CN112553108B - 一株短芽孢杆菌及其在降解聚氨酯中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物处理技术领域，具体公开了一株短芽孢杆菌及其在降解聚氨酯中应用。所述的株短芽孢杆菌，其分类命名为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)，菌株名为P10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2020626，保藏日期为2020年10月23日。本发明所提供的降解菌株不仅能够降解PU模拟物Impranil DLN，而且表现出良好的聚氨酯真实塑料薄膜降解能力。这是很多已知的能够降解Impranil DLN菌株所不具备。另外，菌株P10所涉及到实验耗材价格低廉，实验技术绿色高效，将为聚氨酯生物降解生物技术工艺的发展带来更高的效益。
Description
技术领域
本发明属于生物处理技术领域，具体涉及一株短芽孢杆菌及其在降解聚氨酯中应用。
背景技术
塑料在我们的现代社会中大量使用，几十年来全球生产率不断提高。2015年，聚氨酯约为350万吨，是欧洲第五大需求最大的合成聚合物。聚氨酯全称为聚氨基甲酸酯，英文名为Polyurethane，可被缩写为PU。用于合成聚氨酯的常见前体是多异氰酸酯和多元醇以及诸如催化剂、交联剂和扩链剂等添加剂。尽管与多异氰酸酯形成氨基甲酸酯键，但多元醇还包含醚键或酯键，从而分别生成聚醚型或聚酯型聚氨酯。通过改变多元醇和异氰酸酯的类型和比例，可以产出各种性质PUs。因此，聚氨酯的用途是多方面的，主要作为绝缘材料应用于医药、汽车等工业领域。
由于PU在自然条件下难以降解，目前的化学降解和物理焚烧等回收处理方法存在缓慢、有限和破坏生态环境等问题，因此利用微生物降解聚氨酯废物作为一种绿色高效的决解方法成为当下热点。
而大部分PU产品具有高度疏水性，不利于微生物附着利用。Impranil DLN是一种商业的水性聚酯型聚氨酯分散体，呈乳白色液体状，可作为结构模拟物来筛选PU塑料的降解菌。虽然报道过了一些对DLN有降解能力的真菌和细菌，如Cladosporium sp.、Aspergillus sp.和Penicillium sp.，但能降解真实PU塑料的具体菌株种类较少，PU塑料降解微生物还处于挖掘阶段。因此，我们结合PU模拟物及真实聚氨酯塑料为底物，去研究Impranil DLN降解菌株对其的降解效果，并采用质量损失、酯酶活性、傅立叶变换红外光谱和扫描电子显微镜等检测法方法，为聚氨酯塑料降解菌的生物作用提供证据。本研究筛选得到的降解菌株将使聚氨酯生物降解的生物技术工艺的发展更有价值。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株短芽孢杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述短芽孢杆菌在降解聚氨酯中应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一株短芽孢杆菌，其分类命名为短芽孢杆菌 (Brevibacillus sp.)，菌株名为P10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2020626，保藏日期为2020年10月23日，其属于严格好氧的短芽孢杆属。
其中，所述的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)P10是从南通海绵制造厂附近的土壤中分离，并在含Impranil DLN(1％)的选择性MSM琼脂平板上筛选，纯化和培育出来，经形态学和分子生物学得到，确定该菌株为短芽孢杆菌属，与Brevibacillus formosus (NR_040979.1)同源性99.43％；所述的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)P10的主要形态学特征如图1所示：菌落平坦呈乳白色的椭圆形，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明。在含ImpranilDLN(1％)的选择性MSM琼脂平板上能形成透明的降解圈；所述的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)P10的16S rRNA序列如序列表SEQ ID No.1所示，将菌株 P10的16SrRNA序列同GenBank数据库中的16S rRNA序列进行相似性比较，并采用 BioEdit和MEGA软件进行***进化树的构建(图2)。
一种微生物菌液，其包括上述的短芽孢杆菌，或包括上述短芽孢杆菌发酵液等，也在本发明的保护范围之内。
制备上述微生物菌液的方法为将短芽孢杆菌摇瓶培养发酵，具体步骤为，从P10菌株纯化后的DLN平板上挑取单菌落，接种于5mL的LB培养基中，30～37℃下振荡培养，即得；优选地，培养温度为37℃，培养时间为12h。
上述短芽孢杆菌在降解水性聚氨酯(Impranil DLN)中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述微生物菌液在降解Impranil DLN中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述的应用为将微生物菌液接种于LB液体培养基中培养至OD600为0.5～0.6，加入水性聚氨酯，继续培养降解。
其中，所述的培养为30～37℃振荡培养；优选地，所述的培养为37℃、180rpm培养。
上述短芽孢杆菌在降解聚氨酯中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述微生物菌液在降解聚氨酯中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述的应用为将灭菌后的商业聚氨酯薄膜放置在MSM—琼脂糖平板上，将上述微生物菌液涂布于聚氨酯薄膜上，30～37℃培养，即能直接降解聚氨酯塑料薄膜。
