CN112501317B - 一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的snp标记 - Google Patents

Abstract

一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记，涉及分子辅助选择育种领域。公开其在大黄鱼基因组(BioProject:PRJNA505758)上的物理位置。基于全基因组关联分析，并通过全基因组选择模型优化找到一组(670个)可使模型预测准确性达到最佳的SNP分子标记集合，利用这组SNP标记培育的抗刺激隐核虫子代在攻毒验证中，表现出良好的抗虫性能。提供的与大黄鱼抗刺激隐核虫相关的分子标记，可快速将其应用到育种产业中，短时间之内就可培育高抗性的后代，减少了刺激隐核虫对大黄鱼养殖产业造成的经济损失，具有广阔的应用前景和商业价值。

Description

一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记

技术领域

本发明涉及分子辅助选择育种领域，尤其是涉及利用一组与大黄鱼抗刺激隐核虫相关联的SNP分子标记进行大黄鱼抗虫育种领域。

背景技术

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)，隶属于鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaenidae)，黄鱼属(Larimichthys)，分布于太平洋西南海域，是中国重要的海水养殖经济鱼类物种，也是年单产量最高的海水养殖品种，为福建等东南沿海地区带来了巨大的经济效益。近些年来，由于大黄鱼养殖产业的快速发展，养殖密度的提升以及大量残饵等因素，造成了沿海内湾水环境恶化，并随之带来了诸多病害。在所有病害中，尤其白点病危害最大，导致白点病的病原微生物属于一种单细胞海水纤毛虫，刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)。刺激隐核虫寄生于鱼体表、鳃和眼等处，会造成呼吸困难，导致宿主大量死亡；滋养体脱落后会造成皮肤损伤，导致细菌真菌等的二次感染，也是造成宿主大量死亡的原因。白点病给大黄鱼养殖产业造成了巨大的经济损失，据统计年损失上亿元。至今，仍没有防治措施可以有效的、经济的、环境友好的应用到养殖产业中，而通过遗传选育提升大黄鱼刺激隐核虫抗性具有极大的应用前景，可以从根本上减少刺激隐核虫对大黄鱼养殖产业造成的经济损失。

遗传育种有一个漫长的发展史，随着现代生物技术的发展，育种技术也在进行深刻的变革，不断创新，在几代之内就可获得高的遗传增益。随着单核苷酸多态性标记(SNP)的发现和广泛使用，育种技术也随之进行了一场革命，发展成为分子辅助选择育种(MAS)，以及随着计算机处理大数据能力的突飞猛进，可以使用覆盖于整个基因组的SNP标记进行育种的全基因组选择技术(GS)。利用分子信息进行辅助育种，已经在植物和家畜的抗病遗传育种领域得到了广泛的应用，但是在水产动物抗病育种中，还鲜有成功应用的案例，本发明聚焦大黄鱼抗刺激隐核虫遗传改良，将SNP分子标记信息应用到大黄鱼抗刺激隐核虫选育中，形成一种简单，且能快速应用的选育流程，实现了理论成果向实践应用转化。本发明提供的SNP标记集合，在大黄鱼抗刺激隐核虫育种产业中具有极其重要的商业价值，应用流程可进行大范围示范推广。

发明内容

本发明的目的是提供一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记，并将其应用到大黄鱼抗刺激隐核虫育种产业。

为了实现本发明目的，本发明提供的用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的670个SNP标记信息如表1所示，其获得的详细步骤如下：

1)进行大规模的大黄鱼刺激隐核虫攻毒实验，选取攻毒实验死亡样本以及存活样本，进行基因组DNA提取(酚氯仿法)，并使用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA的质量；

2)对上述样本进行简化基因组测序，使用软件GATK或stacks2进行分型，并使用plink，beagle，haploview等软件对原始分型结果进行质控过滤，以及缺失基因型填补等得到最终的分型结果；

3)使用二分类表型记录，结合基因型结果，利用R语言gaston包进行全基因组关联分析(GWAS)，并对所有的标记进行按照显著性从大到小(P值由小到大)排名；

4)使用全基因组模型(GS)，结合5折交叉验证判断最佳标记组合，具体步骤为，按照上述的排名，以10个SNP数量为间隔，逐渐增加排在前面的标记，并计算每个标记密度下，GS模型的预测准确性。预测准确性最高时对应的标记组合，即是最佳的标记集合。

