CN112544634B

CN112544634B - 高山红景天提取物及应用

Info

Publication number: CN112544634B
Application number: CN202011416910.XA
Authority: CN
Inventors: 赵成爱; 高新馨; 马贵龙; 袁守超; 张婷婷
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN112544634A

Abstract

本发明公开了高山红景天提取物，它是将高山红景天干燥根，加水浸泡，过滤，收集滤液和滤渣，滤渣加水煎煮，煎煮后过滤，收集滤液，将两次滤液混合，浓缩、冷冻干燥，得高山红景天水提取物。再经过大孔树脂动态吸附‑洗脱，先水洗脱，弃洗脱液，再用10%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸发去除溶剂，得精高山红景天提取物。当高山红景天水提物浓度为2mg/mL，对人参猝倒病菌抑菌率可达100%，当高山红景天水提物浓度为3mg/mL对人参立枯病菌抑菌率为50%。当精高山红景天提取物为0.5mg/mL，对人参立枯病菌抑菌率为47.47%，对人参猝倒病菌抑菌率达97.47%。

Description

高山红景天提取物及应用

技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及高山红景天提取物及应用。

背景技术

高山红景天（Rhodiolasachalinensis）又称库页红景天，是生长在海拔1700-2500米环境恶劣、气候多变的苔原带野生植物，生命力极强。高山红景天在抗缺氧、抗福射、抗疲劳、抗病毒等抗性试验中起到较为显著的功效。高山红景天主产于吉林省长白山区、黑龙江省尚志、海林、宁安等县，其中吉林省长白山区于上世纪80年代率先种植红景天，发展面积比较大，被誉为“红景天之乡”，目前东北三省山区已有大面积种植。高山红景天主要成份有红景天甙、酪醇，此外有淀粉、蛋白质、脂肪、鞣质、黄酮类化合物及微量挥发油，以及铁、锌、锡、钼、锰等微量元素。主治性机能衰退、糖尿病、低血压等症。

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科多年生宿根植物，产于中国东北、朝鲜、韩国、日本、俄罗斯东部，被誉为百草之王。目前，国内外已被认证的人参病害共计40多种，而在我国人参种植的过程中已经发现的病害约为 25 种。按照病害是否具备侵染性，主要可以分为侵染性病害和非侵染性病害 2 大类。侵染性病害包括菌核病、灰霉病、疫病、立枯病、黑斑病、猝倒病、锈腐病等；非侵染性病害包括根裂、红皮病等。按照人参生长的不同阶段，划分为苗期病害和生长期病害。苗期病害主要有猝倒病、立枯病2种；人参的长期病害主要有灰霉病、黑斑病、细菌性软腐病、根腐病、红皮病等。在人参生长发育的各阶段都有可能出现疫病、锈腐病、菌核病等。

参农对人参病害的防治多数会采用敌克松、代森锰锌、多菌灵、乙烯菌核利、速克灵、甲霜灵、甲霜灵锰锌、普力克等药剂进行防治，其防治主要以等化学药剂为主，在使用过程中会因喷药次数过多而导致耐药菌株的产生；化学农药作为人参病害的主要防治手段，在人参生产过程中占有较为重要的地位。同其他防治方式相比，农药防治操作相对简单，有防治规模较大、农药见效快等特点。然而目前，部分参农和参厂在进行病害防治的过程中，有农药使用不合理、使用药剂过于单一等问题，这也导致了人参种植产量降低，耐药性增强等现象。

人参病害的生物防治，主要是使用枯草芽孢杆菌和哈茨木霉菌，二者对播种人参和移栽人参的苗期立枯病、根腐病有较明显的防效。近年来，越来越多的科研工作者活跃在对生防菌剂的筛选工作上，许多具有抑菌活性的生防菌不断被发现，但要真正将其应用到田间生产上仍存在许多实际问题。生物菌剂的发酵生产、制剂加工、存储及应用所要求的条件十分严格且随菌群的不同变化较大，且活菌制剂对致病菌能否发挥有效的抑制作用及其作用程度受环境因素影响很大，一些在实验室抑菌效果显著的生防菌株在实际应用过程中表现出抑菌活性降低、定殖困难、菌种衰退等现象，因此，生防菌株暂不具备商品化的客观条件，这就要求科研人员在研制高效、稳定的活体生防菌剂的同时，还可考虑将生防菌产生的抗生素、抗菌蛋白等抗菌物质制成微生物源农药，使其能更好地服务于农业生产。

目前，随着无公害农产品生产规模的逐步扩大和化学农药使用产生的抗药性、农药残留等问题的日益严重，寻找和使用无毒，高效的新型植物源农药越来越受到人们的重视。关于植物源农药高山红景天提取物抑制人参病原菌尚未见报道。

