其结果如图1a所示。此时，作为对照组使用了没有利用钙盐进行处理的肿瘤细胞。
此外，为了通过荧光成像观察钙水准的变化，将3×104细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116)接种到6孔板中进行24小时的培养，接下来分别利用1mM的实施例1至实施例3的钙盐进行处理并在培养4小时之后利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行2次洗涤，然后利用钙离子荧光探针(Fluo4-AM)进行40分钟的培养。为了对细胞内的钙浓度进行评估，使用FACSCantoTMⅡ flow cytometer(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，Nj，USA)、初级氩激光(primary argon laser)对细胞内的钙浓度荧光进行了测定，其结果如图1b所示。此时，作为对照组使用了没有利用钙盐进行处理的肿瘤细胞。
如上述图1a以及图1b所示，利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的钙浓度有所增加。借此可以确认，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以渗透到肿瘤细胞的内部。
试验例1--2：乳酸盐水准的变化
分别利用1mM的实施例1至实施例3的钙盐，对在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116以及HT-29)进行处理，接下来进行24小时的培养。利用均质器(homogenizer)对所培养出的细胞进行粉碎以及离心分离，接下来利用乳酸盐分析试剂盒(Biovision，SanFrancisco，CA)对上述粉碎物中所包含的乳酸盐的浓度进行了测定，其结果如图2所示。此时，作为对照组使用了没有进行任何处理的肿瘤细胞。
如上述图2所示，利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的乳酸盐浓度有所增加。借此可以确认，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以渗透到肿瘤细胞的内部并提升乳酸盐的浓度。
试验例1--3：肿瘤细胞排出的外部乳酸盐水准的变化
将在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×105细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116以及HT-29)接种到6孔板中进行24小时的培养，接下来利用分别利用0.05mM、0.1mM以及0.3mM浓度的实施例1至实施例3的钙盐进行处理，然后再进行20小时的培养。在完成培养之后替代成无酚红培养基(Phenol Red-free culture medium)，接下来利用分析试剂盒(Biovision，SanFrancisco，CA)对培养基(culture medium)中所包含的在4小时之内排出到细胞外部的乳酸盐进行了评估，其结果如图3所示。此时，作为对照组使用了没有进行任何处理的肿瘤细胞。
如上述图3所示，可以确认从利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内排出的乳酸盐浓度大体上有所减少。借此可以确认，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以减少从肿瘤细胞排出到外部的乳酸盐的浓度。
试验例1--4：抗坏血酸水准的变化
分别利用1mM的实施例1以及实施例2的钙盐，对在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116以及HT-29)进行处理，接下来进行24小时的培养。利用均质器(homogenizer)对完成培养的细胞进行粉碎以及离心分离，接下来利用抗坏血酸分析试剂盒(Biovision，SanFrancisco，CA)对上述粉碎物中所包含的抗坏血酸的浓度进行了测定，其结果如图4所示。此时，作为对照组使用了没有进行任何处理的肿瘤细胞，作为比较例1使用了利用抗坏血酸(1mM)进行处理的肿瘤细胞，而作为比较例2使用了利用抗坏血酸钙(1mM)进行处理的肿瘤细胞。
如上述图4所示，利用实施例1以及实施例2进行处理的肿瘤细胞内的抗坏血酸的浓度有所增加，但是利用比较例1以及比较例2进行处理的肿瘤细胞与利用实施例1以及实施例2进行处理的肿瘤细胞相比，所增加的抗坏血酸浓度较低。借此可以确认，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以更加轻易地渗透到肿瘤细胞的内部。
试验例1--5：肿瘤细胞内的pH的变化
