CN112522217B - 一种犬瘟热弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了犬瘟热病毒弱毒株HL001‑M3株，其具有良好的免疫原性，遗传稳定，低毒，制备的活疫苗能预防和治疗犬瘟热，针对流行株进行保护，并能对多种动物进行保护。

Description

一种犬瘟热弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种犬瘟热弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用。
背景技术
犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是属于副黏病毒科麻疹病毒属的单股RNA病毒，病毒粒子呈圆形或不整形。近年来，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，CDV的自然感染宿主已由传统的犬科(包括犬、狐狸、貉子等)、浣熊科和鼬科(水貂等)动物扩展到食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且呈现不断扩大的趋势。
犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒感染引起的犬科、鼬科、浣熊科等动物的急性、热性、高度接触性传染病。其主要特征为双相型发热，眼、鼻、消化道等粘膜炎症，以及卡他性肺炎、皮肤湿疹和神经症状。该病是目前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一，受到广泛重视。
目前国内外预防和控制犬瘟热所用疫苗中涉及的CDV毒株基因型均为上世纪30-40年代北美流行的北美Ⅰ型、经过弱化的传统CDV疫苗株，如Onderstepoort株、Snyder Hill株、Lederle株、Convac株，而现阶段国内主要流行的是亚洲I型CDV野毒株。这些传统的CDV疫苗株与国内近10年流行的CDV野毒株在基因型上具有较大差距，存在抗原针对性不强的缺陷，尤其近年来犬瘟热病毒不断变异、感染宿主不断扩大，从而导致国内犬瘟热疫情一直无法得到有效控制，研制既安全又有良好免疫原性的弱毒疫苗具有重要的现实意义。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种亚洲I型犬瘟热弱毒株，所述犬瘟热弱毒株具有安全性高和良好的免疫原性的特点，其制备的疫苗能够抵抗现有流行株感染，且对不同宿主的感染均有良好的预防和控制作用。
为此，本发明提供一种犬瘟热病毒弱毒株，其与其犬瘟热亲本强毒株相比，H蛋白氨基酸序列具有以下突变位点：H477L，R519I；其F蛋白氨基酸序列具有以下特征性位点：N209S，L390F。
本发明的犬瘟热病毒弱毒株其H蛋白氨基酸序列、F蛋白氨基酸序列发生的点突变，较亲本强毒株毒性降低，且具有遗传稳定性。
根据本发明，所述犬瘟热病毒弱毒株H蛋白如SEQ NO.1所示，所述犬瘟热病毒弱毒株F蛋白如SEQ NO.2所示。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒弱毒株为犬瘟热病毒HL001-M3株，保藏号为CCTCC NO.V201940。
本发明提供的犬瘟热病毒HL001-M3株，其中，所述犬瘟热病毒HL001-M3株(CanineDistemper Virus,Strain HL001-M3)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201940，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2019年6月19日。
致病性试验表明，犬瘟热病毒HL001-M3株培养1代至80代之间，对犬致病力显著降低。犬在接种后观察21天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒犬瘟热病毒HL001株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，犬瘟热病毒HL001-M3株培养至第80代，仍具有良好的免疫原性。犬在接种后21天，可抵御强毒犬瘟热病毒HL001株的攻击。同时，未接种HL001-M3株培养物的犬，则不能抵御犬瘟热病毒HL001株的攻击，全部发病。
病毒返强试验表明，培养1代至80代之间的病毒，接种后在犬群中连续接触传代多次，不发生返强。因此，病毒接种犬群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的犬瘟热病毒HL001-M3株或其培养物和药学上可接受的载体。
本发明提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物由犬瘟热病毒HL001-M3株作为抗原来制备的。
本发明的疫苗组合物能对现有流行株进行保护，不仅具有预防效果，还能治疗感染的犬只，更可阻断犬瘟热病毒的连续感染。
作为本发明的一种实施方式，所述的犬瘟热病毒HL001-M3株的培养物为其1～80代的培养物。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为≥104.5FAID50/头份。
作为本发明的一种优选实施方式，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为104.5～105.5FAID50/头份。
作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体为冻干保护剂。
还可以包含可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如SPGA、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。
本发明的一个方面在于提供一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括：(1)将所述的犬瘟热病毒弱毒株或培养物扩增培养，获得扩增的所述的犬瘟热病毒弱毒株；以及(2)在所述步骤(1)中获得的所述扩增的犬瘟热病毒弱毒株中加入载体。
作为本发明的一种优选的实施方式，在本发明所述的制备疫苗组合物的方法中，所述犬瘟热病毒弱毒株培养物包括犬瘟热病毒弱毒株1～80代的培养物。
作为本发明的一个优选实施方式，所述制备所述疫苗组合物的方法中，所述的方法包括：(1)培养犬瘟热病毒弱毒株；以及(2)在所述培养的犬瘟热弱毒株中加入冻干保护剂。
