CN112522296B - Wuschel基因及其编码蛋白在植物抗病毒中的应用 - Google Patents

Wuschel基因及其编码蛋白在植物抗病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了WUSCHEL(WUS)或其同源基因以及它们的编码蛋白在植物抗病毒中的应用。本发明还公开了一种培育抗病毒转基因植物的方法，该方法将WUS基因导入目的植物中，从而提高WUS蛋白质在目的植物中的表达。本发明的WUS基因及其编码蛋白可有效抑制病毒基因组RNA的累积，有效抑制病毒蛋白的累积，从而有效抑制病毒感染。

Description

WUSCHEL基因及其编码蛋白在植物抗病毒中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及WOX基因家族WUSCHEL(WUS)基因及其编码的蛋白在植物抗病毒中的应用。
背景技术
植物病毒病是危害植物的一类重要病害，被称为植物癌症，不仅对植物自身造成不可逆转的伤害，同时也对其依赖的生态***造成毁灭性打击。全球约有950种植物病毒，直接对农作物、蔬菜和园艺植物造成重大破坏，直接导致每年600亿美元的经济损失。其中在经济作物中最为严重的是水稻、小麦、玉米、甘薯、木薯和香蕉。迄今尚没有专门的农药或化学制剂能够有效的防治病毒，植物一旦染病将无药可治，必要时只能通过铲除的方法，以防止病毒扩散，因此植物病毒病害的成为影响农业发展的重要瓶颈。
植物主要采用RNA干扰的方式沉默病毒，但是植物病毒进化了病毒沉默抑制子蛋白，抑制了植物RNA沉默，造成病毒在植物中***性感染，严重抑制了植物的生长发育，导致产量和品质降低。一些利用植物RNAi的技术和植物抗性基因R基因，也被应用到植物抗病毒中，但是这些应用往往对病毒种类具有局限性。因此，采用新的方法，提高植物对病毒的广谱抗性，尤为重要。
WUS转录因子基因在维持干细胞群的数量上具有关键性调控作用，基因部分成员已从拟南芥、水稻、玉米中分离，并进行了功能性的检测。Laux等在1996年在拟南芥中成功分离得到两个隐性等位基因的突变体wus1和wus2，其表现为植物分生组织缺陷的表型。在接下来的研究中，他们的团队克隆得到WUS基因，这个基因编码了大约291个氨基酸，属于WOX基因家族。2003年，日本科学家将WUS基因的研究拓展到水稻中。2012年，竹荣梓等对玉米中WUS基因的属性进行了研究。但是对于WUS基因的抗病毒功能现有技术中还尚未有研究。
发明内容
本发明人研究发现WUS基因能够抑制植物病毒蛋白的复制，抑制病毒RNA的累积，从而提高植物抗病毒的能力。在此基础之上，本发明人完成了本发明。
植物病毒不能感染植物茎顶端分生组织的干细胞区域，因此筛选和鉴定干细胞免疫病毒的关键基因，对于揭示其免疫病毒的分子机制具有重要的意义。而本发明就是利用鉴定的关键基因WUS，提供了其在培育广谱抗病毒植物方面的应用。
因而，本发明首先提供了下述任一种在培育抗病毒植物中的应用：
(1)WUS基因或其同源基因；
(2)WUS基因所编码的蛋白质，即WUS蛋白质；
(3)含有WUS基因的重组载体，优选地所述重组载体具有启动子、增强子、报告基因或标记基因；
(4)含有WUS基因的重组微生物，或含有(3)所述重组载体的重组微生物。
在本发明的一个具体实施方案中，所述WUS基因或其同源基因来源于拟南芥、水稻或玉米，优选拟南芥。
在本发明的一个具体实施方案中，所述WUS蛋白质是氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的蛋白质，或者是将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的保守的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
在本发明的一个具体实施方案中，所述WUS基因是核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的DNA分子，或者是与SEQ ID No:2所示的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码WUS蛋白质的DNA分子。