分别利用实施例1至实施例3的钙盐(1mM)，对在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116以及HT-29)进行处理，接下来进行24小时的培养。以所培养出的细胞的培养基作为对象，利用pH检测试剂盒(life technologies，CA)对pH进行了测定，其结果如图5所示。此时，作为对照组使用了没有进行任何处理的肿瘤细胞。
如上述图5所示，可以确认利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的细胞内的pH有所下降，从而呈现出了酸性。即，可以得知因为钙盐的流入，肿瘤细胞内的环境转化成了酸性状态。这表明在钙盐的影响下更加容易发生细胞凋亡(Apoptosis)。
试验例2：钙盐对肿瘤细胞内的代谢过程造成的影响
分别利用实施例1至实施例3的钙盐对肿瘤细胞进行处理，以便于对钙盐对肿瘤细胞内的代谢造成的影响进行确认。
试验例2--1：钙盐对抗坏血酸的水准造成的影响
分别利用实施例1(1mM)、实施例2(1mM)以及实施例3(1mM)的钙盐，对在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116以及HT-29)进行处理，接下来进行24小时的培养。利用均质器(homogenizer)对所培养出的细胞进行粉碎以及离心分离，接下来利用丙酮酸分析试剂盒(Biovision，SanFrancisco，CA)对上述粉碎物中所包含的丙酮短的浓度进行了测定，其结果如图6所示。此时，作为对照组使用了没有进行任何处理的肿瘤细胞。
如上述图6所示，利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的丙酮酸浓度有所增加。借此可以确认，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以渗透到肿瘤细胞的内部并提升丙酮酸的浓度。
试验例2--2：钙盐对α-酮戊二酸(α-ketoglutarate；α-KG)的水准造成的影响
分别利用实施例1(1mM)、实施例2(1mM)以及实施例3(1mM)的钙盐，对在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116以及HT-29)进行处理，接下来进行24小时的培养。利用均质器(homogenizer)对所培养出的细胞进行粉碎以及离心分离，接下来利用α-酮戊二酸分析试剂盒(Biovision，SanFrancisco，CA)对上述粉碎物中所包含的α-酮戊二酸的浓度进行了测定，其结果如图7所示。此时，作为对照组使用了没有进行任何处理的肿瘤细胞。
如上述图7所示，利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞内的α-酮戊二酸浓度有所增加。借此可以确认，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以渗透到肿瘤细胞的内部并通过诱导线粒体的氧化磷酸化过程而提升α-酮戊二酸的浓度。
试验例2--3：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶--1(PARP--1)、β--连环蛋白(β--catenin)、血管内皮生长因子(VEGF，Vascular endothelial growth factor)以及β--肌动蛋白(β--actin)的蛋白质表达水准的变化
分别利用多种不同浓度的实施例1、实施例2以及实施例3的钙盐，对在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件培养的5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116以及HT-29)进行处理，接下来进行24小时的培养。利用均质器(homogenizer)对所培养出的细胞进行粉碎以及离心分离，接下来利用蛋白质印迹法(Western Blot)对上述粉碎物中所包含的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)、β-连环蛋白(β-catenin)、血管内皮生长因子(VEGF，Vascularendothelial growth factor)以及β-肌动蛋白(β-actin)的蛋白质表达水准进行了测定，其结果如图8所示。
如上述图8所示，利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)的表达水准有所降低。通常，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)是通过在细胞出现细胞程序性死亡(programmed cell death)即细胞凋亡(apoptosis)时被活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)而发生***(cleavage)，因此会作为细胞凋亡标记使用。实施例1在0.18mg/ml、实施例2在0.34mg/ml、而实施例3在0.3mg/ml下全长聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(full length PAPR-1)的减少幅度最大，可以确认其可以浓度依赖性地诱导肿瘤细胞的杀灭。借此，可以确认包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以减少全长聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(full length PAPR-1)的表达并借此诱导肿瘤细胞的杀灭。
