CN112501351B - 尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒及其应用，其中包含的引物和探针序列如下：正向引物NiV‑qF:5’‑TCTCCCAGAGTCTATCAGTAAGG‑3’；反向引物NiV‑qR:5’‑CCATACCAGTTTCCTCGACATAG‑3’；探针NiV‑Probe:FAM‑5’‑AGGATCTGCTAAAGGCAGAGCAGT‑3’‑BHQ1。本发明还提供了运用上述试剂的体外荧光PCR检测尼帕病毒的方法，可以快速准确地检测尼帕病毒。本发明建立的尼帕病毒荧光PCR检测方法具有操作简便，高效、快速、特异的优点；该方法的建立，对样本的检测只需2小时左右即可完成，灵敏度可以达到14.8 copies/μL，填补了国内检测尼帕病毒的空白。

Description

尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体的涉及一种以尼帕病毒(Nipah virus,NiV)N基因为靶标建立针对尼帕病毒cDNA的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测试剂盒及其应用。
背景技术
尼帕病毒(Nipah virus,NiV)为有囊膜单股负链RNA病毒，副黏病毒科，亨尼病毒属，具有宿主范围广、致死率高的特点，于1998年首次在马来西亚被发现，尼帕病毒感染是一种***共患的自然疫源性疾病，曾经在新加坡、马来西亚、印度等国家爆发，给养猪业造成了巨大经济损失，世界卫生组织在2018年将尼帕病毒列为对公共卫生造成严重威胁的有限疾病名单。目前全球爆发的尼帕病毒感染来源于同一株病毒株，在传播过程中由于遗传变异进化出：马来西亚株和孟加拉株Niv-Malaysia(Niv-M)NiV-Bangladesh(NiV-BD)。与马来西亚株相比，Niv的孟加拉株引起的器官病理变化更严重，死亡率高于马来西亚株，但只有一个血清型。该病毒安全级别为生物安全四级实验室(BSL-4)病原，一般实验室不具备病毒的分离鉴定条件。尼帕病毒可造成人、猪、马、猫犬等多种动物发生严重神经性脑炎或呼吸***疾病，人感染尼帕病毒后若不能对症治疗，死亡率达到40％-70％。猪感染尼帕病毒后表现为呼吸急促、发展成呼吸困难并伴随非自主性咳嗽。
研究表明，果蝠(Fruit bats)是尼帕病毒的天然宿主，其传播可跨越物种障碍，通过病毒溢出的方式感染人和其他哺乳动物，主要通过食源性途径和中间宿主感染，是引起人和猪尼帕病毒感染的主要媒介生物；此外，猪捡食了果蝠吃剩的带毒果实而导致感染，人接触猪后也感染患病。曾在马来西亚新加坡爆发的尼帕病毒感染，患者与猪有过密切接触，主要是一些在猪场工作的工作人员和屠宰场工人，表明猪是该病毒传播途径中重要的中间宿主，另外将猪场建在果蝠栖息地边缘也可以直接导致病毒传入猪群。就目前来说，尼帕病毒的传播方式有两种：病毒由果蝠等野生动物传给猪，猪再传给人(马来西亚式)；或野生动物通过莫种途径直接传染给人(孟加拉式)。另外有调查指出由于果蝠的活动范围主要集中在不丹、文莱、印度、印度尼西亚、老挝、马达加斯加、缅甸、尼泊尔、菲律宾、巴布亚新几内亚、新加坡、泰国、越南包括中国，这些国家虽然没有发生过尼帕病毒疫情，但发现这些地区的果蝠体内存在尼帕病毒。因此这些国家仍是有极大的感染风险的国家，中国又是养猪大国，因此尼帕病毒的防控至关重要。
根据流行病学、临床症状和病理变化很难确诊。与病猪接触的人多发病，以出现脑炎症状为主，病理变化以血管炎和血管内皮细胞形成合胞体为主，可作为诊断的参考依据。实验室检查可见淋巴细胞减少，血小板减少，低血钠，肝组织中天冬氨酸转氨酶升高。目前采用的诊断方法主要有：(1)病毒的分离培养与鉴定；(2)用特异性抗体和透射电镜检测Nipah病毒；(3)核磁共振是诊断Nipah脑炎敏感而有效的方法；(4)从病料中提取病毒基因组，进行RT-PCR检测；(5)采用免疫组化的方法进行病毒的组织定位；(6)对病毒基因进行限制性核酸序列分析。现如今仍没有针对尼帕病毒的有效预防和治疗措施，为防范尼帕病毒的传播和感染，应建立特异性检测方法进行监测，做到提前预警。