CN112505325A - 一种针对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条、检测卡及试剂盒 - Google Patents

一种针对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条、检测卡及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种针对SARS‑CoV‑2野生株与突变株抗原检测试纸条、检测卡及试剂盒，包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线T1、检测线T2和质控线C，所述检测线T1包被SARS‑CoV‑2抗体1，所述检测线T2包被SARS‑CoV‑2抗体2，所述质控线C包被羊抗鼠IgG抗体，所述检测线T1可检测SARS‑CoV‑2野生株与B.1.1.7突变株抗原，所述检测线T2可检测SARS‑CoV‑2野生株抗原；采用硝酸纤维素膜上包被三条线，一条质控线，两条检测线，通过检测线T1与检测线T2对比的方法进行两者的区分，检测线T1与检测线T2均显色，为SARS‑CoV‑2野生株阳性，B.1.1.7突变株阴性，检测线T1显色，检测线T2不显色，为SARS‑CoV‑2野生株阴性，B.1.1.7突变株阳性，实现了对单一病毒感染者SARS‑CoV‑2野生株与B.1.1.7突变株抗原快速、准确的检测。

Description

一种针对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条、检测 卡及试剂盒
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒检测领域，具体是一种针对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条、检测卡及试剂盒。
背景技术
2020年12月，WHO正式通报了新型冠状病毒SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒）自出现以来的主要变异情况，包括四种变体，其中包括英国通过监测数据库发现的，向世卫组织报告的被命名为B.1.1.7的新型冠状病毒变体，其为新型冠状病毒的突变株。
《科学》杂志称，其传播能力要比原始毒株高70%左右，而伦敦最近新冠感染病例超过60％都来自变异病毒。该病毒株最大特点是出现了十几个关键位点的变异，在B.1.1.7突变株谱系中，最值得注意的突变位点是RBD（受体结合区域）中的关键氨基酸突变N501Y。病毒蛋白的结构发生改变后跟我们人体当中的ACE2受体更容易结合，带来的实际后果就是它的传播力更强。
携带突变株的境外输入病例已在国内多地发现，临床上新型冠状病毒的感染均为单一病毒感染，即野生株感染或者B.1.1.7突变株感染，而野生株与B.1.1.7突变株同时感染的病例还未出现，由于感染新型冠状病毒后发病周期较短，隔离和救治及时，导致同时感染野生株与B.1.1.7突变株的几率很小。
目前，针对单一病毒感染，即野生株感染或者B.1.1.7突变株感染的病例的检测，只能确定是否感染了新冠病毒，而不能确定单一病毒感染者是野生株感染，还是B.1.1.7突变株感染，现在针对野生株和B.1.1.7突变株的判定是通过开展基因组测序分析的方式进行，但该法耗时长、对实验操作要求高，无法满足便捷、快速、准确的检测需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，其针对单一病毒感染者检测灵敏度高、特异性好、检测快速、准确。
还提供一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试剂卡，可便于携带，对单一病毒感染者快速、准确的检测。
还提供一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试剂盒，其使用便捷、操作简单，可以快速、准确检测单一病毒感染者SARS-CoV-2野生株与突变株抗原。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线T1、检测线T2和质控线C，所述检测线T1包被SARS-CoV-2抗体1，所述检测线T2包被SARS-CoV-2抗体2，所述质控线C包被羊抗鼠IgG抗体，所述检测线T1检测SARS-CoV-2野生株与突变株抗原，所述检测线T2检测SARS-CoV-2野生株抗原。
通过筛选得到两个包被抗体SARS-CoV-2抗体1和SARS-CoV-2抗体2，其中SARS-CoV-2抗体1对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原均可检测，SARS-CoV-2抗体2可检测SARS-CoV-2野生株抗原，但不与B.1.1.7突变株结合，因而，通过检测线T1和检测线T2的对比进行区分SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株，可以快速、准确检测SARS-CoV-2野生株与突变株抗原。
作为一种优化方案，所述SARS-CoV-2抗体1浓度为1.5~2.0mg/mL；所述SARS-CoV-2抗体2浓度为1.0~1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL。
作为一种优化方案，还包括胶体金结合物垫，胶体金结合物垫制备方法如下：
采用柠檬酸三钠烧制胶体金溶液，将制得的胶体金溶液加热，使烧制出的胶体金溶液体积为原液体体积的一半。
将上述加热后的40nm胶体金溶液调节PH为9.0，加入SARS-CoV-2标记抗体，终浓度为20～30μg /mL，室温静置1h，加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液，室温静置1h，在温度4℃，7000转离心30min获得沉淀物。