此外，可以确认利用上述实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞可以浓度依赖性地减少β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白质水准(level)。目前已知β-连环蛋白(β-catenin)是一种在如大肠肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤以及卵巢肿瘤等多种肿瘤中发生突变或过表达的转录因子(transcription factor)，可以对如原肿瘤基因(c-myc)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶7(MMP7)、凋亡抑制蛋白(survivin)等对细胞生长、肿瘤转移以及存活(survival)起到重要作用的蛋白质的表达进行调节。借此可以确认，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以通过减少β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白质而对肿瘤细胞的生长进行抑制。
此外，可以确认利用上述实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞可以浓度依赖性地减少血管内皮生长因子(VEGF)的表达。此外，血管内皮生长因子(VEGF)信号传导体系可以对下级的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导体系以及信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号传导体系进行调节，对细胞的生长、侵染(invasion)以及转移(metastasis)起到非常重要的作用。尤其是可以通过增加肿瘤细胞的转移所必须的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的基因表达(gene expression)而促进肿瘤细胞的转移。借此，可以确认包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以通过对诱导血管新生的因子的作用进行抑制而呈现出对肿瘤细胞的转移进行抑制的效果。
试验例2--4：活性氧表达水准的变化
为了对利用适用本发明的与金属离子结合的离子化合物进行给药的肿瘤细胞内的活性氧浓度变化进行测定，作为荧光探针(probe)使用了二氯荧光素二乙酸酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCF-DA；Sigma，USA)。二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)可以在细胞内有与过氧化氢(hydrogen peroxide)相关的过氧化物(peroxides)存在时被活性氧(ROS)氧化并转换成荧光色的二氯荧光素(DCF)并呈现出绿色的荧光。因此，活性氧(ROS)的测定是通过二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)进行了确认。首先，在肿瘤细胞培养基(包含10％的胎牛血清(FBS)以及1％的青霉素/链霉素的RPMI1640培养基)中以37℃以及5％CO2条件对5×106细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116)进行了24小时的培养。在完成培养之后利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行一次洗涤，接下来将的10μM的二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)在37℃下进行30分钟的培养。再次利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行洗涤，接下来分别利用不同浓度的实施例1、实施例2以及实施例3的钙盐进行6小时的处理并对细胞内的活性氧(ROS)荧光进行了测定，其结果如图9所示。
如上述图9所示，利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞与没有进行任何处理的对照组相比，暗示细胞杀灭诱导可能性的活性氧有所增加。
