CN112501180B

CN112501180B - 调控稻米镉积累的基因OsABCG42及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN112501180B
Application number: CN202011328830.9A
Authority: CN
Inventors: 唐丽; 赵炳然; 孙远涛; 李曜魁; 吕启明; 胡远艺; 董家瑜
Original assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Current assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN112501180A

Abstract

本发明公开了一种调控稻米镉积累的基因OsABCG42及其编码蛋白和应用，基因OsABCG42的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过基因编辑、EMS诱变、辐射诱变、航天搭载等诱变技术，突变基因OsABCG42，改良现有水稻的镉积累特性。结合分子标记辅助选择，还可实现多基因聚合创制稻米镉含量低的水稻品种，操作简单，改良和培育新品种的周期短，且不影响主要农艺性状。

Description

调控稻米镉积累的基因OsABCG42及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程技术领域，尤其涉及调控稻米镉积累的基因OsABCG42及其编码蛋白与应用。

背景技术

水稻作为我国最主要粮食作物之一，超过一半的人口以大米为主食。近些年来，由耕地镉污染导致的稻米镉超标问题已引起社会的广泛关注。2014年全国土壤污染状况调查公报显示，我国耕地点位镉(Cd)污染超标率达到7％。在我国南方地区，稻米镉超标率达到23％，水稻安全生产受到严重威胁。在稻米中富集的镉可通过食物链进入人体内，危害人体健康。调控和降低稻米镉含量问题急需解决。

针对目前稻田镉污染日趋严重的现状，研究人员开展了大量水稻镉低积累品种筛选的研究。稻米镉积累涉及镉吸收、转运、分配等多个生理过程和诸多转运蛋白。已鉴定的镉转运蛋白多数也是锰、锌、铁、钙等其他金属的主效转运蛋白，因此其基因突变虽然降低了镉含量，但往往因为破坏了水稻体内的矿质元素平衡，使得生长发育受阻。改良水稻镉高积累特性、培育镉低积累水稻品种期待更多不影响农艺性状的基因资源和分子育种途径。

ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)家族是现阶段已知最大、最古老的蛋白质家族之一，包括ABCB、ABCC和ABCG等8个亚家族，能转运金属、糖类、核苷酸、蛋白质、激素等多种底物。OsABCG43在酵母中异源表达可以增加酵母的镉耐受性；OsABCG36在水稻根中受到镉诱导表达，通过将根细胞的镉外排到质外体，增强植株的镉耐受性。但其他ABC转运蛋白参与水稻镉调控的报道相对较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，面对急需解决的镉稻米问题，寻找能降低稻米镉含量的功能基因，并提供其分子育种途径，具有重要的理论价值及实际意义。为此，本发明提供了一种调控稻米镉积累的基因OsABCG42及编码蛋白和应用。利用本发明，可将OsABCG42基因应用于水稻镉积累性状的遗传改良和镉低积累水稻品种的培育。

为了实现上述目的，本发明提供了一种调控稻米镉积累的基因OsABCG42，所述基因OsABCG42的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述基因OsABCG42的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且其所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于一个总的技术构思，本发明提供了一种上述基因OsABCG42的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于一个总的技术构思，本发明提供了一种上述的基因OsABCG42或如上述的编码蛋白在改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用。

上述的应用，进一步的，通过突变所述基因OsABCG42使其编码蛋白的活性下调或失活，或抑制所述基因OsABCG42表达使其编码蛋白的丰度下调，进而改良水稻的镉积累特性或培育出稻米镉含量下降的镉低积累水稻品种。

上述的应用，更优选的，突变所述基因OsABCG42或抑制所述基因OsABCG42表达所采用的方式包括基因编辑、EMS诱变、辐射诱变、航天搭载。

上述的应用，更优选的，所述基因编辑为：利用CRISPR/Cas9、TALEN敲除所述基因OsABCG42，或利用CRISPR/Cas9、TALEN编辑其启动子以抑制其表达。

上述的应用，更优选的，所述利用CRISPR/Cas9法敲除所述基因OsABCG42的具体方法为：

S1、根据基因OsABCG42的外显子序列选择靶序列，构建含有所述靶序列的CRISPR/Cas9重组载体；

S2、将所述CRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因阳性植株；

S3、将所述阳性植株进行繁种，于后代植株中分离出不含转基因成分的OsABCG42功能缺失突变体，即可得到镉含量降低的水稻品系。

上述的应用，更优选的，所述靶序列包括：如SEQ ID NO：3所示的DNA序列和如SEQID NO：4所示的DNA序列。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明提供了一种调控稻米镉积累的基因OsABCG42。酵母异源表达鉴定发现，与转空载体的酵母对照相比，表达基因OsABCG42的酵母对Cd胁迫更敏感。其在水稻中敲除OsABCG42发现，苗期水培条件下植株地上部分和根系的镉含量均显著下降；镉污染大田实验发现，敲除OsABCG42使水稻糙米的镉含量显著下降，且对主要农艺性状无显著影响。

2、本发明提供了一种调控稻米镉积累的基因OsABCG42改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用，通过基因编辑、EMS诱变、辐射诱变、航天搭载等诱变技术，均可实现OsABCG42突变，改良现有水稻的镉积累特性。结合分子标记辅助选择，还可实现多基因聚合创制稻米镉含量低的水稻品种，操作简单，改良和培育新品种的周期短，且不影响主要农艺性状，为镉低积累水稻育种提供了基因资源和技术支持。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例2中基因OsABCG42的结构和敲除株系osabcg42-1、osabcg42-2的突变位点测序结果。