在本发明的一个具体实施方案中，所述植物为双子叶或单子叶植物，例如拟南芥、烟草、大豆、水稻、马铃薯、玉米、小麦以及林木和园艺植物，优选为拟南芥或烟草。
在本发明的一个具体实施方案中，所述病毒为植物病毒，例如黄瓜花叶病毒CMV、花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV(tobacco mosaic virus)或水稻条纹病毒RSV(rice strip virus)，优选为黄瓜花叶病毒CMV。
其中，WUS基因部分成员已从拟南芥、水稻、玉米中分离，并进行了功能性的检测。WUS基因是一种广谱抗病毒基因，属于WOX基因家族，编码一类WOX基因家族蛋白，本发明中所述的WUS基因来源于拟南芥，为拟南芥WUS基因序列(AT2G17950)。但本发明中的WUS基因并不只限于拟南芥中WUS，还包括以下几种情况：
1)与拟南芥中WUS基因高度保守的其它植物中的WUS同源基因，例如来源于玉米或水稻的WUS同源基因，其属于WOX基因家族，所述同源基因在茎顶端分生组织中诱导和维持干细胞的平衡，与拟南芥中WUS基因具有相同的抗病毒功能；
2)通过本领域已知的方法例如定向进化和点突变的方法，对拟南芥WUS基因进行突变所得到的核苷酸序列，其具有与本发明所限定的核苷酸序列75％以上同一性的核苷酸，只要编码WUS蛋白质且具有抗病毒功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列，均在本发明的保护范围之内。
其中，本发明的WUS蛋白质来源于拟南芥，其可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。WUS蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变而获得。
本发明使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
通过常规的转化或转染技术，可以将WUS基因或其活性片段或包含WUS基因的重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植物细胞，并进一步得到过量表达WUS基因或其活性片段的转基因植物。
本领域技术人员应该理解，获得过表达或者诱导表达WUS基因的植株可以通过转基因技术实现，例如，通过农杆菌介导的转染、质粒转化、直接DNA转化、微注射等技术实现。
本发明利用转基因技术，将WUS或者WUS在其它植物中的同源基因，或其突变改造具有抗病毒活性的WUS基因序列，导入植物细胞，由此获得广谱抗病毒的转基因植物。
在本发明的一个实施方案中，所述应用包括WUS在所有植物，如水稻、拟南芥、小麦、玉米、马铃薯、棉花、油菜、高粱或大豆等，以及林木和园艺植物中抗病毒的应用。在本发明的一个实施方案中，在拟南芥植物中诱导表达WUS可以抑制黄瓜花叶病毒的感染。
本发明还提供了一种培育抗病毒转基因植物的方法，所述方法是将WUS基因或其同源基因导入目的植物中。
在本发明的一个具体实施方案中，所述WUS基因是核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的DNA分子，或者是与SEQ ID No:2所示的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码WUS蛋白质的DNA分子。
在本发明的一个具体实施方案中，所述植物为双子叶或单子叶植物，例如拟南芥、烟草、大豆、水稻、马铃薯、玉米或小麦，优选为拟南芥或烟草。
在本发明的一个具体实施方案中，所述病毒为植物病毒，例如黄瓜花叶病毒CMV、花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV或水稻条纹病毒RSV，优选黄瓜花叶病毒CMV。
在本发明的一个实施方案中，利用植物表达载体，将本发明的广谱抗病毒基因导入植物细胞。其中，所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用WUS构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、叶片损伤诱导表达启动子等，它们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。
