CN112568445A

CN112568445A - 一种具有益生元作用的岩藻二糖及其制备方法和应用

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Publication number: CN112568445A
Application number: CN202011447316.7A
Authority: CN
Inventors: 牟海津; 付晓丹; 肖梦诗; 邢坤
Original assignee: Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd; Ocean University of China
Current assignee: Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd; Ocean University of China
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: LU500037B1; CN112568445B

Abstract

本发明公开了一种具有益生元作用的岩藻二糖及其制备方法和应用，属于寡糖制备技术领域。具体制备方法为：采用液体发酵肠杆菌F‑CE2制备胞外多糖，高温高压酸解胞外多糖得到降解糖液；将降解糖液通过超滤分级去除未降解的大分子糖片段，收集分子量≦500Da的寡糖组分，冻干后得岩藻二糖。经鉴定所得岩藻二糖结构为β‑D‑Glcp‑(1→4)‑β‑L‑Fucp和α‑D‑Galp‑(1→3)‑β‑L‑Fucp。本发明所述制备岩藻二糖技术操作简单、成本低廉、易扩大生产且二糖得率高。本发明所得岩藻二糖能够促进Akkermansia muciniphila及多株双歧杆菌增殖，作为新型益生元具有广阔的应用前景。

Description

一种具有益生元作用的岩藻二糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及寡糖制备技术领域，特别是涉及一种具有益生元作用的岩藻二糖及其制备方法和应用。

背景技术

母乳中存在多种寡糖(HMOs)，其中2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是含量最高的岩藻糖基寡糖，对新生儿具有修复神经、促进大脑发育、改善过敏症状、调节肠道菌群稳定等功能。随着体外合成2’-FL的实现，临床研究也表明在奶粉中添加2’-FL能够促进婴幼儿大脑发育且耐受性良好。由于2’-FL合成复杂，价格昂贵，许多婴幼儿配方奶粉中都添加了与HMOs 功能相似的低聚半乳糖和低聚果糖，但是这些低聚糖与2’-FL结构不同，带来的健康益处也有差异。现阶段，寻找一种与2’-FL结构相似，功能相似且能大批量生产的岩藻寡糖有重要意义。

Akkermansia muciniphila是近年来从人粪便中分离培养的一株严格厌氧的肠道菌，与机体健康有着紧密的联系。Akkermansia muciniphila的相对丰度与炎性肠病、盲肠炎、肥胖、2型糖尿病和青少年自闭症等疾病呈负相关。1899年，双歧杆菌首次被法国Tisser博士从婴儿大便中分离得到，婴儿健康与双歧杆菌在体内的存在及数量密切相关。双歧杆菌在母乳喂养婴儿的肠道中的数量远多于奶粉喂养的婴儿，母乳寡糖在其中发挥重要作用。此外，Akkermansia muciniphila和双歧杆菌的代谢产物短链脂肪酸还可作为肠上皮细胞能量来源，促进肠上皮细胞增殖，从而改善肠组织。多项研究表明岩藻寡糖能够被Akkermansia muciniphila和双歧杆菌代谢利用，将岩藻寡糖作为益生元添加到食品或者饲料中，有利于调节人体或者动物肠道菌群。

目前已有的岩藻寡糖大部分是将褐藻或者海参来源的岩藻多糖硫酸酯进行酸解或者酶解制备得到，产量低、成本高，降解产物分子量较大不易被益生菌快速利用。细菌胞外多糖(EPS)制备具有受环境因素影响小、周期短、产量高等优点而具有广泛研究和开发价值。近年来，已有报道研究通过特定菌株发酵制备含有岩藻糖的胞外多糖，例如肠杆菌A47，地衣芽孢杆菌BioE-BL11，密执安棍状杆菌Cm542等。但是细菌胞外多糖的分子量高，粘度高，无法被益生菌有效降解利用，这都限制其在活性方面的应用。因此，采用合适的方法将大分子富含岩藻糖的胞外多糖降解成小分子的岩藻寡糖可以有效提高胞外多糖的利用价值，并为实现工业化生产新型岩藻寡糖提供新的技术手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有益生元作用的岩藻二糖及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种具有益生元作用的岩藻二糖，所述岩藻二糖结构为β-D-Glcp-(1→4)-β-L-Fucp和α-D-Galp-(1→3)-β-L-Fucp。