图2为本发明实施例3中苗期水培条件下，敲除株系osabcg42-1、osabcg42-2和野生型华占地上部分(a)和根系(b)的镉含量检测结果(其中**表示与野生型相比，0.01水平上差异显著；*表示与野生型相比，0.05水平上差异显著)。

图3为本发明实施例3中敲除株系osabcg42-1、osabcg42-2和野生型华占的糙米镉含量检测结果(其中**表示与野生型相比，0.01水平上差异显著；*表示与野生型相比，0.05水平上差异显著)。

图4为本发明实施例4中OsABCG42酵母转化子的镉胁迫敏感性鉴定结果。

图5为本发明实施例4中，在含0μM、5μM镉的液体培养基中，pYES2-OsABCG42酵母转化子和野生型对照pYES2酵母转化子的时间生长曲线。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

一种本发明的调控稻米镉积累的基因OsABCG42，其编码区核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，具体为：

ATGATACTGGGATTGGATATATGCGCGGACACGATCGTCGGCGACCAGATGCAGAGGGGGATCTCCGGTGGTCAGAAGAAACGCGTCACCACCGGTGAGATGATTGTCGGTCCAACAAAGGTTCTATTCATGGATGAGATATCAACTGGATTGGACAGCTCCACCACATTCCAGATTGTCAAATGCCTTCAGCAAATCGTGCACTTGGGCGAGGCAACCATCCTCATGTCACTCCTACAACCAGCCCCTGAGACTTTTGAGCTATTCGATGACATTATCCTACTGTCAGAAGGCCAGATTGTTTATCAGGGACCCCGCGAATACGTCCTTGAGTTCTTTGAGTCATGCGGATTCCGCTGCCCAGAGCGTAAGGGTACTGCAGACTTTCTTCAGGAGGTGACATCAAAGAAGGATCAGGAGCAGTATTGGGCCGACAAGCATAGGCCATACAGATACATTTCAGTCTCAGAATTTGCACAGAGATTTAAAAGGTTCCATGTTGGGCTCCAACTTGAGAATCATCTCTCAGTCCCATTTGATAAAACTCGTAGCCATCAGGCTGCTCTTGTCTTCTCGAAGCAATCGGTGTCAACAACAGAGCTCCTCAAGGCATCCTTTGCCAAGGAGTGGCTCCTCATTAAGCGCAACTCATTTGTGTACATCTTCAAGACCATACAGCTCATCATTGTAGCCCTTGTCGCGTCGACAGTGTTTCTTAGGACCCAGATGCACACAAGGAATTTAGATGATGGCTTTGTGTACATTGGAGCACTACTTTTCAGTCTGATTGTGAACATGTTCAATGGTTTCGCTGAGCTCTCTTTGACCATCACAAGGTTGCCAGTGTTCTTCAAGCACCGGGACCTCCTCTTCTACCCTGCTTGGATCTTCACTCTACCGAATGTTATTCTGAGAATCCCATTTTCCATCATCGAATCTATAGTCTGGGTGATTGTTACATACTACACTATAGGATTTGCCCCAGAGGCTGACAGATTTTTCAAGCAGTTGCTGCTAGTGTTCTTGATCCAGCAGATGGCAGGTGGCCTTTTCAGAGCAACTGCTGGTCTGTGCAGATCCATGATCATTGCTCAAACTGGAGGAGCCCTGGCCCTTCTCATATTTTTCGTTCTTGGAGGATTTCTTCTGCCAAAAGCATTCATCCCAAAATGGTGGATCTGGGGTTACTGGGTTTCACCACTGATGTACGGGTATAATGCTCTAGCAGTCAATGAATTCTACTCTCCTCGGTGGATGAACAAGTTTGTACTGGATAACAATGGCGTTCCTAAAAGACTAGGAATAGCTCTGATGGAAGGTGCCAACATCTTCACTGACAAAAATTGGTTCTGGATTGGAGCAGCAGGGCTCCTGGGTTTCACCATGTTTTTCAATGTGCTTTTCACTCTGTCACTCGTTTATCTGAATCCTCTGGGCAAACCACAAGCTGTCATATCTGAAGAAACTGCGAAGGAAGCGGAAGGCAATGGGGATGCAAGACATACAGTAAGAAATGGCAGCACAAAATCAAATGGTGGAAATCACAAAGAAATGAGGGAGATGAGATTGAGTGCTCGTCTGAGCAATAGTTCATCGAATGGAGTTTCACGACTGATGTCCATTGGTAGCAATGAAGCTGGTCCAAGAAGAGGAATGGTTCTTCCATTTACTCCTCTATCCATGTCTTTTGATGATGTGAACTACTATGTCGACATGCCTGCAGAAATGAAGCAGCAAGGAGTGGTGGATGATAGGCTCCAATTGTTACGTGACGTTACTGGATCATTTAGGCCTGCAGTGCTGACAGCACTCATGGGAGTCAGTGGAGCCGGAAAGACAACTCTTATGGATGTTTTGGCAGGAAGAAAGACTGGTGGTTACATTGAAGGAGATATGAGAATTTCTGGTTATCCTAAGAACCAAGAAACATTTGCAAGAATTTCTGGCTACTGTGAGCAAAACGATATCCATTCACCTCAGGTCACAGTTAGGGAGTCTTTGATATACTCTGCTTTCCTGCGCCTTCCAGAAAAAATAGGAGATCAAGAAATCACTGATGATATCAAGATTCAATTTGTTGATGAAGTTATGGAACTAGTGGAGCTCGACAATCTGAAGGATGCGTTAGTTGGCCTGCCTGGAATCACAGGGCTTTCAACAGAGCAAAGGAAGAGATTGACAATAGCAGTGGAGCTTGTTGCAAATCCCTCGATCATCTTCATGGATGAACCGACTTCAGGTCTTGATGCAAGAGCAGCAGCCATTGTTATGAGAACAGTGAGGAACACAGTTGACACTGGACGGACAGTGGTTTGCACAATTCACCAGCCAAGCATTGACATATTTGAGGCTTTTGATGAGCTGCTACTACTGAAAAGAGGAGGGCAGGTGATATACTCTGGGCAATTGGGTCGTAATTCCCAGAAAATGATTGAATATTTCGAGGCAATTCCTGGTGTGCCTAAAATCAAAGATAAGTACAATCCAGCTACATGGATGCTTGAGGTCAGTTCAGTTGCTGCGGAAGTACGCTTAAATATGGACTTTGCTGAGTACTATAAGACATCAGACCTGTACAAGCAAAACAAGGTATTGGTGAATCAGCTAAGTCAACCAGAGCCAGGAACATCAGATCTGCATTTTCCTACAAAATACTCTCAATCCACCATAGGGCAATTTAGGGCCTGCCTCTGGAAGCAATGGCTGACCTATTGGCGCAGCCCAGATTACAATCTTGTTAGATTTTCCTTCACTCTGTTCACAGCCTTGCTACTCGGCACCATCTTTTGGAAGATCGGCACCAAGATGGGAAATGCCAATTCTCTTAGAATGGTCATTGGAGCAATGTATACAGCAGTGATGTTTATCGGTATCAACAATTGTGCGACTGTGCAGCCAATCGTGTCGATTGAGAGAACAGTTTTCTACCGAGAGAGGGCTGCTGGGATGTACTCTGCTATGCCCTATGCCATTGCTCAGGTTGTCATGGAGATACCCTATGTGTTCGTCCAAACTGCATATTATACCCTCATTGTTTATGCCATGATGAGCTTCCAGTGGACAGCAGCCAAGTTCTTCTGGTTCTTCTTCGTCTCCTACTTCTCATTTCTCTACTTCACCTACTATGGTATGATGACGGTGGCAATCTCACCAAACCATGAGGTTGCAGCCATCTTTGCCGCGGCGTTCTATTCCTTGTTCAACCTATTCTCAGGATTCTTCATTCCGAGACCAAGGATTCCCAAATGGTGGATCTGGTACTACTGGCTTTGCCCATTGGCATGGACAGTGTATGGGCTCATAGTGACACAGTATGGAGACCTAGAACAAATCATCTCAGTCCCTGGCCAATCCAACCAGACAATCAGCTACTATGTTACTCATCATTTTGGATATCACAGGAAATTTATGCCAGTTGTTGCGCCGGTGCTCGTGCTCTTCGCTGTGTTTTTCGCGTTCATGTATGCCATTTGCATCAAGAAGTTGAACTTCCAACATCGATAG。