试验例2--5：细胞杀灭水准的变化
为了对利用适用本发明的与金属离子结合的离子化合物进行给药的肿瘤细胞内的活性氧的浓度变化进行测定，在将3×104细胞数量的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116)接种到6孔板中并进行24小时的培养之后，利用不同浓度的实施例1(1mM)、实施例2(1mM)以及实施例3(1mM)的钙盐进行24小时的处理并利用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)进行两次洗涤，接下来利用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)进行分离并通过膜联蛋白-v(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)协议进行染色，然后利用FACSCantoTMⅡ flowcytometer(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，Nj，USA)、初级氩激光(primary argon laser)对细胞杀灭进行测定以及分析，其结果如图10所示。
在正常存活的细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine，PS)位于细胞膜的内侧。但是，在进入细胞凋亡(apoptosis)阶段时磷酯酰丝氨酸(PS)裸露到细胞膜的外侧，而膜联蛋白v(annexin V)因为与磷酯酰丝氨酸(PS)具有高亲和力而发生结合并呈现出荧光。碘化丙啶(propidium iodide，PI)可以进入到细胞内部并对核进行染色，与正在发生初期阶段细胞凋亡(apoptosis)的细胞只会被膜联蛋白-V(annexin-V)而不会被碘化丙啶(PI)染色不同，正在发生后期阶段的细胞凋亡(apoptosis)的细胞或正在发肾功能坏死(necrosis)的细胞会因为细胞膜的完整性(integrity)被破坏而会同时被膜联蛋白-V(annexin-V)以及碘化丙啶(PI)染色，而存活细胞则会呈现出未被染色的形态。如上述图10所示，利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的肿瘤细胞与没有进行任何处理的对照组相比，暗示除了细胞杀灭诱导可能性。
试验例3：对肿瘤细胞株的增殖能力造成的影响评估
对利用实施例至实施例3的钙盐的处理与否对大肠肿瘤、乳腺肿瘤以及脑肿瘤细胞株的存活能力的抑制效果进行了确认。
试验例3--1：对肿瘤细胞株的增殖能力(MTT assay)造成的影响评估
在96孔板的各个孔中将大肠肿瘤细胞株(DLD-1)、乳腺肿瘤细胞株(MDA-MB-231)以及脑肿瘤细胞株(U87MG)分别以5×106细胞数量进行分株，接下来将实施例1至实施例3的钙盐以不同的浓度(20mg/ml、4mg/ml、0.8mg/ml、0.16mg/ml、0.032mg/ml、0.0064mg/ml、0.00128mg/ml、0.000256mg/ml)添加到各个孔中，而且为了进行比较，将抗坏血酸、二氯乙酸利用相同的方法进行稀释并添加到各个孔中。在37℃、5％CO2的培养箱(incubator)中进行72小时的培养，接下来在添加50μl的2mg/ml噻唑蓝(MTT)试剂之后在37℃的培养箱中放置4小时。利用离心分离机去除上清液，接下来通过向各个孔添加二甲基亚砜(DMSO)200μl而对噻唑蓝(MTT)染色沉淀物进行溶解，然后利用酶联免疫吸附测定(ELISA)设备对在540ml比场下的OD540值进行了测定。50％抑制浓度(IC50)被定义为存活率达到50％的药物浓度，将IC50值作为抗肿瘤效果的指标如下述表1所示。
【表1】
如上述表1所示，实施例1以及实施例2的钙盐对大肠肿瘤、乳腺肿瘤、脑肿瘤细胞株的IC50值与抗坏血酸以及二氯乙酸相比呈现出了较低的值，借此可以确认与抗坏血酸以及二氯乙酸相比具有更加优秀的肿瘤细胞杀灭效果。
实施例3的钙盐对大肠肿瘤、乳腺肿瘤、脑肿瘤细胞株的IC50值与二氯乙酸相比呈现出了较低的值，借此可以确认与二氯乙酸相比具有更加优秀的肿瘤细胞杀灭效果。
此外，实施例3的钙盐对大肠肿瘤细胞株的IC50值与抗坏血酸相比呈现出了较高的值，但是对乳腺肿瘤以及脑肿瘤细胞株的IC50值与抗坏血酸相比呈现出了较低的值，借此可以确认与抗坏血酸相比具有更加优秀的乳腺肿瘤以及脑肿瘤细胞杀灭效果。
试验例3--2：对肿瘤细胞株的增殖能力(MTT assay)造成的影响评估
对于包括2种大肠肿瘤细胞株的共计7种肿瘤细胞株(大肠肿瘤细胞株(HCT-116，HT-29)、肺肿瘤细胞株(A-549)、肝肿瘤细胞株(HepG2)、胰腺肿瘤细胞株(PANC-1)、胃肿瘤细胞株(SNU-638)以及卵巢肿瘤细胞株(A2780))，对实施例1以及实施例2的肿瘤细胞增殖抑制能力进行了评估。