本发明提供一种制备具有益生元作用的岩藻二糖的方法，具体包括以下步骤：

(1)将肠杆菌(Enterobacter sp.)F-CE2进行发酵后提取胞外多糖；

(2)将步骤(1)得到的胞外多糖配制溶液并在高温高压的条件下酸解得到降解糖液；

(3)将步骤(2)得到的降解糖液先通过超滤去除未降解的大分子糖，再将所得滤液经冻干后得到岩藻二糖。

进一步地，步骤(1)所述肠杆菌(Enterobacter sp.)F-CE2，保藏编号为CGMCCNo.20359，于2020年7月14日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述的肠杆菌F-CE2其胞外多糖中岩藻糖摩尔占比为30％～45％。

进一步地，步骤(1)所述胞外多糖的具体制备方法包括：所述肠杆菌 F-CE2在活化三次后，将其接种到发酵培养基中振荡发酵后，再将所得发酵液6000r/min离心15min收集上清液并将所得上清液旋转蒸发浓缩，浓缩后加入三倍体积95％乙醇以沉淀胞外多糖，收集胞外多糖再将其溶于超纯水中，并于透析袋中透析48小时后进行真空干燥。

进一步地，所述发酵培养基的配方为：牛肉膏5～15g/L、酵母膏2～ 6g/L、蛋白胨10～20g/L、葡萄糖20～40g/L、NH₄Cl 0.3g/L、KCl 1g/L、 (NH₄)₂SO₄0.3 g/L、Na₂HPO₄10 g/L、KH₂PO₄3 g/L、K₂SO₄1 g/L、NaCl 1g/L、 MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、CaCl₂·6H₂O 0.02g/L、FeSO₄0.001 g/L，pH为7.0～ 7.2。

进一步地，所述发酵培养基的接种量为0.1％～1％(V/V)，发酵温度为27℃～38℃，振荡速度为120r/min～180r/min，发酵时间为24h～72h。

进一步地，步骤(2)所述高压高温具体条件为：压力为0.1～0.3Mpa，温度为130～150℃。

进一步地，步骤(2)所述胞外多糖溶液进行酸处理条件为：向胞外多糖溶液中添加盐酸，调节pH为2～4，处理时间为2～5h，胞外多糖溶液浓度为10～50mg/ml。

进一步地，步骤(3)所述经超滤得到的糖液分子量≦500Da。

本发明还提供一种岩藻二糖在促进益生菌增殖中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明所述的制备岩藻二糖技术操作简单、成本低廉、易扩大生产且岩藻二糖得率高。

本发明提供的岩藻二糖结构新颖，纯度高，产量高，能被肠道益生菌发酵利用，降低肠道环境pH值，促进Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌和双歧杆菌在内的多株双歧杆菌增殖，作为新型益生元具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1肠杆菌革兰氏染色镜检图；

图2为实施例3肠杆菌胞外多糖红外光谱图；

图3为实施例3肠杆菌胞外多糖分子量GPC图；

图4为实施例5岩藻寡糖单糖组成GPC图；

图5为实施例5岩藻寡糖质谱图；图5-A是正离子模式ESI-MS，图 5-B是正离子模式ESI-CID-MS/MS；

图6为实施例5岩藻二糖核磁共振一维¹H谱图；

图7为实施例5岩藻二糖核磁共振一维¹³C谱图；

图8为实施例5岩藻二糖核磁共振二维TOCSY谱图；

图9为实施例5岩藻二糖核磁共振二维HSQC谱图；

图10为实施例5岩藻二糖核磁共振二维HMBC谱图；

图11为实施例6岩藻二糖和2’-FL益生元对4株益生菌的促增殖效果及菌株产酸能力；图11-A是短双歧杆菌，图11-B是婴儿双歧杆菌，图11-C 是两歧双歧杆菌，图11-D是Akkermansia muciniphila；