在本发明的一个实施方案中，为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行改造，如添加一些报告基因，绿色荧光蛋白GFP、荧光素酶基因LUC，β-葡萄糖苷酸酶基因GUS等，具有抗性筛选的基因卡那霉素标记物KAN或是抗化学试剂标记基因(如除草剂Bar基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以病毒抗性筛选转化植株。
在本发明的一个实施方案中，携带有本发明WUS基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜、棉花等双子叶植物。
通过对转化WUS基因后所得到的转基因拟南芥，我们证明诱导表达WUS可以显著抑制病毒的感染。WUS基因在植物中高度保守，是干细胞中抗病毒的关键基因。且对病毒具有广谱抗性。本发明人为增强植物广谱抗病毒提供了基础，将在培育广谱抗病毒的植物(特别是水稻、玉米、小麦、油菜、大豆、棉花等农作物以及林木、果蔬和园艺植物)中发挥重要的作用。
本发明的技术效果：
WUS基因在植物中高度保守，其在干细胞中防御病毒具有广谱性。本发明的WUS基因及其编码蛋白可有效抑制病毒基因组RNA的累积，有效抑制病毒蛋白的累积，从而有效抑制病毒感染，可将病毒感染率降低至10％以内。
WUS通过抑制蛋白质合成的方式，抑制病毒蛋白的合成，从而抑制了病毒的复制。WUS抑制蛋白质具有广谱性，因此其防御病毒的种类也具有广谱性，突破了先前抗病毒植株只对一种或几种病毒抗性的局限性。
本发明阐明了WUS抑制病毒感染的机制。WUS通过抑制总蛋白合成，从而监控病毒蛋白质的合成，抑制其复制，因此该过程具有对病毒免疫的广谱性。
附图说明
图1示出了所用到的载体物理图谱。其中，(A)为pBSK-6MYC-3HA的物理图谱，(B)为Phj104(6MYC-WUS)的物理图谱，(C)为pHJ111入门载体的物理图谱，(4)为pHJ143(WUS-entry)的物理图谱，(E)为过量表达载体pHJ151(35S::6Myc-WUS)的物理图谱，(F)为入门载体PJLsmart的物理图谱，(G)为35S::GUS(pHJ156)的物理图谱，(H)为Gateway植物表达载体pFK209的物理图谱，(I)为35S::3a-GFP(pHJ293)的物理图谱，(J)为35S::2a-GFP(pHJ294)的物理图谱，(K)为35S::CP-GFP(pHJ295)的物理图谱，(L)为35S::2b-GFP(pHJ384)的物理图谱，(M)为Gateway植物表达载体pFK242的物理图谱，(N)为Gateway植物表达载体pFK272的物理图谱，(O)为入门载体WUS-GR(pJF323)的物理图谱，(P)为UBQ10::WUS-GR(pHJ426)的物理图谱，(Q)为35S::2b(pHJ152)的物理图谱，(R)为35S::GFP(pHJ122)的物理图谱，(S)为35S::WUS-GR(pHJ167)的物理图谱，(T)为入门载体2b(pHJ144)的物理图谱，(U)为入门载体GFP(pHJ99)的物理图谱。
图2示出了WUS在烟草叶片中表达抑制CMV病毒侵染；其中A表示烟草叶片中浸润表达WUS模式图，I表示接种CMV病毒的叶片，A1，A2表示与接种病毒叶片临近的叶片；其中，B和C分别为实时定量qRT-PCR分析WUS表达时烟草叶片中与接种叶片相邻叶片中CMV病毒RNA积累；数据显示WUS表达显著抑制了CMV病毒RNA的积累。
图3示出了WUS基因作为转录因子沉默GFP蛋白。将35S::GFP+35S::2b+35S::GUS(其中，35S::GFP为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子驱动GFP基因过表达的载体，35S::2b为35S启动子驱动CMV 2b基因过表达的载体，其可以抑制GFP mRNA RNA干扰沉默，35S::GUS为35S启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因GUS过表达)组合按等体积混匀的农杆菌浸润表达在烟草叶片中，6天后采用共聚焦观察GFP信号，GFP不被沉默。