CN112516117A - Msm在制备破坏细胞壁及脏器保护药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明本发明属于药物应用技术领域，具体为MSM在制备破坏细胞壁及脏器保护药物中的应用。将MSM与大肠杆菌或耐药菌MRSA接触，可在其对数生长期抑制或杀灭大肠杆菌或耐药菌MRSA，破坏其细胞壁；显著降低致死剂量MRSA急性感染机体中总胆红素和谷草转氨酶，对感染机体的脏器具有明显的保护作用且对其他脏器保护作用无显著差异；MSM处理后炎症因子IL‑6、TNF‑α、IL‑1β的表达水平明显降低，其余细胞因子变化水平不显著；并且腹腔巨噬细胞产生的ROS及NO减少，对机体造成的损伤较少；腹腔巨噬细胞的凋亡及自噬水平下降，在机体中发挥功能的时间延长，具有防致死剂量MRSA急性感染致死的效果。

Description

MSM在制备破坏细胞壁及脏器保护药物中的应用
技术领域
本发明属于药物应用技术领域，具体为MSM在制备破坏细胞壁及脏器保护药物中的应用。
背景技术
因滥用抗生素导致多重耐药菌产生的超级细菌，患者因无药可用，感染持续加剧最终导致死亡，目前已成为全球科学家普遍关注的重大健康问题。从自然界寻找有别于抗生素的抗菌药物研究显得尤为重要，对于多重耐药细菌感染的治疗有望获得新的突破。
甲基磺基甲烷(MSM，Methylsulfonylmethane)，又称二甲基砜和甲基砜，分子量为94kd，是二甲亚砜(DMSO)的代谢物，是一种有机含硫化合物，天然存在于各种水果、蔬菜、谷物、未经高温消毒的牛奶、鱼及动物肉类中。高温烹饪及其他食物加工的方式会降低食物中MSM的浓度。它作为一种流行的膳食补充剂，1999年MSM在美国销量额为1500万美元。已有证据表明MSM能促进皮肤、头发、指甲的再生，能减轻疼痛、消炎、减轻关节炎、缓解过敏及哮喘症状、抵御寄生虫感染等。营养学家推荐的成年人每人每天最好摄入MSM量为1000～6000mg，内科医生推荐量为20g/天，大约为每天300mg/kg。
大鼠的毒性研究显示灌胃给药MSM 2.0g/kg(急毒)和1.5g/kg(亚慢毒)均无不良反应及致死效应。家禽口服MSM 1000～2000mg/kg(急毒)、1500mg/kg(亚慢毒)持续21天，未出现任何不良反应，其生长未受到损害，并且MSM分布于身体的全身。目前已报道的MSM的作用主要有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤及免疫调节作用。对于抗感染方面的研究也仅仅只有研究报道10～16％的MSM在体外能抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长，除此之外未见任何MSM对病原菌感染动物体的保护效应研究。
已有研究进展主要有，LPS刺激RAW264.7细胞株，MSM能抑制iNOS和COX-2的表达进而抑制NO和PGE2的产生，并且抑制NF-kB p65从细胞质向细胞核迁移，从而抑制炎症因子的转录及翻译，缓解LPS刺激引起的炎症。MSM能缓解百草枯导致的肺和肝的氧化损伤。
MSM能显著降低神经细胞分泌NO和ROS水平，其机制为增加抗氧化活性的关键核启动子Nrf2的表达，进而逆转HIV-1Tat介导的谷胱甘肽(GSH)减少，HIV-1Tat介导的氧化谷胱甘肽(GSSG)的增加。
MSM预处理子宫内膜肿瘤细胞株24小时，增强阿霉素对肿瘤细胞诱导凋亡的敏感性及DNA损伤，并发现受p42/44(Erk1/2)MAPK和Akt通路调控。使用TNF-α模拟细胞接受的炎症刺激，MSM联合TNF-α对比单独的TNF-α处理显著降低人心肌细胞系中炎症因子IL-6mRNA及蛋白水平。
上述相关研究均未涉及MSM对大肠杆菌以及耐药菌MRSA的细胞壁作用关系，MSM是否能通过对其细胞壁的作用，来实现抑制或是杀灭上述细菌来实现抗感染的目的，仍未得到证实。
发明内容
根据微生物的生长速度和比生长速度的变化情况，当微生物生长一定阶段后，微生物的比生长速度达到最大，此时进入对数生长期，在对数生长期中若没有抑制或限制微生物生长的因素存在，微生物将保持一个恒定的最大的比生长速度生长，细胞数量呈指数递增，所以为防止感染细菌大量生长，在其对数生长期内控制其增长尤为重要。
本发明目的之一是提供一种利用MSM在对数生长期抑制或杀灭大肠杆菌或耐药菌MRSA的方法。
细菌细胞壁缺陷型细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理化或生物因素的直接破坏或合成被抑制，这种细胞壁受损的细菌一般在普通环境中不能耐受菌体内的高渗透压而胀裂死亡。
在对产B型肠毒素金黄色葡萄球菌的研究中发现，L型金葡菌仍产生致病毒素，但数量较原菌减少，致病力也有所下降。