图12为实施例6岩藻二糖和2’-FL益生元促进4株益生菌短链脂肪酸的产生；图12-A是短双歧杆菌，图12-B是婴儿双歧杆菌，图12-C是两歧双歧杆菌，图12-D是Akkermansiamuciniphila。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的实施例，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1肠杆菌的筛选与鉴定

从山东省青岛市市南区污水处理厂采集污水样品。取30mL污水样品， 4℃下8000r/min离心20min，将沉淀用适量PBS溶液重悬，利用涂布法在营养琼脂平板上涂布，37℃过夜培养。培养结束后，在平板上挑取20 个单菌落，编号1～20，分别用LB液体培养基富集20个单菌落，37℃培养24h。

按照提取细菌基因组试剂盒的方法提取20个菌的DNA，将DNA作为模板，用16SrDNA通用引物27F(如SEQ ID NO.1所示)：5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’和1492R(如SEQID NO.2所示)：5’-ATTACCGCGG CTGCTGGC-3’进行菌落PCR。PCR反应体系为：Taq酶8μL，无菌水10 μL，引物各0.5μL，模板1μL。PCR反应条件为：(1)95℃预变性，5min； (2)95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸2min，共32个循环； (3)72℃再延伸，1min。扩增结束后将PCR扩增产物送至生物公司测序，将测序结果进行Blast对比，结果显示，有1株菌为肠杆菌，测序结果如 SEQ ID NO.3所示，镜检结果也显示该菌是杆菌形状的革兰氏阴性菌如图 1所示，即从污水中成功分离得到肠杆菌。将此肠杆菌命名为肠杆菌F-CE2 并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.20359，保藏日期为2020年7月14日。

实施例2优化制备肠杆菌胞外多糖条件

将肠杆菌F-CE2用LB液体培养基活化三代后，接入液体发酵培养基中，接菌量为0.5％(V/V)，将培养基置于摇床中振荡培养，温度为32℃，转速为150r/min，培养48h；发酵结束后，将发酵液6000r/min离心15min，去除菌体沉淀收集上清液；将上清液在50℃旋转蒸发仪中旋蒸至原体积的 1/5，随后加入3倍体积的95％乙醇进行沉淀，静置4h；6000r/min离心 10min收集沉淀，将沉淀用超纯水复溶，用10kDa透析袋透析48h，真空冷冻干燥，计算胞外多糖产量。将胞外多糖用PMP柱前衍生化方法进行前处理后进行高效液相分析单糖组成并计算岩藻糖含量。结果显示，肠杆菌胞外多糖的产量为3～6.5g/L，胞外多糖中岩藻糖的摩尔占比为30％～45％ (见表2和4)。

高效液相分析具体操作方法：

准确称取样品5mg置于安瓿管中，向其中加入1mL浓度为2mol/L 的三氟乙酸(TFA)，封管后置于烘箱中在110℃的条件下恒温水解6h。将水解后的样品蒸发浓缩后加入甲醇复溶，反复几次除去TFA。按照等摩尔比例配制标准单糖样品，同寡糖样品水解后的产物进行PMP(1-苯基-3- 甲基-5-吡唑啉酮)衍生。衍生方法为：取100μL待测样品混合液与210μL 浓度为0.3mol/L的NaOH溶液混合，向其中加入200μL 0.5mol/L的PMP 甲醇溶液，混合均匀后置于70℃烘箱中反应60min；反应后置于室温下冷却10min，加入210μL 0.3mol/L的HCl中和多余的碱。向混合液中加入3mL的二氯甲烷，振摇后静置，待其分层后弃去下层，重复此萃取过程3次。将水相用0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。

液相仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；紫外检测器(245nm)

液相柱型号：AgilentZORBAX 300XDB-C18

液相条件：0.05mol/LKH₂PO₄磷酸盐缓冲液(pH 6.7)/CH₃CN(83:17, V:V)为流动相；柱温为35℃；流速为1mL/min；进样量为20μL。