发明内容

本发明是为了解决上述问题，而提供的一种纯天然高山红景天提取物。

高山红景天提取物，它是高山红景天根水提取物；

由下述方法制备的：

将高山红景天干燥根，加水浸泡，过滤，收集滤液和滤渣，滤渣加水煎煮，煎煮后过滤，收集滤液，将两次滤液混合，浓缩、冷冻干燥，得高山红景天提取物。

所述的浸泡时间为4~6天；

所述的煎煮时间为15~25min；

所述的高山红景天提取物经过大孔树脂动态吸附-洗脱，先水洗脱，弃洗脱液，再用10%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸发去除溶剂；

所述的大孔树脂为D101型大孔树脂；

所述的高山红景天提取物在抑制人参猝倒病菌和人参立枯病菌中的应用。

高山红景天可湿性粉剂，它包括以下质量百分比的组分：红景天水提物45%-48%、载体45%-48%、湿润剂2%-3%、分散剂3%-5%。

所述的红景天水提物它是由以下方法制备的：

将高山红景天干燥根，加水浸泡，过滤，收集滤液和滤渣，滤渣加水煎煮，煎煮后过滤，收集滤液，将两次滤液混合，浓缩、冷冻干燥，得红景天水提取物。

所述的载体为白炭黑（400目）。

所述的载体用量与红景天水提物比例为1:1。

所述的湿润剂为十二烷基苯磺酸钠。

所述的湿润剂质量百分比为2%。

所述的分散剂为聚萘甲醛磺酸钠盐。

所述的分散剂质量百分比为3%。

本发明提供了高山红景天提取物，它是将高山红景天干燥根，加水浸泡，过滤，收集滤液和滤渣，滤渣加水煎煮，煎煮后过滤，收集滤液，将两次滤液混合，浓缩、冷冻干燥，得高山红景天水提取物。再经过大孔树脂动态吸附-洗脱，先水洗脱，弃洗脱液，再用10%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸发去除溶剂，得精高山红景天提取物。当高山红景天水提物浓度为2mg/mL，对人参猝倒病菌抑菌率可达100%，当高山红景天水提物浓度为3mg/mL对人参立枯病菌抑菌率为50%。精高山红景天提取物为0.5mg/mL ，对人参立枯病菌抑菌率为47.47%，对人参猝倒病菌抑菌率达97.47%。

附图说明

图1不同浓度乙醇洗脱物对人参立枯病菌的抑菌作用；

图2不同浓度乙醇洗脱物对人参猝倒病菌的抑菌作用；

图3高山红景天水提物不同载体对人参立枯病菌的影响；

图4高山红景天水提物不同载体对人参猝倒病菌的影响。

具体实施方式

实施例1 试验材料

试验材料：高山红景天干燥根。产地：吉林省白山市，购买于白山市岚昕特产贸易有限公司。

供试标准品及试剂：红景天苷（标准品）、酪醇（标准品）、罗塞维（标准品）、山奈酚（标准品）。4个标准品均购买于宝鸡市辰光生物科技有限公司。

供试药剂：50%多菌灵可湿性粉剂（江苏蓝丰生物化工股份有限公司）、30%精甲·噁霉灵水剂（浙江禾本科技股份有限公司）、2.5%咯菌腈悬浮种衣剂（先正达南通作物保护有限公司）。

供试菌种：人参立枯病病菌（Rhizoctonia solani）、人参猝倒病菌（Pythium debaryanum）、人参根腐病菌（F. oxysporum）、人参黑斑病菌（Alternaria panax）、人参灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人参菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、人参锈腐病菌（Cylindrocarpon destructans)、人参疫病菌属（Phytophthora cactorum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum (Schl.) f.sp ）、黄瓜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）（由植物病理实验室提供）。

载体：高岭土、碳酸钙、白炭黑、膨润土、硅藻土、凹凸棒。

润湿剂：十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠和拉开粉BX(国产)。

分散剂：木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、聚萘甲醛磺酸钠盐和亚甲基二萘磺酸二钠。

供试培养基：PDA培养基配置方法，马铃薯200g，葡萄糖20g,琼脂18-20g，定容1L蒸馏水。

实施例2 高山红景天水提物的制备

称取20g高山红景天干燥根，置于适当容器中，加入用100倍量蒸馏水浸泡，浸泡5d。浸泡完毕后用无纺布过滤，分别收集滤液和滤渣。将滤渣置于不锈钢锅中，在锅中加入30倍量蒸馏水煎煮20min。煎煮完毕后使用无纺布过滤，收集高山红景天滤液。将蒸馏水浸泡滤液和煎煮滤液混合，使用旋转蒸发仪进行浓缩，当浓缩液体积至10mL左右时停止操作。冷冻干燥得到高山红景天水提物，密封保存于棕色试剂瓶，放置于4℃冰箱中待用。