取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取复溶后胶体金标记物40～50mL倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，干燥，得胶体金结合物垫。
采用两步法浓缩、标记生物原料，提高产品灵敏度。
作为一种优化方案，还包括样品垫，所述样品垫使用样品垫处理液处理，所述样品垫处理液包括pH为8.5的15mM Tris-HCL、4g PEG20000、5g酪蛋白、2.5mL吐温-20、5gPVP40。
作为一种优化方案，还包括吸水纸和底板，所述底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜，上方粘贴吸水纸，下方粘贴制备的胶体金结合物垫和样品垫。
一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测卡，所述检测卡包括扣合的卡盖和卡体，所述卡盖上具有凹槽，所述凹槽内放置有上述的试纸条。
一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试剂盒，包括样本稀释液和上述的检测卡。
作为一种优化方案，所述样本稀释液包括pH为9.0的15mM Tris、酪蛋白5g、吐 温-20 0.2mL、曲拉通-100 0.2mL、Proclin-300 1mL。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：
1、采用硝酸纤维素膜上包被三条线，一条质控线，两条检测线，通过检测线T1与检测线T2对比的方法进行两者的区分，检测线T1与检测线T2均显色，为SARS-CoV-2野生株阳性，B.1.1.7突变株阴性，检测线T1显色，检测线T2不显色，为SARS-CoV-2野生株阴性，B.1.1.7突变株阳性，实现了对单一病毒感染者SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原快速、准确的检测。
2、采用胶体金结合物垫，采用两步法浓缩、标记生物原料，提高检测的灵敏度。
3、本发明制备的试剂盒操作简单，个人可检测，达到真正的POCT检测，增加检测和诊疗的实效性，对感染者快速分流，阻断传染源，有效防止疫情扩散。
4、本发明制备的试剂盒可同时对单一病毒感染者SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原进行检测，并且能够确定检测的病毒是野生株，还是B.1.1.7突变株，为后续隔离、治疗等方案提供有力的依据。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，包括硝酸纤维素膜、胶体金结合物垫、样品垫、吸水纸和底板，底板为PVC板，底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜，上方粘贴吸水纸，下方粘贴制备的胶体金结合物垫和样品垫，将上述步骤得到的产品压平整后，切成3.0mm宽的试纸条。
所述硝酸纤维素膜上包被有检测线T1、检测线T2和质控线C，所述检测线T1包被SARS-CoV-2抗体1，所述检测线T2包被SARS-CoV-2抗体2，所述质控线C包被羊抗鼠IgG抗体，所述检测线T1可检测SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原，所述检测线T2可检测SARS-CoV-2野生株抗原，所述SARS-CoV-2抗体1浓度为1.5mg/mL；所述SARS-CoV-2抗体2浓度为1.0mg/mL，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL，37℃电热鼓风干燥箱中干燥12h备用。
通过筛选得到两个包被抗体SARS-CoV-2抗体1和SARS-CoV-2抗体2，其中SARS-CoV-2抗体1对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原均可检测，SARS-CoV-2抗体2可检测SARS-CoV-2野生株抗原，但不与B.1.1.7突变株结合，因而，通过检测线T1和检测线T2的对比进行区分SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株，可以快速、准确检测SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原。
胶体金结合物垫制备方法如下：
采用柠檬酸三钠烧制胶体金溶液，将制得的胶体金溶液加热，使烧制出的胶体金溶液体积为原液体体积的一半。
将上述加热后的40nm胶体金溶液调节PH为9.0，加入SARS-CoV-2标记抗体，终浓度为20μg /mL，室温静置1h，加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液，室温静置1h，在温度4℃，7000转离心30min获得沉淀物。
取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取复溶后胶体金标记物40mL倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，干燥，得胶体金结合物垫。
所述样品垫使用样品垫处理液处理，所述样品垫处理液包括pH为8.5的15mMTris-HCL、4g PEG20000、5g酪蛋白、2.5mL吐温-20、5g PVP40。
每张30cm×25cm的样品垫，用50ml样品垫处理液均匀涂布后置于电热鼓风干燥箱中干燥8小时，干燥保存备用。
实施例2：一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，包括硝酸纤维素膜、胶体金结合物垫、样品垫、吸水纸和底板，底板为PVC板，底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜，上方粘贴吸水纸，下方粘贴制备的胶体金结合物垫和样品垫，将上述步骤得到的产品压平整后，切成3.0mm宽的试纸条。