液体发酵培养基如下表1所示：

表1

无机盐配方为：NH₄Cl 0.3g/L、KCl 1g/L、(NH₄)₂SO₄0.3 g/L、Na₂HPO₄ 10g/L、KH₂PO₄3 g/L、K₂SO₄1 g/L、NaCl 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、 CaCl₂·6H₂O 0.02g/L、FeSO₄0.001 g/L；调节培养基pH至7.0～7.2。

表2为实施例2不同发酵培养基肠杆菌胞外多糖产量和岩藻糖含量。

表2

优化肠杆菌发酵培养基培养条件参数如表3所示：

表3

表4为实施例2不同发酵培养条件肠杆菌胞外多糖产量和岩藻糖含量。

表4

实施例3胞外多糖基本性质测定

根据实施例2优化肠杆菌发酵培养基的条件，选取EPS产量和岩藻糖含量最高的培养条件，培养基配方最终定为：牛肉膏10g/L、酵母膏6g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖30g/L、NH₄Cl 0.3g/L、KCl 1g/L、(NH₄)₂SO₄0.3 g/L、 Na₂HPO₄10 g/L、KH₂PO₄3 g/L、K₂SO₄1 g/L、NaCl 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、CaCl₂·6H₂O 0.02g/L、FeSO₄0.001 g/L；调节培养基pH至7.0～7.2。在32℃条件下，150r/min培养48h。如表5所示，最优条件制备的胞外多糖单糖组成包含岩藻糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖和鼠李糖，其中岩藻糖摩尔占比约为45.02％。

表5为实施例3胞外多糖单糖组成摩尔占比。

表5

本实验采用KBr压片法对样品进行红外光谱测定。样品的处理方法如下：按照样品与KBr质量比为1:200的比例，称取约2-3mg样品与100-600 mg KBr，转移到玛瑙研钵中均匀研磨成粉末，将研磨好的粉末转移到制片模具中，放在10吨的压力下保持2min后撤去压力，取出供试片，目测制好的供试片应呈透明状。取出供试片装入样品架中进行红外光谱测定，使用仪器的型号为Nicolet Nexus 470型红外光谱仪。如图2所示，图2为肠杆菌胞外多糖红外光谱图；可知样品分别在3427.69、2926.56、1639.69、 1404.60cm^-1具有特征吸收峰，分别为多糖的O-H、C-H、C＝O、C-O伸缩振动产生的特征吸收峰的伸缩振动特征吸收峰；1067.13cm^-1和1026.77 cm^-1两处的吸收峰表明多糖中有吡喃型糖的存在；表明多糖中存在羧基结构，这同液相色谱结果中显示存在糖醛酸的结果一致。

利用高效液相色谱***、示差检测器和TSK gel G4000 PWXL色谱柱测定EPS的分子量。***温度设置为35℃；流动相由0.2mol/L NaNO₃和 0.01mol/L NaH₂PO₄组成；流速设为0.5mL/min，上样量为20μL。使用不同分子量的葡聚糖(80、150、270、410和670kDa)绘制标准曲线。结果如图3所示，图3为肠杆菌胞外多糖分子量GPC图胞外多糖在19.674min 出峰，根据标准曲线计算可知胞外多糖分子量为5.2×10⁶Da。

实施例4高温高压酸解制备岩藻寡糖

高压酸解条件见表6。将肠杆菌F-CE2胞外多糖用超纯水配置成1～ 5％的多糖溶液，向多糖溶液中添加盐酸，调节pH为2～4，温度为130～ 150℃，压力为0.1～0.3Mpa，处理2～5h，用2mol/L NaOH调节pH至 7.0。所得寡糖液5000r/min离心10min，沉淀烘干称重，收集上清液。使用截留分子量为500Da的透析袋对上清液进行截留，得到分子量小于500 Da的寡糖糖液，将糖液冻干成粉，称重。胞外多糖寡糖得率见表7，结果显示在高温高压的环境下对肠杆菌胞外多糖进行酸处理后，分子量小于 500Da的寡糖得率为50％～70％，最佳反应条件为：多糖浓度30mg/ml， pH为3，真空度为0.2Mpa，处理4～5h。