由此可知，破坏细胞壁可导致细菌死亡或致病力下降。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
对数生长期抑制或杀灭大肠杆菌和/或耐药菌MRSA的方法，用MSM接触所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA，使其细胞壁丧失功能或被破坏。
进一步，用浓度高于1ng/ml的MSM接触所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA，使其细胞壁丧失功能。
进一步，用浓度高于100μg/ml的MSM接触所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA，使其细胞壁被破坏。
进一步，所述MSM与所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA接触时间长于2.5小时。
本发明目的之二是提供一种利用目的一所述方法获得的菌。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
利用目的一所述方法，获得细胞壁丧失功能或被破坏的菌。
本发明目的之三是提供目的二中所获得的菌的用途。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
目的二中所述的菌可以作为制备MRSA感染免疫力提高剂中的应用，比如疫苗的制备，免疫力药物制备等。
本发明目的之四是提供MSM在制备破坏大肠杆菌和/或耐药菌MRSA细胞壁药物的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
用含有浓度高于100μg/ml的MSM成分的药物接触所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA，使其细胞壁被破坏。
进一步，所述MSM在制备致死剂量MRSA急性感染的脏器保护药或MRSA感染致死保护药中的应用。
进一步，所述MSM在制备降低总胆红素、谷草转氨酶含量或炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平的药物中的应用。
进一步，所述MSM在制备降低腹腔巨噬细胞的凋亡及自噬水平或腹腔巨噬细胞中ROS及NO释放量的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.提供了一种抑制或杀灭大肠杆菌或MRSA的方法，通过MSM抑制且能破坏其细胞壁使细菌达到致死效果，且无毒副作用。
2.提供了MSM药物的新用途，保护脏器在MRSA感染后的损伤，保护因MRSA感染而致死。
3.得出MSM抑制大肠杆菌和MRSA生长对数期最低抑制量；高浓度MSM能破坏大肠杆菌和MRSA细胞壁；显著降低MRSA感染机体总胆红素和谷草转氨酶，对感染机体的脏器具有明显的保护作用且对其他脏器保护作用无显著差异；MSM处理后炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平明显降低，其余细胞因子变化水平不显著；并且腹腔巨噬细胞产生的ROS及NO减少，对机体造成的损伤较少；腹腔巨噬细胞的凋亡及自噬水平下降，在机体中发挥功能的时间延长。
附图说明
图1：实施例1中不同浓度MSM对大肠杆菌生长情况影响图；
图2：实施例2中不同浓度MSM对MRSA生长情况影响图；
图3：实施例3中大肠杆菌荧光检测图；
图4：实施例3中MRSA荧光检测图；
图5：实施例4中小鼠存活情况图；
图6：实施例5中总胆红素Tbil、谷草转氨酶AST含量图；
图7：实施例6中血清及腹腔中MRSA含量图；
图8：实施例6中细胞因子表达图；
图9：实施例7中心肝脾器官MRSA直观图；
图10：实施例7中肺肾胸腺器官MRSA直观图；
图11：实施例7中心肝脾器官MRSA含量图；
图12：实施例7中肺肾胸腺器官MRSA含量图；
图13：实施例8中细胞总量、ROS、NO表达水平图；
图14：实施例8中腹腔巨噬细胞情况图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
研究不同浓度MSM(0，1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1ug/ml,10ug/ml,100ug/ml,1mg/ml)对大肠杆菌生长情况作用，采用对数生长期的大肠杆菌，起始细菌数均为5X10^5CFU，加入到5毫升LB培养基中，不同离心管中添加不同浓度MSM，200rpm，37摄氏度振荡培养，每隔数小时记录菌液OD，并根据研究中建立的标准曲线换算cfu，作图(见附图1)。