将35S::GFP+35S::2b+35S::WUS组合按等体积混匀的农杆菌浸润表达在烟草叶片中，显示GFP信号沉默。将35S::GFP+35S::2b+35S::WUS-GR(其中，35S::WUS-G为35S启动子驱动WUS基因融合糖皮质激素受体GR基因过表达)+ETOH(乙醇)设置为对照组，GFP信号不被沉默，因为GR没有被诱导进入细胞核，此时的WUS是没有功能的。将35S::GFP+35S::2b+35S::WUS-GR+DEX设置为实验组，DEX处理诱导GR进入细胞核，其融合表达的WUS也被诱导迁移进细胞核，此时WUS恢复活性，GFP信号被沉默。该实验证明WUS基因沉默GFP，其依赖于WUS进入核行使转录因子的活性。
图4示出了在拟南芥中诱导WUS基因抑制CMV病毒***性感染。其中，A表示在UBQ10::WUS-GR转基因拟南芥中，通过原位杂交检测CMV病毒在拟南芥体内的分布。图中颜色区域表示CMV病毒RNA所在位置。其中DEX不诱导，将其作为对照组，此时WUS没有活性，叶片摩擦接种的CMV病毒快速通过维管***移动到分生组织下沿，对植物造成***性感染。其中，B表示DEX诱导WUS进入细胞核，WUS活性恢复，抑制CMV病毒感染，图4B中显示没有检测到CMV病毒。其中，C表示通过统计数据分析A和B中的切片数目。D表示通过Northern-blot实验分析CMV病毒RNA的积累。没有接种CMV病毒的植物检测不到CMV存在，DEX诱导野生型拟南芥不影响CMV对拟南芥的感染。在UBQ10::WUS-GR转基因拟南芥中，不施加DEX，CMV在植物体内积累，造成***性侵染，而施加DEX诱导，显著抑制了CMV病毒RNA在植物中的积累。以上的结果证明，在拟南芥体内诱导异位表达WUS显著抑制CMV感染。
图5示出了WUS抑制CMV病毒蛋白的合成。其中A为分别将CMV编码的4种蛋白质与GFP融合表达。然后将各表达载体与35S::6Myc-WUS共表达在烟草表皮细胞中。绿色GFP信号表示病毒翻译的蛋白质。在所有的对照组实验中，GFP信号都清晰可见，表明病毒蛋白质被大量翻译合成。而在加入WUS的实验组中，GFP信号显著降低，病毒翻译的蛋白质合成被抑制，这表明WUS抑制了CMV病毒蛋白质的合成。其中B为各组的相对荧光强度，其代表了相对的CMV病毒蛋白的量，通过计算荧光信号强度定量分析WUS对病毒蛋白质合成的抑制。其中C显示了在UBQ10::WUS-GR转基因拟南芥中，通过诱导WUS证明CMV 2b蛋白质积累被显著抑制。
图6示出了WUS对总蛋白的抑制效果。OP-P是一种氨酰tRNA类似物，可以被植物吸收嵌入新合成的蛋白肽链，其偶联有荧光染料，绿色信号表示新合成的被标记的肽链。荧光信号强弱，代表了蛋白质合成的效率的高低。其中A表示，在不加OP-P处理的对照组中，检测不到绿色荧光，加入蛋白质合成抑制剂CHX，抑制蛋白质合成，因此绿色信号被抑制，表明蛋白质合成效率低下。在不加DEX的空白实验组中，OP-P绿色信号，表示新合成的蛋白质肽链，而DEX诱导WUS，OP-P信号降低，表明WUS显著抑制了总蛋白质合成。其中B表示，DEX诱导不影响野生型拟南芥中蛋白质的合成。其中，C和D分别定量分析为A和B中OP-P荧光信号强度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例1、WUS基因在烟草中抑制病毒感染的应用
1、WUS cDNA序列的获得
提取30天苗龄的拟南芥茎顶端花序，剥离大的花苞，迅速置于液氮中，研磨质粉状，采用TRI(T9424，Sigma)试剂提取总RNA。然后采用RT-PCR第一条链cDNA合成试剂盒(11483188001，Roche)反转录合成第一链cDNA，以cDNA作为模板RT-PCR扩增出WUScDNA序列。所有操作步骤，均按试剂盒说明书进行。
RT-PCR引物如下：
上游引物(SEQ ID No:3)：
5’-AAActgcagAGAGCCGCCACAGCATCAGCA-3’
下游引物(SEQ ID No:4)：
5’CTCgagctcCTAGTTCAGACGTAGCTCAA-3’。
引物中大写字母序列为WUS序列，小写字母为酶切位点序列。