任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的减毒的犬瘟热病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的犬瘟热病毒和来自另一致病病毒或微生物(见下文)的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫***的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP 1099 42)、皂苷、矿物油、植物油，和Carbopol。
因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是免疫有效量。所述免疫有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗犬瘟热的药物中的应用。本发明的犬瘟热弱毒株具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，制备的弱毒活疫苗能够产生较高水平的抗体，能够对流行株犬瘟热强毒攻击具有良好的保护效果，且对不同宿主感染犬瘟热病毒均具有良好的保护效果。
作为本发明的一种实施方式，所述应用针对犬、水貂、狐狸。
本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制犬瘟热病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使犬瘟热病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
作为本发明的一种实施方式，所述治疗的犬瘟热为持续感染。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
实施例1犬瘟热病毒HL001-M3株的获得
1.取生长良好的Vero细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～97％体积比的DMEM培养液和3％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，形成良好单层，用于接种病毒。
2.将犬瘟热病毒HL001株接种生长良好的上述传代细胞单层，用含有95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，于72h～96h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液。
3.重复上述步骤连续传代培养获得犬瘟热病毒弱毒株，将获得的犬瘟热病毒弱毒株进行测序，结果显示H基因的1430的核苷酸由A→T发生稳定突变，导致H蛋白H477L氨基酸变异，1556位核苷酸由G→T发生稳定突变，导致H蛋白R519I氨基酸变异；F蛋白基因的626的核苷酸由A→G发生稳定突变，导致F蛋白N209S氨基酸变异，1168位核苷酸由C→T发生稳定突变，导致F蛋白L390F氨基酸变异。将该犬瘟热病毒弱毒株命名为犬瘟热病毒HL001-M3株。
实施例2犬瘟热病毒HL001-M3株生物学特性研究
1.致病性试验
2～3月龄的健康易感抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，每组5只，分组和攻毒情况见表1。
表1致病性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
1 HL001-M3株 滴鼻2ml、腹腔4ml(10<sup>5.5</sup>FAID<sub>50</sub>/ml)
2 HL001株 滴鼻2ml、腹腔4ml(10<sup>5.5</sup>FAID<sub>50</sub>/ml)
3 DMEM培养基 滴鼻2ml、腹腔4ml
病毒接种后观察21日，每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表2。
表2 HL001-M3株对犬的致病性
Figure BDA0002206080220000061
结果显示，犬瘟热病毒HL001株可以导致犬100％发病(5/5)，而犬瘟热病毒HL001-M3株体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
致病性试验表明，犬瘟热病毒HL001-M3株与亲本强毒株HL001株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
同时，为验证犬瘟热病毒HL001-M3株不同代次致病力的稳定性，用第1代、20代、40代、60代、80代的犬瘟热病毒HL001-M3株培养物，各接种一组犬瘟热抗原抗体阴性犬(5头)，滴鼻2ml、腹腔4ml(105.50FAID50/ml)/头，5头犬作为对照组。每日观察、记录犬的临床变化，直至接种21天。
结果显示，第1代、20代、40代、60代、80代的犬瘟热病毒HL001-M3株培养物，接种后观察21天，体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
不同代次致病性试验表明，犬瘟热病毒HL001-M3株不同代次培养物致病力显著降低，是致弱的病毒株。
2.免疫原性试验
在免疫后第21天，对犬瘟热病毒HL001-M3株接种的犬5头，以及对照组5头，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.50FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表3。
表3 HL001-M3株对犬的免疫原性
Figure BDA0002206080220000071
Figure BDA0002206080220000081
结果显示，犬瘟热病毒HL001-M3株接种过的犬全部保护，而对照组犬全部发病。
免疫原性试验表明，犬瘟热病毒HL001-M3株具有良好的免疫原性，能对犬瘟热病毒HL001株攻击产生良好的保护作用。
同时，为验证犬瘟热病毒HL001-M3株不同代次免疫原性的稳定性，对分别免疫第1代、20代、40代、60代、80代的犬瘟热病毒HL001-M3株培养物后第21天，各免疫组连同对照组均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录。
结果显示，第1代、20代、40代、60代、80代的犬瘟热病毒HL001-M3株培养物接种过的犬全部保护，对照组犬全部发病。
不同代次免疫原性试验表明，犬瘟热病毒HL001-M3株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对犬瘟热病毒HL001株攻击产生良好的保护作用。
3.病毒返强安全性试验
将犬瘟热病毒HL001-M3株第1代病毒液(107.40FAID50/ml)通过滴鼻2ml、腹腔注射4ml接种3只健康易感犬。接种后每日早晚测温和观察临床表现，接种后第8日剖杀，观察病变，并对肺脏采样进行组织病学HE染色和免疫组化检测，对肺脏研磨液进行犬瘟热病毒核酸测定，挑选病毒含量高的犬肺脏适当处理后作为下一代毒力返强用接种物，如此在犬体内传至第4代。