结论：MSM体外抑制E.coli(大肠杆菌，革兰氏阴性菌)生长情况：发现MSM有明显抑制对数生长期大肠杆菌(E.coli)生长的作用。MSM对大肠杆菌生长的MIC(Minimuminhibitory concentration，最小抑菌浓度)为1ng/ml。
实施例2
研究不同浓度MSM(0，1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml,1mg/ml)对MRSA生长情况作用，采用对数生长期的MRSA，起始细菌数均为5X10^5CFU，加入到5毫升LB培养基中，不同离心管中添加不同浓度MSM，200rpm，37摄氏度振荡培养，每隔数小时记录菌液OD，并根据研究中建立的标准曲线换算cfu，作图(见附图2)。
结论：体外研究，MSM体外抑制MRSA(耐甲氧西林金葡菌，常见耐药菌之一，革兰氏阳性菌)生长情况：发现MSM有明显抑制对数生长期MRSA生长的作用。MSM对MRSA生长的MIC(Minimum inhibitory concentration，最小抑菌浓度)为1ng/ml。
实施例3
研究MSM是否可破坏大肠杆菌及MRSA细菌细胞壁的作用。
将大肠杆菌及MRSA调整细菌浓度至2X10^8CFU/mL，取200微升转移至96孔避光处理培养皿，加入不同终浓度MSM(0，10μg/ml,100μg/ml,1000μg/ml)，37摄氏度培养1小时，加入5g/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)2.5ul/孔，继续培养90分钟，使用荧光分光光度计检测(激发波长535nm，发射波长620nm)。根据吸光值结果作图(见附图3、4)。
结论：高浓度MSM(100μg/ml、1000μg/ml)能破坏大肠杆菌、MRSA细菌壁。
实施例4
动物生存保护效应研究
采用8-9周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠，其中分单独感染MRSA组及MRSA感染联合MSM处理组(500mg/kg)，各10只(>3次独立重复实验)，每只小鼠注射对数生长期MRSA急性致死剂量1*10^8cfu/ml(按0.5OD＝1*10^9cfu/ml)，此MRSA感染剂量经研究室长期研究经验证实；后每隔一个小时记录二组中小鼠存活情况(见附图5)。
结论：MSM(500mg/kg)剂量能显著保护致死剂量MRSA急性感染对小鼠的致死效应。
实施例5
MSM对致死剂量MRSA急性感染小鼠肝功的保护作用
采用8-9周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠，其中分单独腹腔注射感染MRSA组及MRSA感染联合MSM处理组(500mg/kg)，各10只(>3次独立重复实验)，每只小鼠注射对数生长期MRSA急性致死剂量1*10^8cfu/ml(按0.5OD＝1*10^9cfu/ml)，建模后12小时眼球摘除，收集各小鼠外周血，进行血清生化指标检测，包括肝功指标：TBil(总胆红素)、AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)；肾功能指标：Urea(尿素)、Crea(尿肌酐)；心脏功能指标：LDH(乳酸脱氢酶)、CK(肌酸激酶)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)(见附图6)。
结果：动物实验表明MSM(500mg/kg)能显著降低致死剂量MRSA急性感染小鼠总胆红素和谷草转氨酶，对感染动物的脏器具有明显的保护作用。而对其他脏器保护作用无显著差异。
实施例6
MSM处理致死剂量MRSA急性感染小鼠组，减轻机体病原菌感染
采用8-9周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠，其中分单独感染MRSA组及MRSA感染联合MSM处理组(500mg/kg)，各10只(>3次独立重复实验)，每只小鼠注射对数生长期MRSA急性致死剂量1*10^8cfu/ml(按0.5OD＝1*10^9cfu/ml)，建模后12小时眼球摘除，收集各小鼠外周血；及使用等体积生理盐水冲洗腹腔。外周血及腹腔灌洗液均进行10倍、100倍、1000倍倍比稀释，取相同体积涂布LB培养基，选取合适菌落数的稀释倍数，按照稀释倍数及体积，计算小鼠血清及腹腔总细菌CFU。此外，将外周血血清进行细胞因子芯片检测，检测IL-1-alpha.、IL-1-beta、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17A、Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-gamma、KC、MCP-1、MIP-1alpha、MIP-1beta、RANTES、TNF-alpha细胞因子表达(见附图7-8)。