由其编码的水稻转运蛋白OsABCG42，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：

MILGLDICADTIVGDQMQRGISGGQKKRVTTGEMIVGPTKVLFMDEISTGLDSSTTFQIVKCLQQIVHLGEATILMSLLQPAPETFELFDDIILLSEGQIVYQGPREYVLEFFESCGFRCPERKGTADFLQEVTSKKDQEQYWADKHRPYRYISVSEFAQRFKRFHVGLQLENHLSVPFDKTRSHQAALVFSKQSVSTTELLKASFAKEWLLIKRNSFVYIFKTIQLIIVALVASTVFLRTQMHTRNLDDGFVYIGALLFSLIVNMFNGFAELSLTITRLPVFFKHRDLLFYPAWIFTLPNVILRIPFSIIESIVWVIVTYYTIGFAPEADRFFKQLLLVFLIQQMAGGLFRATAGLCRSMIIAQTGGALALLIFFVLGGFLLPKAFIPKWWIWGYWVSPLMYGYNALAVNEFYSPRWMNKFVLDNNGVPKRLGIALMEGANIFTDKNWFWIGAAGLLGFTMFFNVLFTLSLVYLNPLGKPQAVISEETAKEAEGNGDARHTVRNGSTKSNGGNHKEMREMRLSARLSNSSSNGVSRLMSIGSNEAGPRRGMVLPFTPLSMSFDDVNYYVDMPAEMKQQGVVDDRLQLLRDVTGSFRPAVLTALMGVSGAGKTTLMDVLAGRKTGGYIEGDMRISGYPKNQETFARISGYCEQNDIHSPQVTVRESLIYSAFLRLPEKIGDQEITDDIKIQFVDEVMELVELDNLKDALVGLPGITGLSTEQRKRLTIAVELVANPSIIFMDEPTSGLDARAAAIVMRTVRNTVDTGRTVVCTIHQPSIDIFEAFDELLLLKRGGQVIYSGQLGRNSQKMIEYFEAIPGVPKIKDKYNPATWMLEVSSVAAEVRLNMDFAEYYKTSDLYKQNKVLVNQLSQPEPGTSDLHFPTKYSQSTIGQFRACLWKQWLTYWRSPDYNLVRFSFTLFTALLLGTIFWKIGTKMGNANSLRMVIGAMYTAVMFIGINNCATVQPIVSIERTVFYRERAAGMYSAMPYAIAQVVMEIPYVFVQTAYYTLIVYAMMSFQWTAAKFFWFFFVSYFSFLYFTYYGMMTVAISPNHEVAAIFAAAFYSLFNLFSGFFIPRPRIPKWWIWYYWLCPLAWTVYGLIVTQYGDLEQIISVPGQSNQTISYYVTHHFGYHRKFMPVVAPVLVLFAVFFAFMYAICIKKLNFQHR。