50μL PCR扩增体系为：0.8μL FastPfu聚合酶(北京全式金生物技术公司)，2μLcDNA，5×PCR缓冲液10μL，dNTPs(10μM)1μL，上下游引物10μM各1μL，再用双蒸水将反应体系补充至50μL。
PCR程序为：先95℃，5min，预变性；然后95℃30s，58℃30s，72℃1min，共32个循环。反应结束后，对PCR产物进行回收测序，测序表明该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示，其编码如SEQ ID No:1所示的蛋白。
2、WUS过量表达载体的构建
将PCR扩增的WUS CDS序列，通过Pst 1和Sac I双酶切的方法，连到载体pBSK-6-Myc-3HA(丁勇教授惠赠，中国科学技术大学)，构建phj104(6Myc-WUS)载体，经过测序后。通过Hind III和Sac I双酶切的方法连到Phj111载体，构建入门载体phj143(WUS-entry)。最后利用GatewayR LR ClonaseTM II Enzyme Mix试剂盒(11791020，Thermo Fisher)，通过重组反应将6Myc-WUS重组到植物表达载体PFK209质粒中，构建phj151载体(35S::6Myc-WUS)(如图1所示)。
3、WUS基因在烟草叶片中浸润表达抑制病毒感染
将30天苗龄的本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，通过摩擦接种100ng/μl的黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)RNA。将构建的植物表达载体35S::6Myc-WUS通过热激法转化农杆菌，随后挑取单克隆于1/2LB(Typptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl10g/L)液体培养基，28℃培养过夜。通过离心的方式，收集菌体，并且重悬于浸润缓冲液中(10mM 2-N-morpholino ethanesulfonic acid,10mM MgCl2,150mMacetosyringone，pH5.8)，并且调节OD600＝1.0。设置以下实验组，35S::GUS作为对照组，35S::6Myc-WUS(也表示为35S::WUS)作为实验组。其中，GUS为β-葡萄糖苷酸酶基因，将该基因的CDS序列首先构建到入门载体PJLsmart里面，然后通过LR重组反应连接到PFK209中(如图1所示)即得35S::GUS质粒。将两组农杆菌，分别注射到感染CMV 8天烟草叶片的下表皮细胞中(图2A)。其中，离接种病毒的叶最近的叶片定义为A1，其相邻的为A2(图2A)。浸润表达WUS 4天后，分别收集实验组和对照组的叶片。采用本实施例步骤1中所述，提取总RNA，反转录合成第一链cDNA(AT341，全式金)，并且采用GoTaq qPCR Master Mix(A6002，Promega)试剂盒进行实时定量RT-PCR，分析CMV病毒基因组RNA在烟草叶片中的积累。结果如图2所示，在烟草叶片中浸润表达WUS，无论是在第一临近叶还是第二临近叶，CMV基因组RNA均被显著抑制(图2B和图2C)。因此，WUS蛋白在烟草叶片中可以抑制CMV病毒的基因组RNA的积累。
实施例2、在拟南芥中诱导表达WUS抑制CMV病毒积累
以WUS-GR的载体(pJF323)为入门载体，利用GatewayR LR ClonaseTM II EnzymeMix试剂盒(11791020，Thermo Fisher)，将WUS-GR连接到植物表达载体PFK272中，构建UBQ10::WUS-GR(pHJ426)载体(图1所示)，然后转化农杆菌GV3101(GT701，北京华越洋生物)。通过花序浸染法转化Col-0拟南芥，获得诱导表达WUS的转基因拟南芥UBQ10::WUS-GR(WUS-GR)，该转基因系中WUS融合表达糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)蛋白。植物中并不存在糖皮质激素物质，因此正常情况下，GR存在于细胞质中，而WUS主要作为转录因子行使抑制蛋白质合成的功能，因此此时异位表达的WUS并没有功能。而在长效糖皮质激素***(dexamethasone,DEX)15μM喷洒处理时，GR受体收到糖皮质激素信号，迅速从细胞质移动到细胞核，此时WUS也被牵引进入细胞核，WUS将在细胞核中行使功能。采用此诱导***，此发明证明了WUS在拟南芥体内抑制CMV病毒感染。下面将详述操作过程。