而尼帕病毒生物安全等级为四级，需要在P4实验室中进行分离培养，大部分实验室不具备这样的条件，荧光定量PCR无需分离活病毒适用于尼帕病毒等生物安全等级高的病毒检测，不容易发生生物安全事故，且简单、快速、灵敏。目前对尼帕病毒的荧光RT-PCR及多重荧光RT-PCR检测主要为针对M基因的检测，而N基因为编码尼帕病毒核衣壳蛋白基因，具有高度保守性，适用于尼帕病毒的检测。但现有报道针对N基因的检测其检测灵敏度尚不明确，反应体系配制较为复杂，本研究开发的一种针对尼帕病毒N基因cDNA的荧光PCR检测方法，进一步将反应体系优化，只需将包含引物探针的反应预混液加入反应管，再加入1μL的样品核酸cDNA模板，即可进行PCR反应，大大缩短操作时间，减少样品之间交叉污染。本检测方法灵敏度高，可检测到数量级为101copies/uL的样本核酸浓度。总体检测时间(包含核酸提取)可在2h内完成。本荧光PCR方法中的荧光探针相比常规的染料法来说，具有高度特异性，反应结束后无需溶解曲线分析，且不易发生非特异性结合。亦可作为与尼帕病毒相似症状的病原初次筛选鉴定后，对检测结果进行验证和确认的较为简便、准确、灵敏、快速的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用尼帕病毒N基因序列设计合成的尼帕病毒荧光定量PCR检测试剂。
所述试剂包括特异性引物和探针，包括根据尼帕病毒的N(核衣壳蛋白)基因(ID：AJ627196.1)序列，选择无二级结构且高度保守的区段，结合软件设计一对特异的引物及一条探针，通过NCBI上的blast工具进行引物同源性检索，初步筛选特异性引物和探针在774～905bp处，设计2对引物和探针，2对引物退火温度均为55℃左右，GC含量均在47.8％-50％，序列如下：
正向引物1：NiV-qF-1:5’-TCTCCCAGAGTCTATCAGTAAGG-3’(SEQ ID
No.1)
反向引物:1：NiV-qR-1:5’-CCATACCAGTTTCCTCGACATAG-3’(SEQ ID
No.2)
探针1：NiV-Probe-1:FAM-5’-AGGATCTGCTAAAGGCAGAGCAGT-3’-BHQ1(SEQ IDNo.3)；
正向引物2：NiV-qF-2：5’-GCTAAAGGCAGAGCAGTAGAA-3’
反向引物2：NiV-qR-2：5’-CTTGTCTCCAACCCGAATCT-3’
探针：NiV-Probe-2：FAM-5’-AGGATCTGCTAAAGGCAGAGCAGT-3’-BHQ1如图6所示引物1的敏感性高于引物2，筛选后的最佳引物为：
正向引物1：NiV-qF-1:5’-TCTCCCAGAGTCTATCAGTAAGG-3’(SEQ IDNo.1)
反向引物:1：NiV-qR-1:5’-CCATACCAGTTTCCTCGACATAG-3’(SEQ IDNo.2)
探针：NiV-Probe-1:FAM-5’-AGGATCTGCTAAAGGCAGAGCAGT-3’-BHQ1(SEQ IDNo.3)；
进一步的，所述试剂还包括检测所需的阳性质控品、阴性质控品和荧光定量检测试剂；
进一步的，所述引物和探针，浓度均为5～15μM，优选的，浓度为10μM；
进一步的，所述阴性质控品为无菌无病毒无核酸酶双蒸水，阳性质控品为104copies/μL的含有目的片段的质粒。
进一步的，本发明提供运用上述试剂的检测尼帕病毒的方法，可以快速准确地检测尼帕病毒。所述检测包括体内检测和体外检测。体内检测包括但不限于：对血液、消化液、组织等生物样品的检测；体外检测包括但不限于：水样、食品、饲料等生物制品中的质量检测。
所述方法的反应体系为：
2×AceQ U+Probe Master Mix 10μL、上/下游引物(NiV-qF/NiV-qR，10μM)各1.6μL、探针(NiV-Probe，10μM)1μL、模板1μL、ddH2O补足体系至20μL。优化后的qPCR反应条件为：37℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，64℃，30s，40个循环；
所述方法包括以下步骤：
取阴性对照、阳性对照和待测样本各1μL分别置于所述反应体系中进行反应，混匀，置于荧光定量PCR仪中，其中阴性对照采用灭菌双蒸水；利用上述PCR参数进行检测；
结果判断采用以下方式：