所述硝酸纤维素膜上包被有检测线T1、检测线T2和质控线C，所述检测线T1包被SARS-CoV-2抗体1，所述检测线T2包被SARS-CoV-2抗体2，所述质控线C包被羊抗鼠IgG抗体，所述检测线T1可检测SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原，所述检测线T2可检测SARS-CoV-2野生株抗原，所述SARS-CoV-2抗体1浓度为2.0mg/mL；所述SARS-CoV-2抗体2浓度为1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL，37℃电热鼓风干燥箱中干燥12h备用。
通过筛选得到两个包被抗体SARS-CoV-2抗体1和SARS-CoV-2抗体2，其中SARS-CoV-2抗体1对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原均可检测，SARS-CoV-2抗体2可检测SARS-CoV-2野生株抗原，但不与B.1.1.7突变株结合，因而，通过检测线T1和检测线T2的对比进行区分SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株，可以快速、准确检测SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原。
胶体金结合物垫制备方法如下：
采用柠檬酸三钠烧制胶体金溶液，将制得的胶体金溶液加热，使烧制出的胶体金溶液体积为原液体体积的一半。
将上述加热后的40nm胶体金溶液调节PH为9.0，加入SARS-CoV-2标记抗体，终浓度为30μg /mL，室温静置1h，加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液，室温静置1h，在温度4℃，7000转离心30min获得沉淀物。
取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取复溶后胶体金标记物50mL倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，干燥，得胶体金结合物垫。
所述样品垫使用样品垫处理液处理，所述样品垫处理液包括pH为8.5的15mMTris-HCL、4g PEG20000、5g酪蛋白、2.5mL吐温-20、5g PVP40。
每张30cm×25cm的样品垫，用50ml样品垫处理液均匀涂布后置于电热鼓风干燥箱中干燥8小时，干燥保存备用。
实施例3：一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，包括硝酸纤维素膜、胶体金结合物垫、样品垫、吸水纸和底板，底板为PVC板，底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜，上方粘贴吸水纸，下方粘贴制备的胶体金结合物垫和样品垫，将上述步骤得到的产品压平整后，切成3.0mm宽的试纸条。
所述硝酸纤维素膜上包被有检测线T1、检测线T2和质控线C，所述检测线T1包被SARS-CoV-2抗体1，所述检测线T2包被SARS-CoV-2抗体2，所述质控线C包被羊抗鼠IgG抗体，所述检测线T1可检测SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原，所述检测线T2可检测SARS-CoV-2野生株抗原，所述SARS-CoV-2抗体1浓度为1.8mg/mL；所述SARS-CoV-2抗体2浓度为1.2mg/mL，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL，37℃电热鼓风干燥箱中干燥12h备用。
通过筛选得到两个包被抗体SARS-CoV-2抗体1和SARS-CoV-2抗体2，其中SARS-CoV-2抗体1对SARS-CoV-2野生株与突变株抗原均可检测，SARS-CoV-2抗体2可检测SARS-CoV-2野生株抗原，但不与B.1.1.7突变株结合，因而，通过检测线T1和检测线T2的对比进行区分SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株，可以快速、准确检测SARS-CoV-2野生株与B.1.1.7突变株抗原。
胶体金结合物垫制备方法如下：
采用柠檬酸三钠烧制胶体金溶液，将制得的胶体金溶液加热，使烧制出的胶体金溶液体积为原液体体积的一半。
将上述加热后的40nm胶体金溶液调节PH为9.0，加入SARS-CoV-2标记抗体，终浓度为25μg /mL，室温静置1h，加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液，室温静置1h，在温度4℃，7000转离心30min获得沉淀物。
取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取复溶后胶体金标记物45mL倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，干燥，得胶体金结合物垫。
所述样品垫使用样品垫处理液处理，所述样品垫处理液包括pH为8.5的15mMTris-HCL、4g PEG20000、5g酪蛋白、2.5mL吐温-20、5g PVP40。
每张30cm×25cm的样品垫，用50ml样品垫处理液均匀涂布后置于电热鼓风干燥箱中干燥8小时，干燥保存备用。
实施例4：一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测卡，所述检测卡包括扣合的卡盖和卡体，所述卡盖上具有凹槽，所述凹槽内放置有实施例1-3任一项所述的试纸条。
实施例5：一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试剂盒，包括样本稀释液和实施例4所述的检测卡。
所述样本稀释液包括pH为9.0的15mM Tris、酪蛋白5g、吐 温-20 0.2mL、曲拉通-100 0.2mL、Proclin-300 1mL。
将配制的样本稀释液液装入瓶内，与检测卡分别置于盒体内，得到SARS-CoV-2抗原检测试剂盒。
检测方法如下：