本实施例中，与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性，且其所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因，可以达到与实施例1相同的结果。

实施例2：OsABCG42敲除株系的获得和分子鉴定

一种本发明的抑制基因OsABCG42表达的方法，具体为：通过CRISPR/Cas9编辑OsABCG42基因的CDS，使OsABCG42发生无义突变。具体实施方法如下：

(1)根据CRISPR/Cas9载体***靶位点的选择原则，在OsABCG42第三外显子选取两段20bp序列作为靶序列，用于产生sgRNA。

第一条靶序列位于OsABCG42基因编码区起始密码子ATG下游189-208bp的反义链，序列为CCAAGTGCACGATTTGCTGA(如SEQ ID NO：3所示)；

第二条靶序列位于OsABCG42基因编码区起始密码子ATG下游317–336bp的反义链，序列为GAACTCAAGGACGTATTCGC(如SEQ ID NO：4所示)。

根据以上两条靶序列，分别设计接头引物如下：

42P1U3-F：ggcaccaagtgcacgatttgctga(如SEQ ID NO：5所示)；

42P1U3-R：aaactcagcaaatcgtgcacttgg(如SEQ ID NO：6所示)；

42P2U6-F：gccgaactcaaggacgtattcgc(如SEQ ID NO：7所示)；

42P2U6-R：aaacgcgaatacgtccttgagtt(如SEQ ID NO：8所示)。

合成以上接头引物，并分别溶解成100μM的母液，各取1μL，其中42P1U3-F与42P1U3-R混合得到42P1U3混合液，42P2U6-F与42P2U6-R混合得到42P2U6混合液，将42P1U3混合液、42P2U6混合液均稀释到1μM，置于PCR上98℃30S，移至室温冷却，完成退火，形成的两个靶位点的接头。

参考文献Ma XL,Zhang QY,Zhu QL,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang ZF,LiHY,Lin YR,Xie YY,Shen RX,Chen SF,Wang Z,Chen YL,Guo JX,Chen LT,Zhao XC,DongZC,Liu YG.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants.Mol Plant,2015,8(8):1274–1284.构建OsABCG42基因的CRISPR/Cas9重组载体pCRISPR/Cas9-OsABCG42。

(2)将pCRISPR/Cas9-OsABCG42重组载体导入感受态农杆菌种EHA105，委托湖北武汉伯远生物科技有限公司完成水稻遗传转化工作。

简述如下：选取成熟饱满的籼稻品种华占种子，脱壳后，次氯酸钠消毒滤干，接种到诱导培养基上诱导愈伤组织；将含有pCRISPR/Cas9-OsABCG42重组载体的农杆菌EHA105菌液浸染华占愈伤组织，再转到共培养基上24℃暗培养3天，清洗愈伤组织，转到含潮霉素的选择培养基上进行筛选培养30天；经选择后的抗性愈伤组织转到预分化培养基7-10天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至2-4cm时转至生根培养基生长3周左右；得到7株T₀代小苗炼苗3天后移栽至土中，收到种子再种植繁殖一代，获得T₁代植株。

(3)对T₁代植株进行靶位点基因型检测，以鉴定突变植株，简述如下：

CTAB法提取T₁代植株的DNA，针对OsABCG42的靶序列，设计引物用于扩增含靶序列的DNA片段，扩增引物为：

ABCG42-CAS9-F：GCACGTTTCCACTCCCGATA(如SEQ ID NO：9所示)；

ABCG42-CAS9-R：TGCCTTGAGGAGCTCTGTTG(如SEQ ID NO：10所示)。

用高保真酶PCR扩增含靶位点的DNA片段：反应体系为：0.5μL DNA模板，1μLABCG42-CAS9-F，1μL ABCG42-CAS9-R，4μL dNTP，15μL 2xbuffer，0.5μL KOD酶，加ddH₂O至总体积为30μL。

反应程序：95℃预变性3min，30个循环：98℃变性10s，58℃退火30s，6℃延伸60s。

将PCR产物电泳，测序。筛选测序结果在靶位点处为单峰的单株，直接与野生型序列比对，分析靶位点基因型。在T₁代植株中筛选靶位点发生突变，导致无义突变的纯合敲除株系，并用PCR方法检测Hpt、Cas9等转基因元件，进一步筛选不含转基因元件的敲除株系如osabcg42-1、osabcg42-2，突变序列见图1。

实施例3：OsABCG42基因敲除株系的元素含量和主要农艺性状

检测OsABCG42敲除株系地上部分和根系的Cd含量：将OsABCG42敲除株系osabcg42-1、osabcg42-2和野生型对照华占经浸种、催芽后，播种于剪去底部的96孔PCR板，营养液培养14天，分别用0.2、0.5μM CdCl₂处理10天，用自来水、去离子水冲洗3遍，将地上部分和根系分开，80℃烘至恒重，粉碎、称量，用HNO₃-HClO₄混合液消煮，用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MAS)测定地上部分和根系的Cd含量。

结果如图2所示，从图中可知：敲除株系osabcg42-1、osabcg42-2在0.2μM和0.5μM镉胁迫条件下，地上部分和根系的镉含量均显著下降，表明OsABCG42正调控水稻的镉积累。