其中，所述的微生物菌液的用量为10％(μL/m2)。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)由于化学降解和物理焚烧处理聚氨酯塑方式存在料能耗大，和影响生态坏境等问题，本发明所提供的降解菌株不仅能够降解PU模拟物Impranil DLN，而且表现出良好的聚氨酯真实塑料薄膜降解能力，且在聚氨酯塑料薄膜降解实验中，能使薄膜的质量损失在2周内高达9.09％。这是很多已知的能够降解Impranil DLN菌株所不具备，因此，本发明显示出该菌株在聚氨酯塑料污染和生物修复领域具有长远价值。
(2)菌株P10所涉及到实验耗材价格低廉，实验技术绿色高效，将为聚氨酯生物降解生物技术工艺的发展带来更高的效益。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/ 或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为菌株P10在含Impranil DLN(1％)的选择性MSM琼脂平板上菌落形态。
图2为菌株P10和相关种16S rRNA序列***发育树。
图3为菌株P10降解Impranil DLN中胞外上清酯酶活性变化。
图4为Impranil DLN经菌株P10降解5天后官能团变化：(a)无菌处理对照的FTIR光谱图；(b)加菌株P10降解Impranil DLN5天后的FTIR光谱图。
图5为8周内菌株P10降解PU薄膜的质量损失曲线。
图6为8周内菌株P10降解PU薄膜的电镜图。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1菌株P10的分离与鉴定
将1-2g取自南通海绵制造厂周边的土壤稀接入50mL含0.2％Impranil DLN的富集培养基中，于37℃、180r·min-1进行转接培养。将对Impranil DLN富集菌液按103-106倍稀释后，分别涂布于含Impranil DLN(1％)的选择性MSM琼脂平板上，37℃倒置培养4-5天。挑选有明显水解透明圈的菌落，另在空白的MSM琼脂平板上三区划线，单菌落即为能够利用Impranil DLN的降解菌株；其中，所述的富集培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L，Impranil DLN 0.2％(V/V)，加蒸馏水至 1000mL；所述的选择性MSM培养基的组成为：硫酸铵1.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，七水硫酸镁0.7g/L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂15.0-20.0g/L、121℃灭菌20min，Impranil DLN灭菌后混入，浓度为 1％(V/V)。
菌株P10在含Impranil DLN(1％)的选择性MSM琼脂平板上的菌落平坦呈乳白色，表面光滑，芽孢为椭圆形，在平板上有明显的水解圈(图1)。挑取平板上的单菌落，接种于5mL LB试管中，在37℃、180r·min-1摇床中培养12h。将培养后的菌液作为载体，利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和1492R： 5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`扩增P10菌株的16S rRNA序列，将所获得的扩增片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rRNA序列，构建了菌株P10和相关种16S rRNA 序列***发育树，菌株P10在分子水平被鉴定为短芽孢杆菌属(图2)，其16S rRNA 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。将所获菌株送至中国典型培养物保藏中心 CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020626P10。
实施例2：菌株P10对DLN的降解特性
根据菌株P10在Impranil DLN(1％)的选择性MSM琼脂平板上的水解圈，推测菌株P10在降解DLN的过程中存在酯酶活性。从P10菌株纯化后的DLN平板上挑取单菌落，接种于5mL的LB试管中，37℃下振荡培养12h，获得P10菌液。将P10菌液按 1％的体积比接种量转接于100mL LB液体培养基中，于37℃、180r·min-1条件下培养 1-3h，每隔1h取样测定OD600nm，当OD600nm在0.5～0.6左右，加入1％v/v DLN诱导菌株P10产酶，培养降解，30℃，180rpm振荡培养，每隔24h，检测菌株P10产生的酯酶活性。
酯酶活性测定：每24h对菌株P10降解DLN的发酵液取样，进行酯酶活性测试；其中，测试反应体系(2mL)为880μL 50mM磷酸盐缓冲液、200μL酶提取液、40μL 10 mM的p-NPB的异丙醇溶液，在37℃反应30min，于410nm波长处测量吸光值，并设置空白对照；酯酶活性定义：在37℃条件下，每毫升培养液中的酯酶催化对硝基苯酚丁酸酯 (p-NPB)，每分钟生成对硝基苯酚(p-NP)的量定义为一个酶活单位。经检测发现，不仅存在酯酶而且酯酶活性达在72h时高达1.08U/mL(图3)。
将无菌处理的对照发酵上清与菌株P10降解DLN第五天的发酵上清分别用冷冻干燥机冻干，冻干后的固体在2500～800cm-1范围进行FTIR光谱分析，如图4所示，与对照组(a)相比，测试样品(b)中1735cm-1代表酯羰基官能团，吸收峰消失表明酯键水解了。此外其他峰的无明显变化代表DLN中的关键化学键酰胺键比较稳定并未产生降解。而目前大多数文献关于PU的降解机制都是发生在多元醇部分酯键的断裂，与本发明结果一致。
可见菌株P10对DLN的降解过程中不仅伴随DLN官能团的变化，而且该菌株还产酯酶，具有一定的协同作用。
实施例3：DLN降解菌P10对真实聚氨酯塑料薄膜的降解
从P10菌株纯化后的DLN平板上挑取单菌落，接种于5mL的LB试管中，37℃下振荡培养12h，获得P10菌液。将灭菌后的商业聚氨酯薄膜放置在MSM—琼脂糖平板上，同时均匀涂布LB培养的P10菌液200μL，在37℃下培养8周，每2周取样观察菌株P10对薄膜的降解程度。宏观上，通过比较样品与对照处理前后的质量损失来辨别降解效果；微观上对薄膜表面喷金进行SEM分析。实验发现，与无菌处理对照相比， PU薄膜在第2周的质量损失就达到了9.09％，虽然4，6，8周质量损失的速率减缓，但在第8周质量损失稳定至15.1％(图5)。可见菌株P10能直接利用PU真实塑料薄膜，并达到显著的降解效果。同样地，电镜扫描显示的薄膜表面变化与每周的质量损失也相互对应。由图6可见，与无菌处理的薄膜的完整表面相比，2周时的薄膜表面与已经出现了明显的孔洞和裂纹；4周、6周和8周时孔洞和裂纹进一步加深，因此可确定降解菌株P10不仅对结构模拟物Impranil DLN有降解效果，也对真实固体PU具有一定的降解效果，将为PU的生物降解研究奠定坚实的理论基础，使聚氨酯生物降解和回收利用的生物技术的发展更有价值。