实施例3 精高山红景天提取物制备

取一定体积的大孔树脂（D101）于大烧杯中，向烧杯中缓慢加入体积浓度95%的乙醇溶液，直至乙醇溶液液面超过大孔树脂颗粒，静止放置约12小时，蒸馏水冲洗至无味道后装柱，装至玻璃柱三分之二处，将高山红景天水提物配置成5mg/mL浓度进行上样，上样量为大孔树脂体积三分之一，上样完毕，静止12小时，依次使用蒸馏水、10%、20%.、30%…80%的乙醇，进行冲洗，收集不同洗脱组份，将洗脱液浓缩、干燥成粉依次编号a：水洗脱物,b：10%乙醇洗脱物,c：20%乙醇洗脱物, d：30%乙醇洗脱物...i：80%乙醇洗脱物。

实施例4 高山红景天水提物抑菌活性

1. 高山红景天水提物抑菌活性的测定

将实施例2中得到的水提物配成浓度为15mg/mL的溶液待用。采用用生长速率法测定高山红景天水提物对11种植物病原菌的抑制作用。本试验所采用十字交叉法测量菌落直径。结果如表1所示，当高山红景天水提物浓度为15mg/mL时，对10种植物病原菌均有不同程度的抑制效果，其中对人参猝倒病菌和人参立枯病菌的抑菌率可达到100%，对人参根腐病菌、人参菌核病菌及黄瓜枯萎病菌抑菌率可达到80%以上，对另外5种病菌抑菌率在55%以下，对黄瓜菌核病菌无抑菌作用。

将实施例2中得到的水提物配成浓度为2mg/mL、3mg/mL的溶液待用。采用用生长速率法测定高山红景天水提物对人参猝倒病霉抑制作用。结果如表2所示，当高山红景天水提物浓度为2mg/mL，对人参猝倒病菌抑菌率可达100%。

将实施例3中得到的水提物配成浓度为3mg/mL的溶液待用。采用用生长速率法测定高山红景天水提物对人参立枯病菌抑制作用。结果如表3所示，当高山红景天水提物浓度为3mg/mL对人参立枯病菌抑菌率为50%。

2. 高山红景天4种单体化合物标准品对人参2种病原菌的抑制作用

用生长速率法测定高山红景天4种单体化合物标准品对人参2种病原菌的抑制作用。4种单体化合物标准品在培养基平板中浓度为0.5mg/mL，待对照组菌落长满培养皿平板时，测量各试验组和对照组菌落直径并计算抑菌率。如表4所示，4种单体化合物标准品对人参立枯病菌、人参猝倒病菌均没有抑菌效果。

实施例5 精提物各组分抑菌试验及毒力测定

取实施例3中a:水洗脱物，b：10%乙醇洗脱物，c:20%乙醇洗脱物，...i:80%乙醇洗脱物，分别制作含各洗脱物浓度为1mg/mL的PDA培养基平板，采用生长速率法测定对人参立枯病菌、人参猝倒病菌的抑菌活性。抑菌作用测定其他操作步骤同实施例4，结果如图1、2所示，高山红景天水提物10%乙醇洗脱物，60%、70%乙醇洗脱物对人参立枯病菌均有抑菌作用。其中10%乙醇洗脱物抑菌作用最好，抑菌率达80%以上，其他6个洗脱物对人参立枯病菌无抑菌作用。高山红景天水提物分离得到的9个洗脱物对于人参猝倒病菌均有抑菌效果，其中10%乙醇洗脱物抑菌作用最好，抑菌率达100%。

分别制作含10%乙醇洗脱物浓度（2.5、2.0、1.5、1.0、0.5mg/mL）和（0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL）的PDA培养基平板。分别对人参立枯丝核菌和人参猝倒病菌进行毒力测定。从表5高山红景天10%乙醇洗脱物对人参立枯病菌EC50值为 0.6122mg / mL，人参猝倒病菌EC50为0.2013mg/mL。高山红景天10%乙醇洗脱物对人参猝倒病菌EC50值比人参立枯病菌EC50值小，说明高山红景天10%乙醇洗脱物抑菌活性对人参猝倒病菌比对人参立枯病菌效果更好。