在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现扩增曲线，且循环阈值Ct小于或者等于35者含有尼帕病毒，结果为阳性；未出现扩增曲线者，则为没有尼帕病毒，或Ct值大于35者，结果为阴性；如Ct值大于35，但仍有典型扩增曲线且重复性良好，浓缩待测样本后再按照上述反应体系进行反应，并按上述方式判断。
有益效果
本研究建立的针对尼帕病毒cDNA的检测方法，在NCBI上公布的尼帕病毒的全基因序列中，设计一对针对N(核衣壳蛋白)基因序列的引物和探针，该区域保守度高不易发生突变。本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点。
本发明建立的荧光PCR方法标准曲线方程为：Y＝-3.27×X+38.673相关系数R2＝0.996，扩增效率Eff(％)＝102.196，核酸拷贝数的对数与反应的Ct值呈现良好的线性关系，能够扩增最低拷贝数为101的数量级的核酸量，当拷贝数为109-102数量级时，Ct值＜35，是该检测方法的最佳检测浓度范围，当拷贝数为101数量级时，Ct值＞35，但仍有典型扩增曲线且重复性良好。荧光PCR灵敏度高于普通PCR 10倍。引物和探针特异性强，不能扩增出其他常见猪病毒核酸，特别适用于保存时间长，无法进行分离病毒的大批量样品的检测且本方法在生物安全II级实验室可进行。
本发明的方法在不同稀释度的模拟样品能够成功扩增出目标产物，将拷贝数为109数量级的质粒混合血清后10倍梯度稀释，荧光PCR能够检测到10-5稀释度的模拟样品中尼帕病毒。该方法变异系数CV＜2％，说明重复性和稳定性良好。具有准确性高、敏感性强、特异性好的特点，能够满足对未知样品中尼帕病毒的定性及定量检测要求。
说明书附图
图1qPCR标准曲线的建立
图2TaqMan探针qPCR扩增曲线
图3NiV qPCR特异性试验
图4模拟样本中NiV qPCR扩增结果
图5NiV常规PCR扩增结果，其中，M：DL 2000DNAMarker；1～6：100～10-6稀释倍数NiV cDNA模板；7.空白对照
图6尼帕病毒TaqMan特异性引物和探针的敏感性试验，其中A为引物探针组1；B：引物探针组2
具体实施方式
实施例1qPCR反应体系的建立
从GenBank中下载尼帕病毒的N(核衣壳蛋白)基因(ID：AJ627196.1)序列，在774～905bp处设计特异性引物NiV-qF:5’-TCTCCCAGAGTCTATCAGTAAGG-3’(SEQ ID No.1)，NiV-qR:5’-CCATACCAGTTTCCTCGACATAG-3’(SEQ ID No.2)和探针NiV-Probe:FAM-5’-AGGATCTGCTAAAGGCAGAGCAGT-3’-BHQ1(SEQ ID No.3)，目的片段为132bp；合成载体为pUC57的重组质粒，按照分子量计算浓度并换算成copies/μL，将计算好拷贝数的模板10倍梯度稀释以制备标准品。引物和探针及质粒均由上海生工生物工程有限公司合成。
表1：引物和探针序列
按照诺唯赞AceQ U+Probe Master Mix说明书TaqMan qPCR反应体系测试反应：2×AceQ U+Probe Master Mix:10μL，NiV-qF(10μM):0.4μL，NiV-qR(10μM):0.4μL，NiV-Probe(10μM):0.2μL，以104copies/μL质粒为模板1μL，ddH2O补足至20μL。反应条件为37℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，60℃，30s，40个循环。优化qPCR反应的退火温度，设置52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃梯度退火温度。通过调整引物浓度(0.1μM～1μM)和探针浓度(0.1μM～0.5μM)来建立最佳实时荧光定量PCR的反应体系组分比例。
如表2所示，经优化后建立的TaqMan qPCR反应体系为：2×AceQ U+Probe MasterMix 10μL、上/下游引物(NiV-qF/NiV-qR，10μM)各1.6μL、探针(NiV-Probe，10μM)1μL、模板1μL、ddH2O补足体系至20μL。如表3所示，优化后的qPCR反应条件为：37℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，64℃，30s，40个循环。该体系及条件为NiV cDNA最佳检测条件。