取第4代毒力返强试验获得肺脏研磨液过滤后再经滴鼻2ml、腹腔注射4ml接种3只健康易感犬。接种后每日早晚测温和观察临床表现，接种后第21日剖杀，观察病变，并对肺脏、肠、肠系膜***和脑采样进行HE和免疫组化检测，对肺脏研磨液进行病毒核酸测定。
如在第1～4代毒力返强继代试验中，如果出现某代试验中，肺脏组织检测不到犬瘟热病毒核酸，则应适当加大接种量，同样方式接种6只犬，以提高病毒核酸检出率，如果进一步试验确证继代后不能重新在肺脏检测到犬瘟热核酸，表明该毒力返强试验结果可判成立，该毒株没有毒力返强可能。
结果显示，第1代病毒液接种犬后体温和临床表现均未见异常，接种后第8日剖检，组织器官未见异常，HE染色未见异常，肺脏免疫组化检测可见少量CDV抗原阳性,肺脏可分离到CDV病毒；取第1代后的肺脏研磨液再接种50～65日龄健康易感犬进行第2代毒力返强试验，依次传至第4代所有接种犬体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，HE染色均未见异常，免疫组化检测结果均为阴性；传至第4代，犬肺脏已检测不到病毒载量。将第3代毒力返强肺脏研磨液浓缩加倍接种6只50～65日龄健康易感犬,进行第4代毒力返强重复试验,接种后临床表现均未见异常,接种8日后剖检,各组织脏器均未见异常,肺脏病毒载量检测仍为阴性。毒力返强试验时同居饲养的试验犬，临床观察也未见异常，同居饲养21日后血清CDV抗体也未见转阳，可见犬瘟热病毒HL001-M3株即没有毒力返强能力，也不水平传播，是一株安全性良好的弱毒株。
分别将犬瘟热病毒HL001-M3株第20代、40代、60代、80代病毒液参照上述病毒返强试验步骤进行验证，结果显示接种犬体温和临床表现均未见异常，组织器官未见异常，HE染色未见异常，肺脏免疫组化检测可见少量CDV抗原阳性,肺脏可分离到CDV病毒；依次传至第4代所有接种犬体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，HE染色均未见异常，免疫组化检测结果均为阴性；荧光定量PCR检测结果也显示传代过程中病毒载量逐渐下降，传至第4代，已检测不到病毒载量；剂量加倍试验及同居试验也未见异常。
因此，犬瘟热病毒HL001-M3株不会重新演变为强毒而引起发病，安全性有保证。
4.基因序列分析
将犬瘟热病毒HL001-M3株第1代至第80代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得氨基酸序列与亲本强毒株HL001株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，犬瘟热病毒HL001-M3株第1代至第80代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致H蛋白H477L、R519I氨基酸变异，F蛋白N209S、L390F氨基酸变异。
表明，犬瘟热病毒HL001-M3株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因。
实施例3犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将实施例1制备的犬瘟热病毒HL001-M3株毒种同步接种Vero细胞悬液，加入含2％新生牛血清的DMEM培养液，置37℃、5％CO2培养。待80％细胞病变后，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的病毒液与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表4。
表4犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗含量配比
组分 疫苗1(FAID50)/头份 疫苗2(FAID50)/头份
HL001-M3株抗原 10<sup>4.5</sup> 10<sup>5.5</sup>
保护剂(V/V) 50％ 50％
实施例4犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的免疫原性试验
28日龄以上的犬瘟热抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，每组5只，免疫实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗。第4组免疫疫苗1，第5组免疫疫苗2，第6组为对照组。免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表5。
表5犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
Figure BDA0002206080220000111
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护，而对照组犬攻毒后全部发病。
证明了两个试验组犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性。
实施例5犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验
将45日龄犬瘟热病毒抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，5只/组。第7组免疫实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗疫苗1；第8组免疫商品化犬瘟热、细小病毒二联活疫苗(犬瘟热Onderstepoort株)；第9组为对照组。免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表6。
表6犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验结果
Figure BDA0002206080220000121
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断病毒感染(不出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护；对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能对犬完全保护。
证明了犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
实施例6犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的临床试验