WUS蛋白作为转录因子在调节干细胞稳定的过程中发挥重要作用。我们发现WUS在沉默外源蛋白过程中，同样作为转录因子行使功能。为了验证这一理论，首先构建了35S::GFP和35S::WUS-GR植物表达载体。构建过程如下：首先将GFP的编码区序列克隆到入门载体，构建GFP入门载体(pHJ99)，然后通过LR反应(11791020，Thermo Fisher)，将GFP构建到植物表达载体PFK209中，从而获得35S::GFP(pHJ122)。同样将WUS-GR入门载体(pJF323)通过LR克隆到植物表达载体PFK209，获得35::WUS-GR(pHJ167)(如图1所示)，然后分别转化农杆菌GV3101。在烟草叶片中，共表达35S::GFP和35S::WUS，发现WUS可以抑制GFP蛋白质信号。同样，在加入乙醇的对照实验中，WUS-GR存在于细胞质中，GFP信号不被WUS抑制。在实验组中，施加DEX诱导WUS-GR被诱导进入细胞核，此时GFP信号被抑制。这说明WUS沉默GFP依赖其转录因子活性(图3)。随后，将采用UBQ10::WUS-GR研究WUS在拟南芥体内抑制CMV病毒的作用。
将拟南芥UBQ10::WUS-GR种子采用70％乙醇消毒6min，然后用95％乙醇清洗种子两次，每次2分钟，随后将种子置于滤纸上，空气中干燥，直至种子干燥。然后将种子放入0.1％的琼脂中，置于4℃。2天后，将种子播种拟南芥营养土中，置于温室中，22℃，长日照(16h光照/8h黑暗)培养4周。
将4周苗龄的UBQ10::WUS-GR植物叶片摩擦接种CMV RNA(100ng/μL)2μL,1天后，喷洒15μM DEX溶液作为实验组，同时设置喷洒水的空白对照组。CMV感染8d后，通过原位杂交的方法，检测CMV病毒RNA在拟南芥茎顶端的分布。操作过程如下：分别收取对照组和实验组的拟南芥的茎顶端，剥离大部分可见花苞，迅速置于FAA (50％乙醇，5％乙酸，3.7％甲醛)固定。最后将材料置于莱卡ASP200S脱水机中，经过系列酒精梯度，二甲苯透明和石蜡浸透。最后将植物材料包埋进石蜡中。采用莱卡切片机，将植物材料切成8μm切片，置于粘附载破片上。切片经过脱蜡、梯度酒精复水、蛋白酶K消化(罗氏，3115887001)、FAA再固定、梯度酒精脱水、与CMV RNA3地高辛标记的探针(该探针以CMV病毒RNA3为模板，采用罗氏DIG RNA标记试剂盒(11175025910)体外转录合成)，55℃孵育过夜、非特异性探针洗脱、封闭、地高辛抗体(罗氏，11093274910)孵育、封闭液清洗、NBT-BCIP底物(罗氏，11681451001)显色等过程。地高辛标记的CMV RNA3特异探针与切片组织上的CMV RNA互补杂交。通过地高辛抗体特异识别CMV RNA探针，可以在组织原位分析病毒在植物体内的积累。
CMV RNA3原位杂交的实验表明DEX诱导表达WUS，显著抑制了病毒在拟南芥茎和顶端的积累，CMV感染率由88％下降到10％(图4A-C)。以上结果证明，WUS抑制了CMV病毒的***性感染。
进一步，采用Northern-Blot的方法，采用罗氏Northern杂交试剂盒(12039672910,Roche)检测了诱导WUS表达对CMV基因组RNA积累的影响。操作过程如下：分别收取对照组和实验组的拟南芥顶端花序，迅速置于液氮中，并采用TRI(T9424，Sigma)试剂提取总RNA。对RNA进行琼脂糖甲醛变性电泳，电泳后采用虹吸法将RNA转移到尼龙膜(11417240001,Roche)，将CMV特异地高辛标记的探针与尼龙膜55℃孵育杂交过夜，随后采用严谨和非严谨的洗脱液洗去多余探针，尼龙膜置于脱脂奶粉中封闭1h，采用地高辛抗体孵育1h，最后加入显色底物，反应5min，在BIO-RAD化学发光仪中观察记录CMV RNA基因组积累的差异。Northern-Blot结果显示DEX诱导表达WUS显著抑制了CMV基因组RNA的积累(图4D)。
以上两组实验证明WUS基因在拟南芥体内显著抑制了CMV病毒的***性感染，使CMV病毒的感染率在10％以下，并且可显著抑制病毒RNA在拟南芥体内的积累，表明WUS在植物抗病毒中具有广泛的应用前景。