表6为实施例4高压酸解肠杆菌胞外多糖条件。

表6

表7为实施例4高压酸解肠杆菌胞外多糖寡糖的得率。

表7

实施例5岩藻寡糖结构分析

(1)岩藻寡糖单糖组成分析

按照实施例2高效液相分析单糖组成的方法检测岩藻寡糖的单糖组成，结果如图4所示，图4为岩藻寡糖单糖组成GPC图，可知岩藻寡糖是由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，且比例为1:1:2。

(2)岩藻寡糖质谱分析

利用装有Agilent 6460三重四极杆质谱仪的Agilent 1290Infinity II***，采用正负离子电喷雾电离质谱(ESI-MS)和电喷雾碰撞诱导离解串联质谱(ESI-CID-MS/MS)鉴定岩藻寡糖的分子量。流动相为乙腈/水(1:1, V/V)，流速为0.4mL/min，雾化器压力为40psi，毛细管电压为3500V，以氩为碰撞气体，碰撞能量为10-55eV。如图5所示，图5为寡糖样品质谱结果图；图5-A是正离子模式ESI-MS，图5-B是正离子模式ESI-CID -MS/MS；可知该岩藻寡糖是分子量为326Da的岩藻二糖，结合单糖组成的结果来看，岩藻二糖可能是由葡萄糖和岩藻糖组成的二糖，也可能是半乳糖和岩藻糖组成的二糖。

(3)岩藻寡糖核磁分析

将10mg岩藻二糖样品溶解于0.5mL D₂O中并冷冻干燥。随后将样品重新溶解在0.5mL的D₂O中，用丙酮作为内标物校准化学位移。所有一维(¹H，¹³C，DEPT 90°，135°)和二维(¹H-¹H COSY，¹H-¹H TOCSY，¹H-¹³C HSQC，¹H-¹³C HMBC)核磁共振图谱都使用安捷伦DD2-500光谱仪记录，频率为500MHz，温度为25℃。如图6～10所示，图6～10为岩藻二糖核磁共振结果图，图6是核磁共振一维¹H谱图，图7是核磁共振一维¹³C谱图，图8是核磁共振二维TOCSY谱图，图9是核磁共振二维HSQC谱图，图10是核磁共振二维HMBC谱图；表8为岩藻二糖每个单糖残基¹H和¹³C的化学位移。结果显示，岩藻二糖结构为β-D-Glcp-(1→4)-β-L-Fucp和α-D-Galp-(1→3)-β-L-Fucp。

表8为实施例5岩藻二糖每个单糖残基¹H和¹³C的化学位移。

表8

实施例6岩藻二糖益生效果

为了探究岩藻二糖对肠道菌群的益生作用，实验过程模拟肠道厌氧发酵环境，探究岩藻二糖对短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、及 Akkermansia muciniphila的增殖效果及底物利用效率。使用除氧的YCFA 发酵培养基，单菌接种量为0.5％，37℃发酵48h，分别取0、12、24、 36和48h发酵产物进行后续分析。结果如图11所示，图11为岩藻二糖和 2’-FL益生元对4株益生菌的促增殖效果及菌株产酸能力；图11-A是短双歧杆菌，图11-B是婴儿双歧杆菌，图11-C是两歧双歧杆菌，图11-D是 Akkermansia muciniphila；相比于2’-FL，岩藻二糖显著促进短双歧杆菌、 Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌(p<0.05)增殖，并且12h即可降低pH值(降低1～2)。发酵24h后，相比于2’-FL，岩藻二糖能够促进双歧杆菌产生更多的甲酸、乙酸和乳酸，岩藻二糖能够促进Akkermansiamuciniphila产生少量丁酸，而2’-FL不能促进Akkermansia muciniphila产丁酸；如图12所示，图12为岩藻二糖和2’-FL益生元促进 4株益生菌短链脂肪酸的产生结果；图12-A是短双歧杆菌，图12-B是婴儿双歧杆菌，图12-C是两歧双歧杆菌，图12-D是Akkermansiamuciniphila。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 南京益纤生物科技有限公司；中国海洋大学