表1

注：①英文表头的具体含义，CHR(chromosome)代表染色体编号；SNP代表单核苷酸多态性标记编号；BP代表SNP标记在染色体上的物理位置；A1代表SNP标记的第一个等位基因；A2代表SNP标记的第二个等位基因；P代表在全基因组关联分析中SNP标记的显著值；OR代表二分类性状中，等位基因A1在存活个体中的基因频率与在死亡个体中的基因频率比值。

②25号染色体不是真正的染色染，而是未组装在24条染色体中的contigs和scaffolds片段结合。

所述670个SNP标记与大黄鱼抗刺激隐核虫表型性状具有关联性。

根据上述SNP标记信息，计算候选亲本的多基因风险评分(prs,polygenic riskscore)，根据上述评分，以一定选择强度从候选亲本挑选prs较小的进行繁殖，后代即具有较高的刺激隐核虫抗性。

所述670个SNP标记在大黄鱼抗刺激隐核虫育种产业中的应用，所述应用包括以下步骤：

1)候选亲本的基因组DNA提取，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量；

在步骤1)中，所述候选亲本的基因组DNA提取可以采取酚氯仿法、试剂盒等任何DNA提取方法。

2)对670个SNP标记进行基因分型；

在步骤2)中，所述对670个SNP标记进行基因分型可以采取任何形式的测序技术，所述测序技术包括简化基因组测序、全基因组重测序、基因芯片、多重PCR等中的一种。

3)根据步骤2)的SNP标记分型结果(至少要保证所述670个分子标记中有300个以上分型成功)，结合670个SNP标记信息，使用开源软件PRSice-2软件计算候选亲本的prs；

4)以一定的选择强度选取候选亲本prs值排在前面的个体(prs值从小到大排序)作为亲鱼；

5)对步骤4)选择的亲鱼进行繁殖，后代即为具有对刺激隐核虫高抗性的个体，可以对这些高抗性后代进行刺激隐核虫攻毒验证。

利用本发明提供的670个分子标记信息，可快速将其应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种产业中，一代就可获得可观的遗传增益。借由上述提供的标记信息和应用流程，本发明至少具有下列优点及有益效果：

1)本发明首次利用全基因组关联分析，获得了一组与大黄鱼刺激隐核虫表型性状相关的SNP标记。

2)利用本发明提供的670个标记信息，可快速将其应用于挑选具有潜在刺激隐核虫强抗性的候选亲本。

3)利用本发明培育大黄鱼抗刺激隐核虫新品系，是一种高效便捷的选择育种方法，可在一代之内快速增加遗传增益，也为其它水产动物的抗病育种提供参考案例，加速抗病育种商业化进程。

附图说明

图1为本发明在实施例1中步骤3)中GWAS结果的曼哈顿图。

图2为本发明在实施例1中步骤4)中确定最佳SNP集合的结果图。在图2中，横坐标表示按照显著性P值排序后的标记数量，图中上方的图中纵坐标代表模型拟合度(Goodnessof Fit)，下方的图中纵坐标表示模型预测准确性(predictability)。结果表明，前670个标记下，模型的5折交叉验证的预测准确性达到最高。

图3为本发明在实施例2中培育的大黄鱼抗虫新品系的攻毒验证实验结果图。结果表明，抗虫新品系与两个对照组相比，具有统计学上显著高的抗虫性能。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1确定本发明提供的670个SNP集合

1)6月份进行了大规模的大黄鱼刺激隐核虫攻毒实验，实验鱼规格为6月龄(体重：6.80±2.52g，体长：7.8±1.1cm)，选取240尾攻毒实验死亡样本以及240尾存活样本，进行基因组DNA提取(酚氯仿法)。

2)对上述样本进行简化基因组测序，使用ddRAD建库策略，使用bwa,samtools进行原始reads的大黄鱼基因组比对；使用stacks2进行基因分型；使用plink对原始分型结果进行质控，质控参数为，最小等位基因频率大于0.05，单个SNP位点检出率大于0.9，单个个体所有SNP位点检出率大于0.9；使用beagle软件对缺失基因型进行填补；使用haploview软件寻找tag SNP(可以代表一定基因组区域的SNP)，以此降低SNP位点间的相关性，并降低后续GS模型的多重共线性。最终得到12385个高质量的SNP标记。

3)使用二分类表型记录，结合基因型结果，利用R语言gaston包进行全基因组关联分析(GWAS)，并对所有的标记进行按照显著性从大到小(P值由小到大)排名，图1即为GWAS结果的曼哈顿图展示。