实施例3、WUS通过抑制总蛋白质合成抑制CMV病毒复制
CMV基因组RNA共编码5种蛋白，1a，2a，3a，CP和2b蛋白。1a和2a蛋白主要与病毒复制相关；3a蛋白为CMV的移动蛋白，与病毒的长距离运输和细胞间移动相关；CP蛋白为病毒的外壳蛋白，与病毒的组装相关。为了解析WUS抵抗CMV的分子机制。设计以下实验验证WUS是否抑制CMV编码蛋白质的合成。
首先，以CMV基因组RNA为模板，合成其cDNA第一链，然后分别采用特异引物(如下)，分别扩增CMV编码的1a、2a、3a、CP和2b基因。
表1引物序列
Figure BDA0002185657920000121
将扩增的CMV编码蛋白序列分别构建35S::2a-GFP，35S::2b-GFP,35S::3a-GFP和35S::CP-GFP植物表达载体。载体构建扩增过程如下：首先分别采用表1的引物，以CMV病毒RNA为模板，采用高保真酶(诺唯赞，P505)分别扩增CMV 2a，2b，3a和CP基因，这些基因均去除终止密码子。将扩增的基因，采用酶切连接的方式，分别连接到入门载体中pJLsmart中，然后分别通过LR重组反应(Thermo Fisher，11791100)，构建到植物表达载体PFK242中，该载体为35S启动子驱动C端融合GFP表达的gateway系列载体，分别获得35S::2a-GFP、35S::2b-GFP、35S::3a-GFP和35S::CP-GFP植物表达载体(图1所示)。最后将GFP融合表达的表达载体，分别转化转化农杆菌GV3101(GT701，北京华越洋生物)。将含有表达质粒的农杆菌，活化培养后，按实施例1中烟草浸润表达的方法操作。将各表达菌株分别与35S::6Myc-WUS载体在烟草叶片下表皮细胞中共表达，置于22度温室，长日照培养。4天后，将浸润表达质粒的烟草叶片用剪刀剪下，并置于载玻片上，在共聚焦显微镜下(蔡司710)，采用488激发光观察GFP信号。结果显示WUS可以抑制病毒蛋白GFP信号的积累，说明WUS抑制病毒蛋白积累(图5A,B)。
在拟南芥UBQ10::WUS-GR中，叶片摩擦接种CMV RNA(100ng/μL)2μL，1天后，喷洒15μM DEX溶液作为实验组，同时设置喷晒水的空白对照组。CMV感染8d后，收获实验组和对照组的拟南芥茎顶端，液氮研磨至粉末状，加入蛋白提取缓冲液(10mMHEPES,pH 7.5,100mMNaCl,1mMEDTA,10％[v/v]甘油,0.5％-1％[v/v]Triton X-100,1:100completeprotease inhibitor cocktail)提取总蛋白质。随后经过SDS-PAGE电泳，转膜、封闭、2b抗体孵育(AS163981,Agrisera)、清洗残留抗体、二抗孵育(兔源，SC2370，Santa Cruz)、清洗多余二抗、加入化学发光底物(170-5060,Bio-Rad)，采用Bio-Rad化学发光仪分析CMV 2b蛋白的积累。Westen Blot的结果显示，在拟南芥体内DEX诱导WUS显著抑制CMV 2b蛋白的积累。因此，WUS在植物体内抑制病毒蛋白积累(图5C)。
进一步在拟南芥中，分析DEX诱导WUS对拟南芥新生蛋白质的影响。对UBQ10::WUS-GR转基因植物喷洒DEX诱导WUS表达，3天后将茎顶端花序取下并剥离大的花苞，置于2ml 1/2MS中，同时添加20μMO-propargylpuromycin(OP-P)和15μM DEX处理1小时，同时野生型拟南芥，同样按以上方法处理。处理后，将植物材料洗去OP-P，并置于FAA中固定。按实施例2中组织切片的方法，处理组织切片，并采用Click-iT Plus OPP Protein Synthesis AssayKits(CS10456,Thermo Fisher)，按其说明书操作，在蔡司710共聚焦显微镜下观察OP-P信号。OP-P是一种氨酰tRNA类似物，可以被细胞快速吸收，在蛋白质合成过程中，打断多肽的转移，使其结合到新生的肽段中，并组织蛋白质合成。这样每一个新生的肽段，都在末端嵌入一个OP-P，采用OP-P偶联的荧光染料可以组织原位水平显示蛋白质合成效率。结果显示，DEX诱导WUS显著抑制了总的新生蛋白质的合成，而在对照组中，诱导WUS并不影响蛋白质合成效率(图6)。以上的结果证明，WUS可以抑制总蛋白合成，包括病毒编码的蛋白质的合成，从而抑制了病毒的复制和组装过程。WUS抑制蛋白质合成，是广谱的过程，没有专一性。因此，WUS通过抑制总蛋白合成抑制病毒复制和组装的过程也没有专一性，即具有广谱抗病毒的特性。