表2不同退火温度下的Ct值
表3不同探针和引物浓度下的Ct值
NiV重组质粒总长度为4299bp，检测质粒浓度为7ng/μL；根据公式计算标准品拷贝数为6.02×1023copies/mol×(7ng/μL×10-9)/(4299×660g/mol)＝1.48×109copies/μL。用ddH2O 10倍梯度稀释至1.48×101copies/μL。取1μL稀释好的标准品质粒为模板，按照优化好的qPCR条件进行扩增，标准曲线如图1所示：Y＝-3.27×X+38.673(R2＝0.996)。扩增效率为102％在90％-120％区间内，不同浓度梯度模板量的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，表明该qPCR反应良好的扩增效率。
实施例2qPCR反应体系的敏感性检测
将NiV的质粒按照10倍系列梯度稀释，根据优化后的反应条件进行qPCR试验，检测灵敏度；每个浓度梯度三个重复，以得到的Ct值绘制标准曲线并计算变异系数(CV)评估方法的重复性。NiV重组质粒总长度为4299bp，检测质粒浓度为7ng/μL；根据公式计算标准品拷贝数为6.02×1023copies/mol×(7ng/μL×10-9)/(4299×660g/mol)＝1.48×109copies/μL。用ddH2O 10倍梯度稀释至1.48×101copies/μL。取1μL稀释好的标准品质粒为模板，按照优化好的qPCR条件进行扩增，标准曲线如图1所示：Y＝-3.27×X+38.673(R2＝0.996)。扩增效率为102％在90％-120％区间内，不同浓度梯度模板量的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，表明该qPCR反应良好的扩增效率。
实施例3qPCR反应体系的特异性检测
对常见的传染病原DNA或者cDNA包括：非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻(PED)等进行qPCR检测，以评价方法的特异性。
将不同拷贝数的标准品(1.48×109～1.48×100copies/μL)重复测定3次，将试验结果进行统计分析，测试该方法的重复性。结果如表4所示，变异系数(CV；标准差与平均数的比值)小于2％，说明建立的方法重复性良好，结果稳定。如表4和图2所示，建立的针对N基因的qPCR检测方法可检测到的最低NiV质粒浓度14.8copies/μL。目前有针对M基因的荧光RT-PCR检测最低检测到46copies/μL的浓度(专利号：CN102559935 A)，针对G蛋白基因的本检测荧光RT-PCR检测可检测到29.32copies/μL(专利号：CN 105567870 A)，本检测的敏感性高于现有检测方法，具有实际临床诊断价值。
表4qPCR反应的精确度和重复性Table 4Accuracy and repeatability of qPCRreaction
由图3可知：非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性性腹泻(PED)、无菌水均为阴性，只有NiV出现荧光报告信号，表明该检测方法具有较好的特异性。
实施例4临床检测对比试验
将拷贝数为1.48×109copies/μL的NiV质粒以健康的猪血清10倍梯度稀释，模拟尼帕病毒在猪血液中的状态。取梯度稀释后的病毒200μL，利用TIANamp病毒基因组提取试剂盒提取DNA后取1μL为cDNA模板进行实时荧光定量PCR试验。取200μL倍比稀释的血清提取DNA，分别以普通PCR和qPCR进行检测。如表5所示，qPCR可检测到稀释度为10-5浓度的模拟样本，但此时重复性有所降低，Ct值为37.8大于35，如图4所示仍有明显扩增曲线。常规PCR可以检测到稀释度为10-4的样本，如图5所示，结果表明qPCR检测灵敏度高于常规PCR的10倍。而在专利CN105567870 A中，建立的荧光定量RT-PCR检测方法具有较高敏感性和特异性，但并未提及该方法的重复性和稳定性。由此可见，本发明建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR检测体系，可在2小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地检出尼帕病毒，可用于检测来自生物血液、肌肉及脏器组织样本中微量尼帕病毒，也可以用来判断水样、食品、饲料等生物制品中的污染情况。