实施例6 可湿粉剂的制备

1.载体筛选

精确称取各载体试样2g于小烧杯中，滴加亚麻仁油，用玻璃棒搅拌至试样开始聚成一团而不分散开时为止。注意不要使亚麻仁油过量，按亚麻仁油的耗用量计算饱和吸油量。重复3次，取平均值。参照GB/T5451—2001，测定载体的润湿时间，时间越短，其润湿性越好，润湿时间不能超过2min。载体悬浮率的测定参照GB/T14825—2006，悬浮率越高，分散性越好，悬浮率不能低于70%。采用生长速率法测定各载体加入高山红景天水提物对人参立枯病菌、人参猝倒病菌的抑菌效果，并比较各载体的吸油率、润湿时间、悬浮率、成本等方面因素选择最优载体。将载体与高山红景天水提物按1:1混合后烘干，研磨成粉末即为母粉。

由表6所示，载体白炭黑（40目）吸油量为6.60ml最高，其次为白炭黑（400目）吸油量为5.01ml，硅藻土吸油量为3.35ml，由于白炭黑（400目）的悬浮率61.10%大于白炭黑（40目）55.55%，硅藻土的悬浮率12.22%，并且白炭黑（400目）的润湿时间15.64s，比白炭黑（40目）32.56 s，硅藻土的49.66 s短，所以选择白炭黑作为载体。通过采用菌丝生长速率法，如表7（针对图3、4做的总结）所示，白炭黑（400目）抑制人参立枯病菌等效果较好。综上所述，选择白炭黑（400目）作为高山红景天可湿性粉剂研制的载体。

2.润湿剂筛选

将润湿剂混到母粉中，制成可湿性粉剂，参照GB/T 5451—2001，测定制剂的润湿时间，时间越短，其润湿性越好；制剂悬浮率的测定参照GB/T 14825—2006，悬浮率越高，分散性越好；生长速率法检测对人参立枯病原菌的抑菌效果，测量抑菌直径，根据结果筛选出最佳润湿。添加不同含量1%、2%、3%、4%、5%，选择最佳润湿剂添加量。

由表8可以看出，母粉中加入十二烷基苯磺酸钠润湿时间最短，拉开粉次之，润湿时间分别为18.59s、20.30s，对人参立枯病菌抑菌率分别为78.48%、45.82%，人参猝倒病菌抑菌率为93.29%、92.78%。因此选择十二烷基苯磺酸钠为润湿剂。由表9可以看出，十二烷基苯磺酸钠含量为2%时悬浮率可达到71.34%，润湿时间为19.97s，选择2%-3%为十二烷基苯磺酸钠最佳添加量。

3.分散剂筛选

将分散剂混到加入润湿剂的母粉中，制成可湿性粉剂，参GB/T5451—2001，测定制剂的润湿时间，时间越短，其润湿性越好；制剂悬浮率的测定参照GB/T 14825—2006，悬浮率越高，分散性越好；生长速率法检测对人参立枯病原菌的抑菌效果，测量抑菌直径，根据结果筛选出最佳分散剂。添加不同含量1%、2%、3%、4%、5%，选择最佳分散剂添加量。

由表10可以看出，加入4种分散剂后润湿时间相差不大，其中聚萘甲醛磺酸钠盐润湿时间最短，结合抑菌试验结果选择聚萘甲醛磺酸钠盐。如表11所示，聚萘甲醛磺酸钠盐含量为3%、4%、5%时，润湿时间差距不大，分别为27.88s、27.78s、27.16s。结合悬浮率、抑菌试验选择3%-5%作为最佳添加量。

高山红景天可湿性粉剂在浓度为1mg/mL时，对人参立枯病菌抑菌率为85.06%，在同等剂量下，30%精甲·噁霉灵水剂抑菌率为83.42%，35%甲霜灵种子处理干粉剂抑菌率为63.82%，50%多菌灵可湿性粉剂抑菌率为100%。高山红景天可湿性粉剂与30%精甲·噁霉灵水剂具有相当的抑菌效果，且抑菌率高于35%甲霜灵种子处理干粉剂的抑菌率。

高山红景天可湿性粉剂在浓度为0.05mg/mL时，对人参猝倒病菌抑菌率为92.41%，同等剂量下，30%精甲·噁霉灵水剂抑菌率为90.51%，2.5%咯菌腈悬浮种衣剂抑菌率为72.15%，50%多菌灵可湿性粉剂抑菌率为1.03%。高山红景天可湿性粉剂与30%精甲·噁霉灵水剂具有相当的抑菌效果，且抑菌率远高于50%多菌灵可湿性粉剂的抑菌率。

Claims

1.高山红景天提取物在抑制人参猝倒病菌和人参立枯病菌中的应用；

所述的高山红景天提取物，它为高山红景天根水提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的高山红景天提取物，是由下述方法制备：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的浸泡时间为4~6天。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的煎煮时间为15~25min。

5.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于：所述的高山红景天提取物经过大孔树脂动态吸附-洗脱，先水洗脱，弃洗脱液，再用10%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸发去除溶剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的大孔树脂为D101型大孔树脂。