(1)检测
a、将采集口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、唾液样本按照标准操作与稀释液混匀备用。
b、滴加3滴样品液（约100µL）到检测卡的加样孔，15分钟观察结果，20分钟后结果无效。
(2)结果判断
野生株阳性、B.1.1.7突变株阴性：出现三条红线，一条线为质控线C，一条线为检测线T1，另一条线为检测线T2，表明野生株阳性、B.1.1.7突变株为阴性。
野生株阴性、B.1.1.7突变株阳性：出现两条红线，一条线为质控线C，一条线为检测线T1，检测线T2不显色，表明野生株阴性、B.1.1.7突变株阳性。
阴性：只出现质控线C一条红线，检测线T1、检测线T2均不显色，表明野生株、B.1.1.7突变株均为阴性。
无效：质控线C位置无线条出现，说明操作失误或试剂失效，确定操作方法并使用新的试剂重新测试。
灵敏度试验：
将SARS-CoV-2野生株病毒培养物按下表进行稀释，各稀释20份，结果如下表：
病毒浓度(TCID50) 10<sup>3</sup> 10<sup>2</sup> 50
检出情况 100% 100% 95%
本发明试剂盒野生株最低可检出50 TCID50。
将SARS-CoV-2 B.1.1.7突变株抗原按下表进行稀释，各稀释20份，结果如下表：
抗原浓度(ng/mL) 100 10 5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
检出情况 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 95%
本发明试剂盒最低可检出0.1ng/mL。
试剂盒的特异性（抗干扰能力）试验：
临床检验中，检测样本常包含与抗原结构相近或临床症状相似的其他病原体，选取临床确诊副流感病毒（混合）、肺炎衣原体、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎链球菌、流感病毒A型、流感病毒B型阳性样本各10例，用本发明的试剂盒检测，结果均为阴性，证明本试剂盒特异性好，不与副流感病毒（混合）、肺炎衣原体、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎链球菌、流感病毒A型、流感病毒B型产生交叉反应。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，其特征在于：包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线T1、检测线T2和质控线C，所述检测线T1包被SARS-CoV-2抗体1，所述检测线T2包被SARS-CoV-2抗体2，所述质控线C包被羊抗鼠IgG抗体，所述检测线T1检测SARS-CoV-2野生株与突变株抗原，所述检测线T2检测SARS-CoV-2野生株抗原。
2.如权利要求1所述的SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，其特征在于：所述SARS-CoV-2抗体1浓度为1.5~2.0mg/mL；所述SARS-CoV-2抗体2浓度为1.0~1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL。
3.如权利要求1或2所述的SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，其特征在于：还包括胶体金结合物垫，所述胶体金结合物垫制备方法如下：
采用柠檬酸三钠烧制胶体金溶液，将制得的胶体金溶液加热，使烧制出的胶体金溶液体积为原液体体积的一半；
将上述加热后的40nm胶体金溶液调节PH为9.0，加入SARS-CoV-2标记抗体，终浓度为20～30μg /mL，室温静置1h，加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液，室温静置1h，在温度4℃，7000转离心30min获得沉淀物；
取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取复溶后胶体金标记物40～50mL倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，干燥，得胶体金结合物垫。
4. 如权利要求3所述的SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，其特征在于：还包括样品垫，所述样品垫使用样品垫处理液处理，所述样品垫处理液包括pH为8.5的15mMTris-HCL、4g PEG20000、5g酪蛋白、2.5mL吐温-20、5g PVP40。
5.如权利要求4所述的SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试纸条，其特征在于：还包括吸水纸和底板，所述底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜，上方粘贴吸水纸，下方粘贴制备的胶体金结合物垫和样品垫。
6.一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测卡，其特征在于：所述检测卡包括扣合的卡盖和卡体，所述卡盖上具有凹槽，所述凹槽内放置有权利要求1-5任一项权利要求所述的试纸条。
7.一种SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试剂盒，其特征在于：包括样本稀释液和权利要求6所述的检测卡。
8. 如权利要求7所述的SARS-CoV-2野生株与突变株抗原检测试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液包括pH为9.0的15mM Tris、酪蛋白5g、吐 温-20 0.2mL、曲拉通-100 0.2mL、Proclin-300 1mL。
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