考察OsABCG42敲除株系主要农艺性状：将osabcg42-1、osabcg42-2和野生型对照华占种植于镉污染大田发现，与野生型对照华占相比，osabcg42-1、osabcg42-2的株高、单株有效穗、每穗粒数、结实率和千粒重均无显著变化，详见表1。

表1 OsABCG42基因敲除株系的主要农艺性状

株系	株高(cm)	单株有效穗	每穗总粒数	结实率(％)	千粒重(g)
						WT	102.8±0.8	24.8±1.5	162.6±13.3	88.3±1.3	19.5±0.7
osabcg42-1	102.1±1.7	23.8±2.8	158.2±3.9	85.5±3.8	19.2±0.7
						osabcg42-2	104.2±1.4	25.8±4.2	167.7±5.8	87.3±1.7	19.0±0.8

检测OsABCG42敲除株系糙米镉的含量：采用ICP-MAS检测糙米镉含量，结果见图3，osabcg42-1、osabcg42-2的糙米镉含量较野生型对照均显著降低，表明敲除OsABCG42基因可降低稻米的镉含量且对主要农艺性状无显著影响，OsABCG42正调控稻米镉含量。

实施例4：酵母异源表达鉴定OsABCG42基因的镉转运活性

构建OsABCG42基因的酵母表达载体pYES2-OsABCG42，并将此载体转化到镉敏感型酿酒酵母菌株Δycf中。简述如下：

(1)以水稻cDNA为模板，用高保真Taq酶PCR扩增OsABCG42的CDS，扩增引物为YES-ABCG42-F和YES-ABCG42-R。

YES-ABCG42-F：ggatccagtgtggtggaattcATGATACTGGGATTGGATATATGCG(如SEQ IDNO：11所示)；

YES-ABCG42-R：accttcgaagggccctctagaCTATCGATGTTGGAAGTTCAACTTCT(如SEQ IDNO：12所示)。

(2)电泳，胶回收OsABCG42的CDS片段，用EcoR I和Xba I双酶切酵母表达载体pYES2，使载体线性化，将线性化的pYES2和OsABCG42的CDS片段用重组克隆法进行连接(Vazyme公司的

II重组克隆试剂盒，产品目录号C112)，转化大肠杆菌，经菌落PCR扩增、测序验证，获得重组载体pYES2-OsABCG42。

(3)将重组载体pYES2-OsABCG42和空载体pYES2用醋酸锂转化法转化镉敏感型酵母菌株Δycf，以转化pYES2空载体的Δycf酵母菌株为对照，在添加半乳糖以及0、20、30μM镉的酵母诱导固体培养基上30℃培养浓度梯度稀释的酵母转化子，3d后观察菌斑长势并拍照。

结果如图4所示，无镉胁迫条件下，表达OsABCG42的酵母和转化空载体的酵母长势一致；而在20、30μM镉胁迫下，与转化空载体的酵母相比，表达OsABCG42的酵母生长受到严重抑制，表明在酵母中表达OsABCG42基因使其对镉胁迫更加敏感。

(4)将转化重组载体pYES2-OsABCG42和空载体pYES2的酵母转化子在以葡萄糖为碳源的酵母液体培养基上培养至对数生长期，无菌水洗涤3次，调节OD₆₀₀到0.6，取5μL加入到以半乳糖为碳源且添加0μM镉或5μM镉的酵母液体培养基50mL中，30℃，200rpm振荡培养0h、3h、6h、9h、12h、24h、36h，分别测OD₆₀₀值。

结果如图5所示，表达OsABCG42的酵母转化子在无镉胁迫时，OD₆₀₀值略低于转化空载体pYES2的酵母转化子，而在5uM Cd胁迫条件下，OD₆₀₀值明显低于空载体pYES2的酵母转化子。

总的来说，本发明利用基因编辑获得水稻OsABCG42敲除株系，通过苗期水培实验、镉污染大田实验发现，敲除OsABCG42使水稻植株根系、秸秆和糙米的镉含量均显著下降，且对主要农艺性状无显著影响，表明OsABCG42正调控水稻镉积累。酵母异源表达OsABCG42鉴定发现，与转空载体的酵母对照相比，表达OsABCG42的酵母对Cd胁迫更敏感。

基于本发明提供的OsABCG42基因，通过基因编辑、EMS诱变、辐射诱变、航天搭载、分子标记辅助育种等技术，均可改良现有水稻的镉积累特性，培育和创制稻米镉含量低的中间材料和水稻品种，操作简单，改良和培育新品种的周期短，且不影响主要农艺性状。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 调控稻米镉积累的基因OsABCG42及其编码蛋白与应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3504

<212> DNA

<213> 水稻(rice)