我们在实施例中详实的描述了WOX基因家族WUS基因以及WUS基因所编码的蛋白质在抗病毒中的应用及其应用的基础。WUS基因抗病毒的应用不仅限于实例中的拟南芥和烟草，在所有植物中都可以应用，特别是重要的经济作物或者粮食作物。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Figure IDA0002185657970000021
Figure IDA0002185657970000031
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Claims (16)

1.下述任一种在培育抗病毒植物中的应用：
(1)WUS基因；
(2)WUS基因所编码的蛋白质，即WUS蛋白质，所述WUS蛋白质是氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示；
(3)含有WUS基因的重组载体；
(4)含有WUS基因的重组微生物，或含有(3)所述重组载体的重组微生物；
其中所述WUS基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，WUS基因来源于拟南芥。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述重组载体具有启动子、增强子、报告基因或标记基因。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶或单子叶植物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥、烟草、马铃薯、大豆、水稻、玉米或小麦。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或烟草。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为植物病毒。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为黄瓜花叶病毒CMV、花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV或水稻条纹病毒RSV。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为黄瓜花叶病毒CMV。
10.一种培育抗病毒转基因植物的方法，其特征在于，将WUS基因导入目的植物中，其中所述WUS基因是核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的DNA分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述植物为双子叶或单子叶植物。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥、烟草、大豆、水稻、马铃薯、玉米、小麦以及林木和园艺植物。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥或烟草。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述病毒为植物病毒。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述病毒为黄瓜花叶病毒CMV、花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV或水稻条纹病毒RSV。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述病毒为黄瓜花叶病毒CMV。
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