<120> 一种具有益生元作用的岩藻二糖及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attaccgcgg ctgctggc 18

<210> 3

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcggggcgg cacggtacca tgcagtcgag cggtaacaca gggagcttgc tcctgggtga 60

cgagcggcgg acgggtgagt aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg ataactactg 120

gaaacggtag ctaataccgc ataacgtcgc aagaccaaag agggggacct tcgggcctct 180

tgccatcaga tgtgcccaga tgggattagc tagtaggtgg ggtaatggct cacctaggcg 240

acgatcccta gctggtctga gaggatgacc agccacactg gaactgagac acggtccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat 360

gccgcgtgta tgaagatccc cttcgggttg taaagtactt tcagcgggga ggaaggtgtt 420

gaggttaata acctcagcaa ttgacgttac ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc 480

cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc 540

acgcaggcgg tctgtcaagt cggatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcattc 600

gaaactggca ggctagagtc ttgtagaggg gggtagaatt ccaggtgtag cggtgttttg 660

cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc 720

aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780

atgtcgactt ggaggttgtg cccttgaggc gtggcttccg gagctaacgc gttaagtcga 840

ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa 900

gcggtggagc atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctac tcttgacatc 960

cagagaactt agcagagatg ctttggtgcc ttcgggaact ctgagacagg tgctgcatcc 1020

gtgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1080

cctttgttgc cagcggttcg gccgggaact caaaggagac tgccagtgat aaactggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaac agatcatggc ccttacgagt agggctacac acgtgctaca 1200

atggcgcata caaagagaag cgacctcgcg agagcaagcg gacctcataa agtgcgtcgt 1260

agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat 1320

cagaatgcta cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1380

gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac cttcgggagg gcgctaccac tttgtattag 1440

ttg 1443

Claims

1.一种具有益生元作用的岩藻二糖，其特征在于，所述岩藻二糖结构为β-D-Glcp-(1→4)-β-L-Fucp和α-D-Galp-(1→3)-β-L-Fucp。

2.一种权利要求1所述具有益生元作用的岩藻二糖的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)将肠杆菌F-CE2进行发酵后提取胞外多糖；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述肠杆菌F-CE2，保藏编号为CGMCC No.20359，于2020年7月14日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述的肠杆菌F-CE2其胞外多糖中岩藻糖摩尔占比为30％～45％。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述胞外多糖的具体制备方法包括：所述肠杆菌F-CE2在活化三次后，将其接种到发酵培养基中振荡发酵后，再将所得发酵液6000r/min离心15min收集上清液并将所得上清液旋转蒸发浓缩，浓缩后加入三倍体积95％乙醇以沉淀胞外多糖，收集胞外多糖再将其溶于超纯水中，并于透析袋中透析48小时后进行真空干燥。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：牛肉膏5～15g/L、酵母膏2～6g/L、蛋白胨10～20g/L、葡萄糖20～40g/L、NH₄Cl 0.3g/L、KCl 1g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.3g/L、Na₂HPO₄ 10g/L、KH₂PO₄ 3g/L、K₂SO₄ 1g/L、NaCl 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、CaCl₂·6H₂O 0.02g/L、FeSO₄ 0.001g/L，pH为7.0～7.2。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的菌种接种量为0.1％～1％(V/V)，发酵温度为27℃～38℃，振荡速度为120r/min～180r/min，发酵时间为24h～72h。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述高压高温具体条件为：压力为0.1～0.3Mpa，温度为130～150℃。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述胞外多糖溶液进行酸解的条件为：向胞外多糖溶液中添加盐酸，调节pH为2～4，处理时间为2～5h，胞外多糖溶液浓度为10～50mg/ml。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述经超滤得到的降解糖液分子量≦500Da。

10.一种权利要求1所述的岩藻二糖在促进益生菌增殖中的应用。