分别挑选山东、辽宁、广东、陕西四地发生犬瘟热的犬场，对未出现临床症状的犬进行隔离，采集眼鼻肛拭子进行PCR检测，并免疫实施例3制备疫苗1，每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表7。
表7犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的临床试验免疫结果
Figure BDA0002206080220000122
Figure BDA0002206080220000131
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗免疫不同地区发病犬后，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护，说明本发明的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗在临床能治疗感染了犬瘟热病毒的犬。
证明了本发明犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对不同地域犬瘟热病毒感染显示出很好的免疫保护和安全性。
进一步将免疫前感染犬瘟热病毒的犬在逐步恢复正常后每组(10～13组)随机选取5只，另再选取犬瘟热病毒抗原抗体阴性犬5只作为对照，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表8。
表8犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的临床试验攻毒结果
Figure BDA0002206080220000132
Figure BDA0002206080220000141
结果显示，各免疫过实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗的犬，在攻毒后均未出现临床症状，能为犬提供100％(5/5)保护；对照组犬攻毒后全部发病。
进一步证明了本发明犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗具有很好的保护力，可阻断犬瘟热病毒的连续感染。
实施例7犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗对水貂的免疫保护试验
50日龄犬瘟热抗原抗体阴性水貂15只随机分成3组，每组5只，免疫实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗。第15组免疫疫苗1，第16组免疫疫苗2，第17组为对照组。免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对水貂的精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物、眼睑和鼻镜及足垫进行观察记录，具体结果见表9。
表9犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗对水貂的免疫原性试验结果
Figure BDA0002206080220000142
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗免疫水貂后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为水貂提供100％(5/5)保护，而对照组水貂攻毒后全部发病。
证明了两个试验组犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗具有很好的保护力，对水貂显示出很好的免疫保护和安全性。
实施例8犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗对狐狸的免疫保护试验
50日龄犬瘟热抗原抗体阴性狐狸15只随机分成3组，每组5只，免疫实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗。第18组免疫疫苗1，第19组免疫疫苗2，第20组为对照组。免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒HL001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对狐狸的精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物、眼睑和鼻镜进行观察记录，具体结果见表10。
表10犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗对狐狸的免疫原性试验结果
Figure BDA0002206080220000151
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗免疫狐狸后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为狐狸提供100％(5/5)保护，而对照组狐狸攻毒后全部发病。
证明了两个试验组犬瘟热病毒HL001-M3株弱毒活疫苗具有很好的保护力，对狐狸显示出很好的免疫保护和安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.犬瘟热病毒弱毒株，其中，所述犬瘟热病毒弱毒株为犬瘟热病毒HL001-M3株，保藏号为CCTCC NO.V201940。
2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求1所述的犬瘟热病毒HL001-M3株或其培养物和药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的犬瘟热病毒HL001-M3株的培养物为其1～80代的培养物。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为≥104.5FAID50/头份。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述犬瘟热病毒HL001-M3株含量为104.5～105.5FAID50/头份。
6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体为冻干保护剂。
7.权利要求2～6所述的疫苗组合物在制备预防和治疗犬瘟热的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述应用针对犬、水貂、狐狸。
9.根据权利要求7所述的应用，其中，所述治疗的犬瘟热为持续感染。
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