<400> 1

atgatactgg gattggatat atgcgcggac acgatcgtcg gcgaccagat gcagaggggg 60

atctccggtg gtcagaagaa acgcgtcacc accggtgaga tgattgtcgg tccaacaaag 120

gttctattca tggatgagat atcaactgga ttggacagct ccaccacatt ccagattgtc 180

aaatgccttc agcaaatcgt gcacttgggc gaggcaacca tcctcatgtc actcctacaa 240

ccagcccctg agacttttga gctattcgat gacattatcc tactgtcaga aggccagatt 300

gtttatcagg gaccccgcga atacgtcctt gagttctttg agtcatgcgg attccgctgc 360

ccagagcgta agggtactgc agactttctt caggaggtga catcaaagaa ggatcaggag 420

cagtattggg ccgacaagca taggccatac agatacattt cagtctcaga atttgcacag 480

agatttaaaa ggttccatgt tgggctccaa cttgagaatc atctctcagt cccatttgat 540

aaaactcgta gccatcaggc tgctcttgtc ttctcgaagc aatcggtgtc aacaacagag 600

ctcctcaagg catcctttgc caaggagtgg ctcctcatta agcgcaactc atttgtgtac 660

atcttcaaga ccatacagct catcattgta gcccttgtcg cgtcgacagt gtttcttagg 720

acccagatgc acacaaggaa tttagatgat ggctttgtgt acattggagc actacttttc 780

agtctgattg tgaacatgtt caatggtttc gctgagctct ctttgaccat cacaaggttg 840

ccagtgttct tcaagcaccg ggacctcctc ttctaccctg cttggatctt cactctaccg 900

aatgttattc tgagaatccc attttccatc atcgaatcta tagtctgggt gattgttaca 960

tactacacta taggatttgc cccagaggct gacagatttt tcaagcagtt gctgctagtg 1020

ttcttgatcc agcagatggc aggtggcctt ttcagagcaa ctgctggtct gtgcagatcc 1080

atgatcattg ctcaaactgg aggagccctg gcccttctca tatttttcgt tcttggagga 1140

tttcttctgc caaaagcatt catcccaaaa tggtggatct ggggttactg ggtttcacca 1200

ctgatgtacg ggtataatgc tctagcagtc aatgaattct actctcctcg gtggatgaac 1260

aagtttgtac tggataacaa tggcgttcct aaaagactag gaatagctct gatggaaggt 1320

gccaacatct tcactgacaa aaattggttc tggattggag cagcagggct cctgggtttc 1380

accatgtttt tcaatgtgct tttcactctg tcactcgttt atctgaatcc tctgggcaaa 1440

ccacaagctg tcatatctga agaaactgcg aaggaagcgg aaggcaatgg ggatgcaaga 1500

catacagtaa gaaatggcag cacaaaatca aatggtggaa atcacaaaga aatgagggag 1560

atgagattga gtgctcgtct gagcaatagt tcatcgaatg gagtttcacg actgatgtcc 1620

attggtagca atgaagctgg tccaagaaga ggaatggttc ttccatttac tcctctatcc 1680

atgtcttttg atgatgtgaa ctactatgtc gacatgcctg cagaaatgaa gcagcaagga 1740

gtggtggatg ataggctcca attgttacgt gacgttactg gatcatttag gcctgcagtg 1800

ctgacagcac tcatgggagt cagtggagcc ggaaagacaa ctcttatgga tgttttggca 1860

ggaagaaaga ctggtggtta cattgaagga gatatgagaa tttctggtta tcctaagaac 1920

caagaaacat ttgcaagaat ttctggctac tgtgagcaaa acgatatcca ttcacctcag 1980

gtcacagtta gggagtcttt gatatactct gctttcctgc gccttccaga aaaaatagga 2040

gatcaagaaa tcactgatga tatcaagatt caatttgttg atgaagttat ggaactagtg 2100

gagctcgaca atctgaagga tgcgttagtt ggcctgcctg gaatcacagg gctttcaaca 2160

gagcaaagga agagattgac aatagcagtg gagcttgttg caaatccctc gatcatcttc 2220

atggatgaac cgacttcagg tcttgatgca agagcagcag ccattgttat gagaacagtg 2280

aggaacacag ttgacactgg acggacagtg gtttgcacaa ttcaccagcc aagcattgac 2340

atatttgagg cttttgatga gctgctacta ctgaaaagag gagggcaggt gatatactct 2400

gggcaattgg gtcgtaattc ccagaaaatg attgaatatt tcgaggcaat tcctggtgtg 2460

cctaaaatca aagataagta caatccagct acatggatgc ttgaggtcag ttcagttgct 2520

gcggaagtac gcttaaatat ggactttgct gagtactata agacatcaga cctgtacaag 2580

caaaacaagg tattggtgaa tcagctaagt caaccagagc caggaacatc agatctgcat 2640

tttcctacaa aatactctca atccaccata gggcaattta gggcctgcct ctggaagcaa 2700

tggctgacct attggcgcag cccagattac aatcttgtta gattttcctt cactctgttc 2760

acagccttgc tactcggcac catcttttgg aagatcggca ccaagatggg aaatgccaat 2820

tctcttagaa tggtcattgg agcaatgtat acagcagtga tgtttatcgg tatcaacaat 2880

tgtgcgactg tgcagccaat cgtgtcgatt gagagaacag ttttctaccg agagagggct 2940

gctgggatgt actctgctat gccctatgcc attgctcagg ttgtcatgga gataccctat 3000

gtgttcgtcc aaactgcata ttataccctc attgtttatg ccatgatgag cttccagtgg 3060

acagcagcca agttcttctg gttcttcttc gtctcctact tctcatttct ctacttcacc 3120

tactatggta tgatgacggt ggcaatctca ccaaaccatg aggttgcagc catctttgcc 3180

gcggcgttct attccttgtt caacctattc tcaggattct tcattccgag accaaggatt 3240

cccaaatggt ggatctggta ctactggctt tgcccattgg catggacagt gtatgggctc 3300

atagtgacac agtatggaga cctagaacaa atcatctcag tccctggcca atccaaccag 3360

acaatcagct actatgttac tcatcatttt ggatatcaca ggaaatttat gccagttgtt 3420

gcgccggtgc tcgtgctctt cgctgtgttt ttcgcgttca tgtatgccat ttgcatcaag 3480

aagttgaact tccaacatcg atag 3504

<210> 2

<211> 1167

<212> PRT

<213> 水稻(rice)