将7种细胞株分别以5×103分株到96孔板的各个孔中并培养24小时，接下来对于实施例1以及实施例2利用不同的浓度(5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mM)进行了处理。而且为了进行比较，对于抗坏血酸以及二氯乙酸利用相同的方法进行了处理。将经过药物处理之后的状态的细胞株在37℃、5％CO2培养箱(incubator)中进行48小时的培养，接下来将10μl的5mg/ml浓度的噻唑蓝(MTT)试剂分别添加到各个孔中。在进行4小时的追加培养之后去除培养液，接下来通过在各个孔中利用100μl的二甲基亚砜(DMSO)进行处理而对噻唑蓝(MTT)染色沉淀物进行溶解，然后利用微量盘式分析仪(microplate reader)对540nm波长下的吸光度进行了测定。50％抑制浓度(IC50)被定义为存活率达到50％的药物浓度，将IC50值作为抗肿瘤效果的指标如下述表2所示。
【表2】
如上述表2所示，实施例1以及实施例2的钙盐除了大肠肿瘤之外对于肺肿瘤、肝肿瘤、胰腺肿瘤、胃肿瘤以及卵巢肿瘤中同样呈现出了抗肿瘤功效。此外，与二氯乙酸相比呈现出了较低的IC50值，借此可以确认与二氯乙酸相比具有更加优秀的肿瘤细胞杀灭效果。
虽然实施例1的钙盐对大肠肿瘤(HCT-116)、胰腺肿瘤以及卵巢肿瘤细胞株的IC50值与抗坏血酸相比呈现出了较高的值，但是对大肠肿瘤(HT-29)、肺肿瘤、肝肿瘤以及胃肿瘤细胞株的IC50值与抗坏血酸相比呈现出了较低的值，借此可以确认与抗坏血酸相比具有更加优秀的大肠肿瘤(HT-29)、肺肿瘤、肝肿瘤以及胃肿瘤细胞杀灭效果。
虽然实施例2的钙盐对大肠肿瘤(HCT-116)以及胰腺肿瘤细胞株的I C50值与抗坏血酸相比呈现出了较高的值，但是对大肠肿瘤(HT-29)、肺肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤以及卵巢肿瘤细胞株的IC50值与抗坏血酸相比呈现出了较低的值，借此可以确认与抗坏血酸相比具有更加优秀的大肠肿瘤(HT-29)、肺肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤以及卵巢肿瘤细胞杀灭效果。
试验例3--3：对肿瘤细胞株的菌落形成能力造成的影响评估
将人大肠肿瘤细胞株(HCT-116)分别接种到包含抗坏血酸(0mM、0.2mM、0.5mM)、实施例1以及实施例2的钙盐(0mM、0.2mM、0.5mM)、二氯乙酸(0mM、2mM、5mM)、实施例3的钙盐(0mM、2mM、5mM)的固态培养基中并进行72小时的培养，接下来在培养结束之后对细胞进行固定，然后利用苏木精进行染色并对形成菌落的肿瘤细胞进行了观察，其结果如图11所示。
如图11所示，在没有利用实施例1至实施例3的钙盐进行处理的所有大肠肿瘤细胞株中均形成了数百个的菌落，但是实施例1至实施例3的钙盐在处理浓度增加时其菌落数量有所减少，而且与利用抗坏血酸以及二氯乙酸处理的情况相比，实施例1至实施例3的钙盐对大肠肿瘤的菌落形成能力的抑制效果更加优秀。综上所述，实施例1至实施例3的钙盐呈现出了对大肠肿瘤的菌落形成能力的抑制效果。
因此，通过对上述试验例3的结果进行综合可以得知，包含适用本发明的与金属离子结合的离子化合物的肿瘤治疗用组合物可以降低大肠肿瘤、乳腺肿瘤以及脑肿瘤等的肿瘤细胞的存活率。
试验例4：公知的抗肿瘤剂与实施例1至实施例3的钙盐的并用处理
通过将公知的抗肿瘤剂与实施例1至实施例3的钙盐进行并用处理而验证了对不同肿瘤细胞株的治疗效果。
试验例4--1：5--氟尿嘧啶(5--FU，5--Florouracil)与实施例的并用处理效果
将大肠肿瘤细胞株(HCT-116)在盛放有RPMI1640培养基的6孔板中分别接种1×103个细胞，接下来在经过一天之后更换成新的培养基，然后利用实施例1的钙盐(0.2mM)、实施例2的钙盐(0.2mM)、实施例3的钙盐(2mM)以及5μM的5-氟尿嘧啶(5-FU)单独对各个孔进行处理，再利用5μM浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)以及实施例1的钙盐(0.2mM)、5μM浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)以及实施例2的钙盐(0.2mM)、5μM浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)以及实施例3的钙盐(2mM)进行并用处理，接下来对细胞的菌落形成能力进行比较，其结果如图12所示。作为对照组，使用了没有利用任何药物进行处理的人大肠肿瘤细胞株(HCT-116)。
如上述图12所示，可以确认在没有进行任何处理的大肠肿瘤细胞株中形成了百余个菌落，而且在利用5-氟尿嘧啶(5-FU)以及实施例1至实施例3的钙盐进行并用处理时，与单独利用5-氟尿嘧啶(5-FU)进行处理的情况相比，对大肠肿瘤的菌落形成能力的抑制效果更加优秀。
试验例4--2：对大肠肿瘤细胞的现有抗肿瘤剂与实施例的并用处理效果