表5NiV cDNA为模板敏感性试验Table 5.Sensitivity test using NiV cDNAastemplate
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
〈120〉尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒及其应用
〈130〉
〈160〉3
〈170〉PatentInversion3.3
〈210〉1
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉正向引物NiV-qF
〈400〉1
TCTCCCAGAGTCTATCAGTAAGG
〈210〉2
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉反向引物NiV-qR
〈400〉2
CCATACCAGTTTCCTCGACATAG
〈210〉3
〈211〉24
〈212〉DNA
〈213〉探针NiV-Probe
〈400〉3
FAM-5’- AGGATCTGCTAAAGGCAGAGCAGT-3’-BHQ1
<120> 尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒及其应用
<160> 0
<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims (1)

1.一种非诊断目的的利用荧光定量PCR检测尼帕病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)取阴性对照、阳性对照和待测样本各1μL分别置于反应体系中进行反应，混匀，置于荧光定量PCR仪中，其中阴性对照采用灭菌双蒸水；
2)结果判断：在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现扩增曲线，且循环阈值Ct小于或者等于35者含有尼帕病毒，结果为阳性；未出现扩增曲线者，则为没有尼帕病毒，或Ct值大于35者，结果为阴性；如Ct值大于35，且出现扩增曲线，浓缩待测样本后再按照上述反应体系进行反应，并按上述方式判断；所述的反应体系采用的是尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒；所述方法可检测到的最低NiV质粒浓度14.8copies/μL；
所述试剂盒中包括特异性引物和探针，其序列如下：
正向引物NiV-qF:5’-TCTCCCAGAGTCTATCAGTAAGG-3’(SEQ ID No.1)反向引物NiV-qR:5’-CCATACCAGTTTCCTCGACATAG-3’(SEQ ID No.2)
探针NiV-Probe:FAM-5’-AGGATCTGCTAAAGGCAGAGCAGT-3’-BHQ1(SEQ IDNo.3)；还包括所述试剂盒检测所需的阳性质控品、阴性质控品和荧光定量检测试剂；所述引物和探针浓度均为10μM；所述阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为104copies/μL的阳性质粒；所述试剂盒的反应体系为：2×AceQ U+Probe Master Mix 10μl，10μM的上游引物、下游引物各1.6μl，10μM的探针1μl，ddH2O 4.8μl，模板1μl；所述试剂盒的最优反应条件为：37℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，64℃，30s，40个循环。
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