<400> 2

Met Ile Leu Gly Leu Asp Ile Cys Ala Asp Thr Ile Val Gly Asp Gln

1 5 10 15

Met Gln Arg Gly Ile Ser Gly Gly Gln Lys Lys Arg Val Thr Thr Gly

20 25 30

Glu Met Ile Val Gly Pro Thr Lys Val Leu Phe Met Asp Glu Ile Ser

35 40 45

Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Thr Phe Gln Ile Val Lys Cys Leu Gln

50 55 60

Gln Ile Val His Leu Gly Glu Ala Thr Ile Leu Met Ser Leu Leu Gln

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Thr Phe Glu Leu Phe Asp Asp Ile Ile Leu Leu Ser

85 90 95

Glu Gly Gln Ile Val Tyr Gln Gly Pro Arg Glu Tyr Val Leu Glu Phe

100 105 110

Phe Glu Ser Cys Gly Phe Arg Cys Pro Glu Arg Lys Gly Thr Ala Asp

115 120 125

Phe Leu Gln Glu Val Thr Ser Lys Lys Asp Gln Glu Gln Tyr Trp Ala

130 135 140

Asp Lys His Arg Pro Tyr Arg Tyr Ile Ser Val Ser Glu Phe Ala Gln

145 150 155 160

Arg Phe Lys Arg Phe His Val Gly Leu Gln Leu Glu Asn His Leu Ser

165 170 175

Val Pro Phe Asp Lys Thr Arg Ser His Gln Ala Ala Leu Val Phe Ser

180 185 190

Lys Gln Ser Val Ser Thr Thr Glu Leu Leu Lys Ala Ser Phe Ala Lys

195 200 205

Glu Trp Leu Leu Ile Lys Arg Asn Ser Phe Val Tyr Ile Phe Lys Thr

210 215 220

Ile Gln Leu Ile Ile Val Ala Leu Val Ala Ser Thr Val Phe Leu Arg

225 230 235 240

Thr Gln Met His Thr Arg Asn Leu Asp Asp Gly Phe Val Tyr Ile Gly

245 250 255

Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ile Val Asn Met Phe Asn Gly Phe Ala Glu

260 265 270

Leu Ser Leu Thr Ile Thr Arg Leu Pro Val Phe Phe Lys His Arg Asp

275 280 285

Leu Leu Phe Tyr Pro Ala Trp Ile Phe Thr Leu Pro Asn Val Ile Leu

290 295 300

Arg Ile Pro Phe Ser Ile Ile Glu Ser Ile Val Trp Val Ile Val Thr

305 310 315 320

Tyr Tyr Thr Ile Gly Phe Ala Pro Glu Ala Asp Arg Phe Phe Lys Gln

325 330 335

Leu Leu Leu Val Phe Leu Ile Gln Gln Met Ala Gly Gly Leu Phe Arg

340 345 350

Ala Thr Ala Gly Leu Cys Arg Ser Met Ile Ile Ala Gln Thr Gly Gly

355 360 365

Ala Leu Ala Leu Leu Ile Phe Phe Val Leu Gly Gly Phe Leu Leu Pro

370 375 380

Lys Ala Phe Ile Pro Lys Trp Trp Ile Trp Gly Tyr Trp Val Ser Pro

385 390 395 400

Leu Met Tyr Gly Tyr Asn Ala Leu Ala Val Asn Glu Phe Tyr Ser Pro

405 410 415

Arg Trp Met Asn Lys Phe Val Leu Asp Asn Asn Gly Val Pro Lys Arg

420 425 430

Leu Gly Ile Ala Leu Met Glu Gly Ala Asn Ile Phe Thr Asp Lys Asn

435 440 445

Trp Phe Trp Ile Gly Ala Ala Gly Leu Leu Gly Phe Thr Met Phe Phe

450 455 460

Asn Val Leu Phe Thr Leu Ser Leu Val Tyr Leu Asn Pro Leu Gly Lys

465 470 475 480

Pro Gln Ala Val Ile Ser Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ala Glu Gly Asn

485 490 495

Gly Asp Ala Arg His Thr Val Arg Asn Gly Ser Thr Lys Ser Asn Gly

500 505 510

Gly Asn His Lys Glu Met Arg Glu Met Arg Leu Ser Ala Arg Leu Ser

515 520 525

Asn Ser Ser Ser Asn Gly Val Ser Arg Leu Met Ser Ile Gly Ser Asn

530 535 540

Glu Ala Gly Pro Arg Arg Gly Met Val Leu Pro Phe Thr Pro Leu Ser

545 550 555 560

Met Ser Phe Asp Asp Val Asn Tyr Tyr Val Asp Met Pro Ala Glu Met

565 570 575

Lys Gln Gln Gly Val Val Asp Asp Arg Leu Gln Leu Leu Arg Asp Val

580 585 590

Thr Gly Ser Phe Arg Pro Ala Val Leu Thr Ala Leu Met Gly Val Ser

595 600 605

Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Met Asp Val Leu Ala Gly Arg Lys Thr