在96孔板的各个孔中分别接种2×103个HCT-116细胞并进行24小时的培养滞后，利用多种不同浓度的实施例或化学抗肿瘤剂(5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-FU)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)以及紫杉醇(Paclitaxel，PTX))进行了单独处理。在利用各个抗肿瘤剂进行48小时的单独处理之后的IC50值如表3所示。
【表3】
N.T.(未测试)
在96孔板的各个孔中分别接种2×103个HCT-116细胞并进行24小时的培养滞后，利用多种不同浓度的实施例1或实施例2与化学抗肿瘤剂即5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-FU)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)以及紫杉醇(Paclitaxel，PTX)进行了并用处理。在暴露48小时之后，利用复合指数(combinational index，CI)对经过并用处理的抗肿瘤剂组合的细胞生长阻碍率(％)以及并用传递效果进行了评估。协同(synergistic)效应为复合指数(CI)≤0.85，附加(additive)效应为0.85＜复合指数(CI)≤1.15，拮抗(对抗，antagonistic)效应为复合指数(CI)＞1.15，呈现出了并用传递效果。可以确认在大部分浓度下，利用实施例1或实施例2与化学抗肿瘤剂即5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-FU)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)以及紫杉醇(Paclitaxel，PTX)进行并用处理时呈现出了协同(synergistic)效应。
试验例4--2--1：实施例1或实施例2与5--氟尿嘧啶(Fluorouracil，5--FU)的并用处理效果
在利用实施例1与5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-FU)或实施例2与5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-FU)对HCT-116细胞进行48小时的并用处理之后的细胞生长阻碍率(％)以及复合指数(CI)值分别如表4以及表5所示，对复合指数(CI)进行细分的协同、附加或拮抗效应分别如图13以及图14所示。
当利用实施例1或实施例2与浓度等于或小于实施例1或实施例2的IC50值的5-氟尿嘧啶(5-FU)进行并用处理时，呈现出了一部分拮抗效应，但是在利用大于实施例1或实施例2的IC50值的1,000μM以上浓度进行并用处理时，在多种的浓度条件下大部分都呈现出了协同效应。
【表4】
【表5】
试验例4--2--2：实施例1或实施例2与7--乙基--10--羟基喜树碱(SN--38)的并用处理效果
在利用实施例1与7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)或实施例2与7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)对HCT-116细胞进行48小时的并用处理之后的细胞生长阻碍率(％)以及复合指数(C I)值分别如表6以及表7所示，对复合指数(CI)进行细分的协同、附加或拮抗效应分别如图15以及图16所示。在利用大于实施例1的IC50值(311μM)的浓度与多种不同浓度的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)进行并用处理时呈现出了拮抗效应，但是在利用接近或低于实施例1的IC50值的浓度与多种不同浓度的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)进行并用处理时呈现出了协同效应。实施例2在大部分的浓度组合下呈现出了与7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)的协同效应，尤其是在低于实施例2的IC50值(430μM)的浓度与低于7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)的IC50值(0.25μM)的浓度组合下也观察到了协同效应。
【表6】
【表7】
试验例4--2--3：实施例1或实施例2与紫杉醇(Paclitaxel)的并用处理效果
在利用实施例1与紫杉醇(Paclitaxel)或实施例2与紫杉醇(Paclitaxel)对HCT-116细胞进行48小时的并用处理之后的细胞生长阻碍率(％)以及复合指数(CI)值分别如表8以及表9所示，对复合指数(CI)进行细分的协同、附加或拮抗效应分别如图17以及图18所示。在利用低于实施例1的IC50值(311μM)的浓度或低于实施例2的IC50值(430μM)的浓度与0.1μM(100nM)以下的紫杉醇(Paclitaxel)进行并用处理时，在大部分的浓度组合下均呈现出了协同效应。在利用低于实施例1以及实施例2的IC50值的浓度与低于紫杉醇(Paclitaxel)的IC50值(7.8nM)的浓度进行并用处理时，在大部分的浓度组合下均观察到了协同效应。