结论：MSM(500mg/kg)处理致死剂量MRSA急性感染小鼠，显著降低腹腔及血清中感染小鼠病原菌，减轻机体MRSA感染水平；MSM处理组炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平也明显降低，其余细胞因子变化水平不显著。
实施例7
MSM处理致死剂量MRSA急性感染小鼠组，减轻机体病原菌感染
采用8-9周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠，其中分单独感染MRSA组及MRSA感染联合MSM处理组(500mg/kg)，各10只(>3次独立重复实验)，每只小鼠注射对数生长期MRSA急性致死剂量1*10^8cfu/ml(按0.5OD＝1*10^9cfu/ml)，建模后12小时处死小鼠，使用等体积生理盐水研磨各组小鼠各脏器，研磨液上清等体积10倍、100倍、1000倍倍比稀释，取相同体积涂布LB培养基，选取合适菌落数的稀释倍数，按照稀释倍数及体积，计算小鼠各脏器总细菌CFU(9-12)。
结果：MSMMSM(500mg/kg)处理能显著降低致死剂量MRSA急性感染小鼠各脏器(心、肝、脾、肺、肾、胸腺)的细菌量，减轻脏器MRSA感染病原菌量，有效控制感染。
实施例8
MSM处理减轻机体致死剂量MRSA急性感染机制探索
采用8-9周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠，其中分单独感染MRSA组及MRSA感染联合MSM处理组(500mg/kg)，各10只(>3次独立重复实验)，每只小鼠注射对数生长期MRSA急性致死剂量1*10^8cfu/ml(按0.5OD＝1*10^9cfu/ml)，建模后12小时处死小鼠，使用等体积生理盐水灌洗腹腔，使用细胞计数仪检测腹腔中细胞总数；并将腹腔细胞贴壁2小时，获得腹腔巨噬细胞，使用试剂盒检测腹腔巨噬细胞中产生ROS及NO水平；使用免疫印迹检测其凋亡(caspase 3起细胞凋亡执行者作用,caspase 9是内源性凋亡途径的执行者)、自噬相关分子(LAC A/B)表达(见附图13-14)。
结果：MSM(500mg/kg)处理致死剂量MRSA急性感染小鼠，腹腔中细胞总数降低，故其吞噬病原菌释放内毒素引发的炎症反应弱(与前述血清中炎症因子水平低相吻合)；MSM处理致死剂量MRSA急性感染小鼠腹腔巨噬细胞产生的ROS及NO减少，对机体造成的损伤较少；腹腔巨噬细胞的凋亡及自噬水平下降，说腹腔巨噬细胞在机体中发挥功能的时间延长。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.对数生长期抑制或杀灭大肠杆菌和/或耐药菌MRSA的方法，其特征在于，用MSM接触所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA，使其细胞壁丧失功能或被破坏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用浓度高于1ng/ml的MSM接触所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA，使其细胞壁丧失功能。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用浓度高于100μg/ml的MSM接触所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA，使其细胞壁被破坏。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MSM与所述大肠杆菌和/或耐药菌MRSA接触时间长于2.5小时。
5.权利要求1所述方法所得的菌。
6.权利要求5所述的菌作为制备MRSA感染免疫力提高剂的应用。
7.MSM在制备破坏大肠杆菌和/或耐药菌MRSA细胞壁药物的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述MSM在制备致死剂量MRSA急性感染的脏器保护药或MRSA感染致死保护药中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述MSM在制备降低总胆红素、谷草转氨酶含量或炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平的药物中的应用。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述MSM在制备降低腹腔巨噬细胞的凋亡及自噬水平或腹腔巨噬细胞中ROS及NO释放量的药物中的应用。
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