610 615 620

Gly Gly Tyr Ile Glu Gly Asp Met Arg Ile Ser Gly Tyr Pro Lys Asn

625 630 635 640

Gln Glu Thr Phe Ala Arg Ile Ser Gly Tyr Cys Glu Gln Asn Asp Ile

645 650 655

His Ser Pro Gln Val Thr Val Arg Glu Ser Leu Ile Tyr Ser Ala Phe

660 665 670

Leu Arg Leu Pro Glu Lys Ile Gly Asp Gln Glu Ile Thr Asp Asp Ile

675 680 685

Lys Ile Gln Phe Val Asp Glu Val Met Glu Leu Val Glu Leu Asp Asn

690 695 700

Leu Lys Asp Ala Leu Val Gly Leu Pro Gly Ile Thr Gly Leu Ser Thr

705 710 715 720

Glu Gln Arg Lys Arg Leu Thr Ile Ala Val Glu Leu Val Ala Asn Pro

725 730 735

Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Pro Thr Ser Gly Leu Asp Ala Arg Ala

740 745 750

Ala Ala Ile Val Met Arg Thr Val Arg Asn Thr Val Asp Thr Gly Arg

755 760 765

Thr Val Val Cys Thr Ile His Gln Pro Ser Ile Asp Ile Phe Glu Ala

770 775 780

Phe Asp Glu Leu Leu Leu Leu Lys Arg Gly Gly Gln Val Ile Tyr Ser

785 790 795 800

Gly Gln Leu Gly Arg Asn Ser Gln Lys Met Ile Glu Tyr Phe Glu Ala

805 810 815

Ile Pro Gly Val Pro Lys Ile Lys Asp Lys Tyr Asn Pro Ala Thr Trp

820 825 830

Met Leu Glu Val Ser Ser Val Ala Ala Glu Val Arg Leu Asn Met Asp

835 840 845

Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr Ser Asp Leu Tyr Lys Gln Asn Lys Val

850 855 860

Leu Val Asn Gln Leu Ser Gln Pro Glu Pro Gly Thr Ser Asp Leu His

865 870 875 880

Phe Pro Thr Lys Tyr Ser Gln Ser Thr Ile Gly Gln Phe Arg Ala Cys

885 890 895

Leu Trp Lys Gln Trp Leu Thr Tyr Trp Arg Ser Pro Asp Tyr Asn Leu

900 905 910

Val Arg Phe Ser Phe Thr Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu Gly Thr Ile

915 920 925

Phe Trp Lys Ile Gly Thr Lys Met Gly Asn Ala Asn Ser Leu Arg Met

930 935 940

Val Ile Gly Ala Met Tyr Thr Ala Val Met Phe Ile Gly Ile Asn Asn

945 950 955 960

Cys Ala Thr Val Gln Pro Ile Val Ser Ile Glu Arg Thr Val Phe Tyr

965 970 975

Arg Glu Arg Ala Ala Gly Met Tyr Ser Ala Met Pro Tyr Ala Ile Ala

980 985 990

Gln Val Val Met Glu Ile Pro Tyr Val Phe Val Gln Thr Ala Tyr Tyr

995 1000 1005

Thr Leu Ile Val Tyr Ala Met Met Ser Phe Gln Trp Thr Ala Ala Lys

1010 1015 1020

Phe Phe Trp Phe Phe Phe Val Ser Tyr Phe Ser Phe Leu Tyr Phe Thr

1025 1030 1035 1040

Tyr Tyr Gly Met Met Thr Val Ala Ile Ser Pro Asn His Glu Val Ala

1045 1050 1055

Ala Ile Phe Ala Ala Ala Phe Tyr Ser Leu Phe Asn Leu Phe Ser Gly

1060 1065 1070

Phe Phe Ile Pro Arg Pro Arg Ile Pro Lys Trp Trp Ile Trp Tyr Tyr

1075 1080 1085

Trp Leu Cys Pro Leu Ala Trp Thr Val Tyr Gly Leu Ile Val Thr Gln

1090 1095 1100

Tyr Gly Asp Leu Glu Gln Ile Ile Ser Val Pro Gly Gln Ser Asn Gln

1105 1110 1115 1120

Thr Ile Ser Tyr Tyr Val Thr His His Phe Gly Tyr His Arg Lys Phe

1125 1130 1135

Met Pro Val Val Ala Pro Val Leu Val Leu Phe Ala Val Phe Phe Ala

1140 1145 1150

Phe Met Tyr Ala Ile Cys Ile Lys Lys Leu Asn Phe Gln His Arg

1155 1160 1165

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaagtgcac gatttgctga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaactcaagg acgtattcgc 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcaccaagt gcacgatttg ctga 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaactcagca aatcgtgcac ttgg 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccgaactca aggacgtatt cgc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacgcgaat acgtccttga gtt 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcacgtttcc actcccgata 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgccttgagg agctctgttg 20

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggatccagtg tggtggaatt catgatactg ggattggata tatgcg 46

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accttcgaag ggccctctag actatcgatg ttggaagttc aacttct 47

Claims

1.一种调控稻米镉积累的基因OsABCG42在改良水稻镉积累特性或培育镉低积累水稻品种中的应用，其特征在于，所述基因OsABCG42的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因OsABCG42的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过突变所述基因OsABCG42使其编码蛋白的活性下调或失活，或抑制所述基因OsABCG42表达使其编码蛋白的丰度下调，进而改良水稻的镉积累特性或培育出稻米镉含量下降的镉低积累水稻品种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，突变所述基因OsABCG42或抑制所述基因OsABCG42表达所采用的方式包括基因编辑、EMS诱变、辐射诱变、航天搭载。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因编辑为：利用CRISPR/Cas9、TALEN敲除所述基因OsABCG42，或利用CRISPR/Cas9、TALEN编辑其启动子以抑制其表达。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述利用CRISPR/Cas9敲除所述基因OsABCG42的具体方法为：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶序列包括：如SEQ ID NO：3所示的DNA序列，或如SEQ ID NO：4所示的DNA序列。