【表8】
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【表9】
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试验例5：通过动物模型对适用实施例的钙盐的抗肿瘤效果进行验证
试验例5--1：利用动物模型(orthotropic model)的肿瘤形成动物模型的构建
为了构建原位异种接种动物模型(orthotopic xenograft)以及一般动物模型(orthotopic xenograft)，在对A549/LUC细胞以及DLD-1细胞进行继代培养之后向老鼠的肺以及大肠分别注入了上述肿瘤细胞。
因为上述模型是向脏器直接注入了肿瘤细胞，因此仅通过老鼠外形的观察并不能对肿瘤生长进行确认。所以在注入A549/LUC细胞的动物模型中，以7天为间隔向腹腔注射D-荧光素(D-Luciferin)并通过利用IVIS Spectrum Imaging System(Xenogen)设备的荧光(luminescence)成像测定方式对肿瘤的生长饱和度进行了确认，而在注入DLD-1细胞的动物模型中，在7天之后通过牺牲(sacrifice)试验对象而对肿瘤的生长饱和度进行了确认。在注入A549/LUC细胞的动物模型中，当在大约4周之后观察到约107photons/s/cm2/sr左右的荧光强度时利用实施例1至实施例3的钙盐进行给药并适用于体内(in vivo)成像，而在注入DLD-1细胞的动物模型中，在大约7周之后与大肠肿瘤的表达末期对应的时期利用实施例1的钙盐进行给药并对其抗肿瘤效果进行了观察。
即，通过向大肠接种一般DLD-1细胞而构建了大肠肿瘤老鼠模型(DLD-1orthotopic model)，并通过向肺部进行原位异种接种而构建了肺肿瘤老鼠模型(A549/LUCorthotopic model)。接下来，按照如下述表10所示的方式向各个老鼠模型进行给药。
【表10】
试验例5--2：在注射钙盐的动物模型中的抗肿瘤效果以及肿瘤转移变化(1)
利用上述实施例1的钙盐向与在上述试验例5-1构建的相同的老鼠模型(DLD-1orthotopic model)进行给药并在1周之后切开观察肿瘤细胞的生长状态，其结果如图19a所示，此外，通过对肿瘤组织的重量进行测定而对发明物质在生体内的抗肿瘤功效进行了确认，其结果如图19b所示。
如上述19a以及图19b所示，在没有利用实施例1的钙盐进行处理的所有老鼠模型(DLD-1orthotopic model)呈现出了急剧的肿瘤细胞生长，而实施例1的钙盐在所有老鼠模型(DLD-1 orthotopic model)中均明显地抑制了肿瘤细胞的生长。
试验例5--3：在注射钙盐的动物模型中的抗肿瘤效果以及肿瘤转移变化(2)
利用上述实施例1至实施例3的钙盐分别向在上述试验例5-1中构建的相同的老鼠模型(A549/LUC orthotopic model)进行给药之后，对发明物质在生体内的组织分布、转移度以及抗肿瘤功效进行了确认，其影像照片如图20所示。此外，为了更加准确地对各个成像结果进行数值化，利用IVIS Spectrum(Xenogen)程序对体内(in vivo)图像中的感兴趣区域(ROI，Region Of Interest)进行了测定和确认，其结果如图21所示，图22对老鼠模型(A549/LUC orthotopic model)的存活率测定结果进行了图示。
如上述图20、图21以及图22所示，可以确认实施例1至实施例3的钙盐与对照组相比具有优秀的抗肿瘤功效、转移抑制能力以及优秀的存活率。尤其是，实施例1在药物给药期间甚至于停止药物给药之后也没有出现任何肿瘤组织的生长以及转移，借此可以推测肿瘤细胞内的线粒体已经正常化(reforming)。
即，通过如上所述的试验结果可以确认适用本发明的与金属离子结合的离子化合物可以提升在肿瘤细胞中的吸收(uptake)，而且可以通过降低肿瘤细胞内的pH而实现酸中毒化，同时可以确认与每个单种化合物(抗坏血酸或二氯乙酸)相比，将两种化合物与金属离子结合的离子化合物的肿瘤细胞杀灭效果更加优秀。
此外，可以确认上述离子化合物可以通过增加丙酮酸以及α-酮戊二酸而对肿瘤细胞的糖酵解作用进行抑制，同时可以确认通过β-连环蛋白(β-catenin)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达量的变化减少肿瘤细胞的增殖以及转移。与此同时，通过肿瘤细胞株的增殖能力试验，可以确认在与现有的抗肿瘤剂并用给药时可以呈现出更加优秀的抗肿瘤效果。

Claims (13)

1.一种肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
包含各自从抗坏血酸（Ascorbic acid）、二氯乙酸（Dichloroacetic acid）以及乳酸盐（Lactate）中选择的2种不同的化合物与Ca2+结合的离子化合物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物是在与放射线照射或抗肿瘤剂的并用治疗中使用。