4)利用R语言BGLR包建立全基因组模型(GS)，结合5折交叉验证判断最佳标记组合，具体步骤为，按照上述的排名，以10个SNP数量为间隔，逐渐增加排在前面的标记，并计算每个标记密度下，GS模型的预测准确性。由图2可知，预测准确性最高时对应的标记组合为P值排名前670个SNP标记，这些标记即是本发明最终提供的670个SNP标记组合。

实施例2利用提供的SNP标记信息，应用到大黄鱼抗虫育种中

1)第二年12月份于福建宁德三都澳网箱养殖区挑选挑选约500尾2龄健壮大黄鱼作为候选亲本群体，剪取其鳍条，打入电子标记。对候选亲本的基因组DNA进行提取，采取酚氯仿法。

2)对候选亲本进行ddRAD建库，并进行基因分型，与实施例1步骤2)所述步骤相同。使用plink软件产生具有所述670个分子标记的基因型文件。

3)根据步骤2)的候选亲本SNP标记分型结果，结合所述的670个SNP标记信息，使用开源软件PRSice-2软件计算候选亲本的prs，Linux***下计算代码如下：

Train.BASE文件是本发明提供的670个标记信息，共6列，每列依次分别代表染色体编号，SNP编号，SNP的物理位置，等位基因1，等位基因2，GWAS结果得到的P值，以及二分类性状特有的OR值。target是候选亲本基因型文件的前缀，需包含plink软件格式下的三个文件，target.ped，target.fam，target.bim。程序运行结束后，会生成一个后缀名为prs.best的文件，此文件即包含候选亲本的估计prs值。

4)将候选亲本prs值由小到大排序，从491尾分型成功的候选亲本里选择47尾排在前面的个体作为抗性后代的亲本，如此选择强度大约为0.1。47尾选择的亲本雌雄比例大约为2︰1。

5)对上述经过选择的亲本进行繁殖，后代即为具有对刺激隐核虫高抗性的个体，即为抗虫系，剩余的候选亲本同样进行繁殖，其后代作为对照组1，而同时期培育的商品苗种作为对照组2。

6)第三年6月中旬，对抗虫系，对照组1和对照组2进行刺激隐核虫感染实验，使用R语言survival包进行生存分析，结果表明抗虫系与两个对照组相比，具有统计学上显著的高的抗虫性能，结果见图3。通过以上攻毒验证实验结果，进一步说明本发明提供的670个SNP标记的有效性，以及短期内快速提高大黄鱼抗刺激隐核虫性能的使用性和可操作性。

本发明首次公开了其在大黄鱼基因组(BioProject:PRJNA505758)上的物理位置。本发明基于全基因组关联分析，并通过全基因组选择模型优化找到一组(670个)可使模型预测准确性达到最佳的SNP分子标记集合，利用这组SNP标记培育的抗刺激隐核虫子代在攻毒验证中，表现出良好的抗虫性能。本发明提供的与大黄鱼抗刺激隐核虫相关的分子标记，可快速将其应用到育种产业中，短时间之内就可培育高抗性的后代，减少了刺激隐核虫对大黄鱼养殖产业造成的经济损失，具有广阔的应用前景和商业价值。

Claims (5)

1.一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记，用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的670个SNP标记信息如表1所示；所述670个SNP标记与大黄鱼抗刺激隐核虫表型性状具有关联性；

所述670个SNP标记用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种，包括以下步骤：

1)候选亲本的基因组DNA提取，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量；

2)对670个SNP标记进行基因分型；

3)根据步骤2)的SNP标记分型结果，结合670个SNP标记信息，使用开源软件PRSice-2软件计算候选亲本的prs；

4)以一定的选择强度选取候选亲本prs值排在前面的个体作为亲鱼；

5)对步骤4)选择的亲鱼进行繁殖，后代为具有对刺激隐核虫高抗性的个体，对高抗性后代进行刺激隐核虫攻毒验证。

2.如权利要求1所述一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记，其特征在于所述670个SNP标记在大黄鱼抗刺激隐核虫育种产业中的应用。

3.如权利要求1所述一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记，其特征在于在步骤1)中，所述候选亲本的基因组DNA提取采取酚氯仿法、试剂盒任何DNA提取方法。

4.如权利要求1所述一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记，其特征在于在步骤2)中，所述对670个SNP标记进行基因分型采取任何形式的测序技术，所述测序技术包括简化基因组测序、全基因组重测序、基因芯片、多重PCR中的一种。

5.如权利要求1所述一组可应用于大黄鱼抗刺激隐核虫育种的SNP标记，其特征在于在步骤3)中，所述SNP标记分型结果至少要保证所述670个分子标记中有300个以上分型成功。

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