本发明提供了一株短芽孢杆菌及其在降解聚氨酯中应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株短芽孢杆菌及其在降解聚氨酯中应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1432
<212> DNA
<213> 短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)
<400> 1
atgctagcat gatatacgtg cagtcgagcg agtctcttcg gaggctaccg gcggacgggt 60
gagtaacacg taggcaacct gcctctcaga ctgggataac atagggaaac ttatgctaat 120
accggatagg tttttggatc gcatgatccg aaaagaaaag atggcttcgg ctatcactgg 180
gagatgggcc tgcggcgcat tagctagttg gtggggtaac ggcctaccaa ggcgacgatg 240
cgtagccgac ctgagagggt gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300
cgggaggcag cagtagggaa ttttccacaa tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg 360
tgaacgatga aggtcttcgg attgtaaagt tctgttgtta gggacgaata agtaccgttc 420
gaatagggcg gtaccttgac ggtacctgac gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgcgcgca 540
ggcggctatg taagtctggt gttaaagccc ggggctcaac cccggttcgc atcggaaact 600
gtgtagcttg agtgcagaag aggaaagcgg tattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga 660
gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcgg ctttctggtc tgtaactgac gctgaggcgc 720
gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt 780
gctaggtgtt gggggtttca ataccctcag tgccgcagct aacgcaataa gcactccgcc 840
tggggagtac gctcgcaaga gtgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 900
ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcccgct 960
gatcgctctg gagacagagc ttcccttcgg ggcagcggtg acaggtggtg catggttgtc 1020
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatcttta 1080
gttgccagca ttcagttggg cactctagag agactgccgt cgacaagacg gaggaaggcg 1140
gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggtt 1200
ggtacaacgg gatgctacct cgcgagagga cgccaatctc ttaaaaccaa tctcagttcg 1260
gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat 1320
gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gggagtttgc 1380
aacacccgaa gtcggtgagg taaccgcaag gagccagccg ccgcactgag gt 1432
Claims (3)
1.一株短芽孢杆菌或包括所述短芽孢杆菌的菌液在降解水性聚氨酯中的应用，其分类命名为短芽孢杆菌（Brevibacillussp.），菌株名为P10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2020626，保藏日期为2020年10月23日；
所述应用为将包括所述短芽孢杆菌的菌液接种于LB液体培养基中培养至OD600为0.5~0.6，加入水性聚氨酯，继续培养降解；所述的培养为30~37℃振荡培养。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，制备包括所述短芽孢杆菌的菌液的方法为将权利要求1所述的短芽孢杆菌接种于LB培养基中，30~37℃下振荡培养，即得。
3.一株短芽孢杆菌或包括所述短芽孢杆菌的菌液在降解聚氨酯中的应用，其分类命名为短芽孢杆菌（Brevibacillussp.），菌株名为P10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2020626，保藏日期为2020年10月23日；
所述应用为将包括所述短芽孢杆菌的菌液涂布于聚氨酯上，30~37℃培养，即能降解。
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