3.根据权利要求2所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述放射线是以每天2至10Gy的照射剂量照射到肿瘤患者，并与上述药学组合物并用处理。
4.根据权利要求2所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述抗肿瘤剂是从由伊马替尼（Imatinib）、5-氟尿嘧啶（5-FU，5-Florouracil）、伊立替康（Irinotecan）、舒尼替尼（Sunitinib）、奥沙利铂（Oxaliplatin）、紫杉醇（Paclitaxel）、拉帕替尼（Lapatinib）、曲妥珠单抗（Trastuzumab，赫赛汀（Herceptin））、吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）、甲氨蝶呤（Methotrexate）、卡铂（Carboplatin）、多西他赛（Docetaxel）、依维莫司（Everolimus）、索拉非尼（Sorafenib）、碳酸酐酶（carbonic anhydrase）的抑制剂、单羧酸转运蛋白（monocarboxylatetransporter）的抑制剂、派姆单抗（Pembrolizumab）、阿特朱单抗（Atezolizumab）、程序性死亡受体1（PD-1）系列抗肿瘤剂、纳武单抗（Nivolumab）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1，Poly(ADP-ribose) polymerase 1）的抑制剂、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-2（PARP-2，Poly(ADP-ribose) polymerase 2）的抑制剂、奥拉帕尼（Olaparib）、瑞卡帕布（Rucaparib）、尼拉帕利（Niraparib）、贝伐珠单抗（Bevacizumab）以及血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂构成的组中选择的任一种以上的抗肿瘤剂。
5.根据权利要求1所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述肿瘤是从由肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、大肠肿瘤、胃肿瘤、卵巢肿瘤、脑肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、皮肤肿瘤、骨髓肿瘤、淋巴肿瘤、子宫肿瘤、***、肾肿瘤以及黑色素肿瘤构成的组中选择的肿瘤。
6.根据权利要求1所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物还追加包含药剂学上容许的载体、赋形剂或稀释剂。
7.根据权利要求1所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物是以液剂、散剂、气雾剂、贴剂、胶囊剂、丸剂、片剂、长效剂（depot）或栓剂的形态制剂化。
8.根据权利要求1所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物是以注射剂的形态制剂化。
9.根据权利要求1所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物是以输液剂的形态制剂化。
10.根据权利要求1所述的肿瘤治疗用药学组合物，其特征在于：
上述药学组合物是以静脉注射的形态制剂化。
11.一种肿瘤转移抑制用药学组合物，其特征在于：
包含各自从抗坏血酸（Ascorbic acid）、二氯乙酸（Dichloroacetic acid）以及乳酸盐（Lactate）中选择的2种不同的化合物与Ca2+结合的离子化合物作为有效成分。
12.根据权利要求11所述的肿瘤转移抑制用药学组合物，其特征在于：
上述肿瘤是从由肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、大肠肿瘤、胃肿瘤、卵巢肿瘤、脑肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、皮肤肿瘤、骨髓肿瘤、淋巴肿瘤、子宫肿瘤、***、肾肿瘤以及黑色素肿瘤构成的组中选择的肿瘤。
13.一种肿瘤相关疲劳预防或改善用药学组合物，其特征在于：
包含各自从抗坏血酸（Ascorbic acid）、二氯乙酸（Dichloroacetic acid）以及乳酸盐（Lactate）中选择的2种不同的化合物与Ca2+结合的离子化合物作为有效成分。
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